Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

التدفق الخلوي بروتوكولات لالسطحية وبين الخلايا مستضد تحليلات العصبية أنواع الخلايا

Published: December 18, 2014 doi: 10.3791/52241

Introduction

التدفق الخلوي تم استغلاله على نطاق واسع في علم المناعة، أمراض الدم والأورام لتعريف السكان الخلية عن طريق الخصائص الذاتية مبعثر، سطح الخلية مستضد التعبير، والمعلمات مضان أخرى 1-3. لدينا رؤى في التنمية نسب الدم والمرض نتيجة لذلك إلى درجة كبيرة من التحسين المتواصل لهذه المنهجية بعد 4،5 التنفيذ الأولي. زيادة الوعي بإمكانيات التحليلية الكمية والشاملة للالتدفق الخلوي وشجعت في الآونة الأخيرة استخدام أكثر على نطاق واسع في أبحاث الخلايا الجذعية وربما تمكن من التقدم عميق مشابه في إطار زمني أقصر 6. ومع ذلك، منذ فترة طويلة ينظر إلى تطبيق التدفق الخلوي لتحليل تحديدا وعزل السكان العصبي كما تحديا. وعلى النقيض من الخلايا المكونة للدم التي توجد بشكل طبيعي في التعليق، وعادة ما تحصد أنواع الخلايا العصبية من مصادر معقدة بشكل مفرط التي قد تشمل الدبقية ومختلف سذر الخلايا المحيطة فضلا عن شبكة معقدة من الخلايا العصبية الحاملة للعملية. ونتيجة لذلك، بيولوجيا الأعصاب لم يتم بعد تنفيذ براعة التدفق الخلوي إلى إمكانية كاملة في الروتين الأبحاث اليومية. ومع ذلك، ما دام يمكن أن تتولد تعليق خلية واحدة قابلة للحياة (ووقد وضعت بروتوكولات والأمثل لهذا الغرض 7)، التدفق الخلوي ومضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) يمكن اعتباره عنصرا قيما للذخيرة التحليلية في علم الأعصاب 8-11.

الشكل (1)
تشمل الشكل 1. مبدأ تحليل تدفق cytometric ومكونات تدفق عداد الكريات تدفق cytometers ثلاثة أنظمة رئيسية: FLUIDICS، والبصريات والإلكترونيات. وتدفق انسيابي من الخلايا في تعليق (المعد من الأنسجة الابتدائية أو في الثقافة المختبر) والذي أنجزه flui غمدد عبر الهيدروديناميكية التركيز، وتقييد عينة لالأساسية وسطها. وتتكون الأجزاء البصرية من الليزر التي تضيء تيار الخلايا والمرشحات الضوئية التي توجه إشارة إلى كشف المناسبة. الإشارات الضوئية وتحويلها إلى إشارات إلكترونية، ومعالجتها في وقت لاحق من قبل الحاسوب وتصور على شاشة لتحليل البيانات والنابضة الكشف عنها. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مستخدمي تدفق cytometric أساليب الربح من على الأقل فهم أساسي من أساسيات الأساسية بما في ذلك كتل بناء على عداد الكريات (على مراجعة نرى 12،13؛ وكذلك انظر الشكل 1). شعاع ليزر يتقاطع مع تيار فلويديك تركز hydrodynamically الذي يحتوي على الخلايا في تعليق، والتي بدورها تمر عبر شعاع ليزر في "ملف واحد" واحدا تلو الآخر. وinterceptiعلى خلية (أو أي جسيم آخر، لهذه المسألة) مع نتائج الليزر في تشتيت الضوء من هذه النقطة الاستجواب. يمكن الكشف عن الضوء المتناثرة في استمرار للاتجاه ليزر (مبعثر إلى الأمام، ويرتبط مع حجم الجسيمات)، وكذلك عمودي على اتجاهه (الجانب مبعثر، مما يعكس كتلة تحببية من الجسيمات / خلية). هذه الخصائص المذكورة آنفا مبعثر لا تتطلب وضع العلامات معين، وهذا هو السبب عينة غير المسماة (أو كما البقايا الخلوية، وفقاعات الهواء، وغيرها) سوف تولد إشارة (الحدث) على مبعثر إلى الأمام ذات المتغيرين مقابل الجانب مؤامرة مبعثر تستخدم عادة لالنابضة الأولي. باستخدام أشعة الليزر والمرشحات محددة لالمقابلة الإثارة وانبعاث أطياف المناسبة، يمكن تحليل زنزانة لمدة الإيجابية لها، ومستوى شدة، أو عدم وجود علامات الفلورسنت. وقد ركزت معظم التطبيقات تدفق cytometric على توصيف عبر مستضدات سطح الخلية. وخلافا للlineag المكونة للدمالبريد، ظلت النسب العصبي تعريف أقل على نطاق واسع وفقا لأنماط سطح حاتمة التعبير 5. ميزة واحدة من استغلال المستضدات السطحية هي أن الخلايا الحية يمكن أن يتعرض إلى الخلية فرز نماذج مثل FACS. في المقابل، الخلايا مستضد تلطيخ يتطلب تثبيت وpermeabilization خطوات للتوسط في التفاعل حاتمة الأجسام المضادة، مما يحول دون التطبيقات المصب التي تتطلب خلايا قابلة للحياة. وتجدر الإشارة أن هذه النهج لا تزال تسمح للعديد من المقايسات الكمية 14 وكذلك التحليلات المصب لRNA والبروتين التعبير 15. أمراض الدم والمناعة والأورام غالبا ما تستخدم أكثر من اثني عشر علامات بالتزامن معينة لتحديد المجموعات السكانية الفرعية 16. بالإضافة إلى ذلك، الخلوي كتلة أو CyTOF ويمكن الآن أن تستخدم لتحليل ما يصل إلى 30 في وقت واحد المعلمات 17،18.

لتطبيقات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك الثقافات الأولية 14،19،20 عدم تجانس الخلايا فيالمختبر هو ظاهرة شائعة 21-23. الخلايا لا يمثلون السكان المستهدفين من الفائدة تجسد عاملا يحتمل الخلط لقراءات تجريبية 24،25. مريح، ومجموعات فرعية الخلوية المختلفة الحالية داخل الخلية تعليق غير متجانسة تتحمل متميزة (المعروف أو لم يتم بعد فك رموز) لمحات مستضد التعبير، والتي يمكن استخدامها لتحديد هؤلاء السكان المختلفة. التدفق الخلوي يمكن بالتالي تلعب دورا حاسما في حل عدم التجانس الخلوية، وبالتالي، وتسهيل التطبيقات الطبية الحيوية (في المختبر المقايسات، العلاج بالخلايا) وتحسين قراءات الكمية من خلال التركيز على مجموعة فرعية الأكثر صلة 24،26. وقد تم تحديد مختلف مجموعات المستضد السطحي على مدى السنوات القليلة الماضية للسماح للالكميات وعزل أنواع معينة الخلايا العصبية. وهذا يشمل CD133 لإثراء الخلايا الجذعية العصبية 27، وهو مزيج من CD15 / CD24 / CD29 المستضدات السطحية لعزل مجلس الأمن القومي، فارقتيد الخلايا العصبية والخلايا العصبية قمة 28 أو CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 لعزل العصبية ومجموعات فرعية الدبقية 25، بين التوقيعات أخرى 29،30. ما وراء الخلايا العصبية، وتشمل علامات الدبقية A2B5 31، CD44 25، NG2 32 و 33 GLAST. لقد استغلت ونشر مؤخرا في الدماغ المتوسط ​​floorplate السلائف علامة CORIN 34،35 لإثراء لالسلائف الدوبامين في زرع الخلايا باركنسون نماذج 36. جزيئات CD ليست علامات فقط، ولكن الوسطاء ذات الصلة وظيفيا من التفاعلات خلية خلية وقدرة الخلية على الاستجابة للمنبهات من جزيئات المصفوفة خارج الخلية وعوامل النمو 37. واحد استراتيجية زيادة تعزيز ترسانة من مستضدات CD اندماجي لتوصيف تنمية النسب العصبية هي استخدام علامات داخل الخلايا المعروفة للكشف عن وتحديد مجموعات مستضد CD لنوع معين من الخلايا الفائدة. لقد استغلت مؤخرا مثل هذا النهج وحددت CD49F - / CD200 عالية أنماط التعبير اندماجي كما نهجا جديدا لتخصيب مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة العصبي المحفزة أنظمة زراعة الخلايا الجذعية 38. هنا، نحن وتشمل ومناقشة البروتوكول الأخير (والاختلافات اختياري منها) التي تلطيخ السطح وتلطيخ الخلايا يمكن استخدامها في وقت واحد لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا العصبية عن طريق التدفق الخلوي.

الشكل 2
الشكل 2. مخطط تدفق من الخيارات بروتوكول التجريبية. يصور هذا الرقم التمثيل التخطيطي من الخطوات الرئيسية المشاركة في البروتوكول. يشار إلى الخطوات الاختيارية (صبغ CFSE أو وضع العلامات مستضد الخلايا) من قبل صناديق رمادي فاتح. بعد الحصاد، فمن الضروري لتقييم جدوى وخلية عدد من الايقاف الخلية العصبية قبل تلطيخ سطح الخلية. بالايجابيكذلك تحتاج ضوابط السلبية ليتم تضمينها بالإضافة إلى عينات من الفائدة. ويمكن تحليل عينات عن طريق تحليل تدفق cytometric و / أو استخدامها في الخلية فرز النماذج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولئن كنا قد استخدمت سابقا الأجسام المضادة الأولية في تركيبة مع الأجسام المضادة الثانوية لتلطيخ الخلايا 38، ونحن الآن إدخال العلامات غير التساهمية من الأجسام المضادة الأولية عبر شظايا فاب فلوري (وضع العلامات زينون) باعتباره اختلاف طفيف، مما يقلل من الخطوات من التلاعب خلية 39. وعلاوة على ذلك، كمثال آخر على براعة البروتوكول، ونحن توظيف ووضع العلامات اختياري من المجموعة الثانوية التجريبية واحدا تلو carboxyfluorescein استر succinimidyl (CFSE) قبل سطح المستضد تلطيخ. هذا CFSE قبل وضع العلامات يمكن المقارنة الفورية المباشرة اثنين من خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية (CFSE المسمى مقابل. ليس لها علامة) داخل أنبوب عينة واحدة، والحد من التباين أو الفروق الدقيقة في فترة حضانة وتوفير الأجسام المضادة. CFSE هو صبغة الفلورسنت الراسخة التي يشيع استخدامها لتتبع خلية 40، في انتشار 41،42 والمتوازية التجارب 43،44. وأخيرا، في حين أن الخطوات الفعلية الفرز (FACS، فصل الخلية immunomagnetic أو immunopanning) ليست جزءا من هذا البروتوكول، من حيث المبدأ، وإجراءات الحصاد ووضع العلامات الموضحة هنا تفعل عينات العائد الذي يمكن أن يتعرض إلى السطح antigen- أو داخل الخلايا التطبيقات الفرز القائم على الوسم 15 25،28.

لهذه المادة، ونحن نهدف إلى: تلخيص سطح قابل للتطبيق بروتوكول مستضد تلطيخ 25،28، تلخيص بروتوكول للكشف عن الأهداف داخل الخلايا وكذلك سطح مجتمعة وتحليل مستضد الخلايا 38، تهيئ داخل الخلايا CFSE وضع العلامات صبغ خطوة 41،45 بوصفه الخيار التجريبي لكومparative يحلل للسكان الخلية العصبية، وتلخيص مناهج تحليل تدفق cytometric (الضوابط المناسبة 13،46، النابضة استراتيجية والبيانات العرض التقديمي 47).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. العصبية حصاد خلية

  1. التقييم من قبل المجهر:
    1. قبل الشروع في التجربة، تحقق من حالة من الثقافة مع مشرق الميدان أو النقيض من المرحلة المجهري.
      ملاحظة: على الرغم من الأنسجة العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من تشريح هي، من حيث المبدأ، قابلة أيضا على تحليل تدفق cytometric 14،28، يرجى ملاحظة أن التركيز البروتوكول هو على الخلايا التي تم الحصول عليها من في المختبر نظم خلايا العصبية.
  2. حصاد الخلايا 7:
    1. غسل بلطف الطبق / قارورة من الخلايا الملتصقة مع المغنيسيوم 2+ / CA 2+ مجانا الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في RT (على سبيل المثال، 5 مل لT75 قارورة، 3 مل لكل بئر لوحة 6 جيدا، أو 10 مل ل 10 سم طبق).
      ملاحظة: PBS المستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول هو المغنيسيوم 2+ / CA 2+ مجانا.
      1. للمثال الفيديو، واستخدام قارورة T75 الخلايا العصبية SH-SY5Y في 80٪ confluency. تطبيق خطوات غسل إضافية في الحالات التي يكون فيهاالحطام كبير موجود في الطبق.
      2. النظر يغسل مع المصل PBS 48 التي تحتوي على الزلال، Percoll، أو Ficoll 49 التدرجات الطرد المركزي و / أو الخرز المتاحة تجاريا 50،51. إزالة المايلين والدهون أو غيرها من الملوثات الأخرى أمر بالغ الأهمية، خاصة عندما تستخدم مصادر الأنسجة الابتدائية الكبار.
    2. إضافة قبل تحسنت (37 ° C) استبدال التربسين في حجم مناسب التي تغطي كامل سطح السفينة زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، والنظر في Accutase أو غيرها من الخيارات الهضم الأنزيمية. هذه خطوة حاسمة قد تؤثر سلبا على سطح حاتمة التعبير (انظر 7).
    3. احتضان الطبق / قارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة (اعتمادا على نوع من الخلايا) للسماح للخلايا لفصل. اضغط برفق السفينة زراعة الأنسجة أو الاحمرار مع الماصة المصلية لإزاحة الخلايا. تجنب الإفراط في الهضم (وهذا يمكن أن يسبب فقدان الخلية وتخثر في خطوات لاحقة).
    4. Quench استبدال التربسين بإضافة ضعف حجم تدفق العازلة (2٪ FBS في PBS) وجمع الخلايا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    5. يسحن بلطف تعليق الخلية باستخدام الماصة ميكروليتر (100 - 1،000 ميكرولتر) أو الماصة 5 مل المصلية لإعداد تعليق خلية واحدة.
    6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 220 x ج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. نضح بعناية طاف ترك بيليه وراء.
    7. اعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من تدفق العازلة، اعتمادا على حجم الكرية (على سبيل المثال، لأحد متكدسة T75 قارورة من الخلايا SH-SY5Y العائد النموذجي هو لا يقل عن 10 × 10 6 خلايا، وفي هذه الحالة الخلايا ومعلق في 5 مل من تدفق العازلة).
      ملاحظة: إذا لوحظ قطع أكبر أو تخثر، تصفية من خلال 30-100 شبكة ميكرومتر.
  3. عد الخلايا 52:
    1. نقل قسامة صغيرة من تعليق خلية إلى أنبوب microcentrifuge وتمييع على نسبة محددة في حجم TRypan الأزرق أو صبغة الجدوى بديل قبل نقلها إلى عدادة الكريات أو النظام الآلي العد الخلية.
    2. تمييع تعليق خلية إلى تركيز من 1 × 10 6 قابلة للحياة خلية / مل عن طريق إضافة حجم مناسب من تدفق العازلة أو برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA (إذا كان الشروع في وضع العلامات CFSE).
      ملاحظة: يوديد propidium، D 7-aminoactinomycin، annexin V ويمكن حلها مجموعات جدوى فحص المتاحة تجاريا تمثل خيارات بديلة من أجل تقييم جدوى من الخلايا. أيضا، المقايسات موت الخلايا المبرمج باستخدام كاسباس 3 مضان كما هو موضح سابقا 53 يمكن استخدامها. سيتم قنوات الفلورسنت "المحتلة" من قبل هذه الكواشف التي قد تحد من الخيارات لخطوات لاحقة إذا شملت في جميع العينات.

2. بين الخلايا صبغ وصفها عن طريق CFSE (الشكل 3)

  1. تمييع CFSE إلى تركيز الأسهم المطلوبة التي يمكن استخدامها بسهولة.
    ملاحظة: للحصول على هذه التجارب تركيز الأسهم منوقد استخدم 0.01 ملي. تحديد تركيز العمل الأمثل للCFSE تجريبيا.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 0.01 ملي CFSE حل لكل مل من الخلايا (القسم 1.3.2، وتركيز 1 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ BSA) لتركيز النهائي من 0.1 ميكرومتر. لفترة وجيزة دوامة لخلط جيدا.
    ملاحظة: تركيزات CFSE المستخدمة هنا هي حوالي عشرة أضعاف أقل من تلك التي تطبق عادة في المقايسات انتشار، وبالتالي الخلية سمية الصبغة هو الحد الأدنى. نحن لا نلاحظ آثار سلبية على بقاء الخلية.
  3. احتضان لمدة 5 دقائق على RT مع الهز المستمر (200 دورة في الدقيقة). يحفظ بعيدا عن الضوء.
  4. إخماد الصبغة بإضافة 5 مجلدات من تدفق العازلة للأنابيب. أجهزة الطرد المركزي في 94 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  5. تجاهل طاف وترك بيليه وراء. إعادة تعليق الخلايا مع 5 مجلدات من تدفق العازلة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 94 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في تدفق العازلة بتركيز 1 × 10 6 خلايا / مل.
  7. إضافة عدد متساو من الخلايا غير ملوثين التي تهم تعليق خلية الملون. انتقل إلى السطح مستضد بروتوكول تلطيخ (القسم 3).

الشكل (3)
الشكل 3. الكشف عن التفاضلي سطح CD مستضد التعبير بين اثنين من خطوط الخلايا عبر CFSE صبغ وضع العلامات. الخلايا SH-SY5Y العصبية هي ما قبل المسمى مع CFSE لتحديد احق بالمقارنة مع الخلايا الليفية BJ غير المسماة. شارك في تلطيخ من العينة المختلطة (لوحات اليمين) مع علامات سطح CD24 CD54 أو (سواء مترافق إلى APC) يدل على أن خطوط الخلايا يمكن تمييزها بسهولة نظرا لتلطيخ CFSE (السهام = SH-SY5Y، النصال = الليفية BJ). غالبية الخلايا SH-SY5Y تعبر عن CD24 CD54 ولكن ليس (ICAM-1). في المقابل، الخلايا الليفية BJ (CFSE سلبية) إيجابية لCD54 لكن سلبي إلى حد كبير عن CD24."https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. خلية تلطيخ السطح

  1. أنابيب التسمية بما في ذلك عينات والضوابط الحرجة (انظر الجدول 1).
أنبوب لا. اسم عينة مستضد fluorophore تخفيف
1 خلايا غير ملوثين -
2 الملون واحد CD24-APC 01:50
3 الملون واحد TUJ1-اليكسا 488nm فلوري 1: 2،000
4 المزدوج الملون CD24-APC 01:50
TUJ1-اليكسا 488nm فلوري 1: 2،000
5 الملون واحد الثانوية فقط: اليكسا 488nm فلوري 1: 2،000

الجدول 1. L الخاصة العراقية من الأنابيب التي ستدرج في تدفق نموذجي الخلوي التجربة. ويبين الجدول مجموعة صغيرة من أنابيب العينات اللازمة لإجراء تجربة شارك في تلطيخ الموضحة في هذه المقالة الفيديو. تحتاج تجربة مثالية لتشمل جميع الضوابط اللازمة (السلبية، الإيجابية وكذلك ضوابط التعويض) عن التفسير الدقيق للنتائج التي تم الحصول عليها.

  1. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية (من القسم 2.7 أو 1.3.2) إلى كل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    ملاحظة: تأكد من وجود حد أدنى من 0.1 × 10 6 خلايا موجودة في 100 ميكرولتر من التعليق الخلية.
  2. إضافة fluorophore مترافق الأجسام المضادة للعينة في التخفيف المناسبة.
    ملاحظة: تحديد تخفيف العمل لكل الأجسام المضادة قبل التجربة. انظر الجدول رقم 2 لقائمة من سو المستضدات السطحية العصبية.
د> [25]
مولد المضاد نوع من الخلايا إشارة
CD15 الخلايا الجذعية العصبية [28، 67]
CD24 الخلايا العصبية [28، 68]
CD29 الخلايا الجذعية العصبية [28، 69، 70]
CD44 الخلايا الدبقية [25]
CD49f الخلايا الجذعية العصبية [38]
CD56 (NCAM) الخلايا العصبية [71]
CD133 الخلايا الجذعية العصبية [27]
CD184 الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الدبقية [25]
CD200 الخلايا العصبية [38]
CD271 الخلايا الجذعية قمة العصبية
A2B5 الخلايا الدبقية [31]
CORIN السلائف الدوبامين [35، 36]
FORSE1 الخلايا الجذعية العصبية (NSC) [72]
GLAST الخلايا الدبقية [33]
NG2 الخلايا الدبقية [32]

الجدول 2. اختيار المستضدات السطحية العصبية. ويوفر هذا الجدول قائمة الحواتم سطح جدت لتكون أعرب عنها مختلف أنواع الخلايا العصبية لتجسيد لوحة المتزايد من المستضدات السطحية المستخدمة لوصف نسب العصبي. لاحظ أن هذا الاختيار هو أبعد ما يكون عن الاكتمال والتي يتم التعبير عنها معظم هذه العلامات أيضا من قبل مجموعة من الخلايا العصبية وغير العصبية الأخرى. ونتيجة لذلك، سوف تكون هناك حاجة مزيج من عدة علامات لتحديد وعزل مجموعات فرعية العصبية وأشار بشكل أفضل.

    الفن = "4">
  1. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري (200 دورة في الدقيقة) في الظلام.
  2. تدفق غسل عازلة
    1. إضافة 1 مل من تدفق العازلة للأنابيب. الطرد المركزي في 380 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل طاف وترك بيليه وراء.
  3. كرر الخطوة غسل مرة أخرى.
  4. بعد غسل الثاني، صب طاف واعادة تعليق الخلايا في تدفق العازلة إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
  5. استخدام عينة للتحليل تدفق cytometric. بدلا من ذلك، المضي قدما في القسم 4 و 5.
    ملاحظة: إذا الخلايا ليتم فرزها وإعادتها إلى ثقافة ما بعد FACS (أي تعليق خلية قابلة للحياة من دون تثبيت أو permeabilization)، وتطبيق تقنيات العقيم خلال موسم الحصاد، وتلطيخ والخطوات التحليلية.

4. التثبيت وPermeabilization 38

  1. تثبيت باستخدام بارافورمالدهيد (PFA):
    1. إعداد عازلة تثبيت تحتوي على 2٪ PFA في برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة التثبيت إلى 100 ميكرولتر من التعليق الخلية.
    3. احتضان الأنابيب في RT لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري (100 دورة في الدقيقة) في الظلام.
  2. PBS غسل:
    1. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب. الطرد المركزي في 380 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل / صب طاف وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنبوب.
  3. Permeabilization مع توين-20:
    1. إعداد العازلة permeabilization تحتوي على توين-20 0.7٪ في برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة permeabilization إلى 100 ميكرولتر من التعليق الخلية.
    3. احتضان الأنابيب في RT لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري (100 دورة في الدقيقة) في الظلام.
  4. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (كما هو موضح في القسم 4.2) وإزالة طاف من شارك الأنابيبmpletely، ولم يتبق سوى بيليه وراء.

5. بين الخلايا مستضد تلطيخ 38 (الشكل 4)

  1. إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية:
    1. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن تخفيف تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري، و 10٪ مصل (على سبيل المثال، حمار أو الماعز العادي المصل) و 0.5٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: اختر المصل لاستخدامها تبعا للأنواع وأثيرت الأجسام المضادة الثانوية في.
    2. بدلا من ذلك، استخدم زينون وضع العلامات فلوريسئين من الأجسام المضادة الأولية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. إعداد 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني في التخفيف المناسبة (الحجم الكلي ≤ 20 ميكرولتر).
      2. إضافة 5 ميكرولتر من فلوريسئين زينون كاشف وضع العلامات مفتش (مكون A) إلى حل الأجسام المضادة.
      3. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT.
      4. إضافة 5 ميكرولتر من زينون حجب كاشف (مكون B) إلى خليط التفاعل.
      5. احتضانالخليط لمدة 5 دقائق على RT. تطبيق الأجسام المضادة للعينة في غضون 30 دقيقة.
  2. الأساسي تلوين الأجسام المضادة:
    1. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لبيليه الخلية ويسحن بلطف لمزج.
    2. بدلا من ذلك، إضافة زينون فلوريسئين المسمى الأجسام المضادة إلى تعليق الخلية في التخفيف المناسب.
    3. احتضان الأنابيب في RT لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري (200 دورة في الدقيقة)، محمية من الضوء. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (كما يصف في القسم 4.2) وإزالة طاف من الأنابيب تماما، ولم يتبق سوى بيليه وراء.
  3. تلطيخ الضد الثانوية (غير مطلوب للأجسام زينون فلوريسئين المسمى):
    1. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني في تركيز المناسب.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية لبيليه الخلية ويسحن بلطف لمزج. احتضان الأنابيب في RT لمدة 30 دقيقة على شاكر (200 دورة في الدقيقة) في الظلام.
  4. غسل العينات مرتين مع PBS (كما هو موضح في القسم 4.2).
  5. يغسل مرة واحدة مع تدفق العازلة (انظر القسم 3.5).
  6. إعادة تعليق الخلايا في ما يقرب من 150 ميكرولتر من تدفق العازلة وتحليل على تدفق عداد الكريات.

الشكل (4)
الشكل 4. المشارك تلطيخ السطح والبروتينات داخل الخلايا. التدفق الخلوي البيانات مثالا مقارنة بين مقرها الأجسام المضادة الأولية + ثانوي مقابل تلطيخ الخلايا استنادا فلوريسئين-زينون في تركيبة مع تلطيخ السطح. الإيجابية حصرية على المحور الصادي (رباعي الأيسر العلوي) ومحور س (الربع السفلي الأيمن) وتظهر الخلايا الملون لMAP2 وCD24، على التوالي. بعد المشاركة في تلطيخ، ويمكن رؤية MAP2 المشتركة وCD24 التعبير في الربع العلوي الأيمن (لوحات اليمين). مقارنة باستخداماليكسا فلور 488. (أعلى، AF488) مقابل زينون فلوريسئين (القاع) لعوائد MAP2 وضع العلامات نتائج مماثلة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تحليل تدفق Cytometric

  1. إجراء تحليل تدفق cytometric على الفور بعد الانتهاء من بروتوكول تلطيخ باستخدام تدفق عداد الكريات مع مرشحات مناسبة للكشف عن إشارة. استخدام 488 نانومتر ليزر أحمر أزرق نانومتر و 640 مع FL-1 (533/30)، FL-2 (585/40)، والمرشحات FL-4 (675/25) ممر الموجة.
  2. إنشاء البوابات الرئيسية على أساس مبعثر إلى الأمام والجانب باستثناء الحطام والخلايا الميتة.
  3. تعيين بوابات مضان للسطح ومستضد الخلايا إلى ≤0.5٪ على أساس العينات غير ملوثين والتعويض عن التداخل الطيفي باستخدام ضوابط الملون واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول المقدمة هنا يسمح للنهج التجريبية تنوعا (الشكل 2). في أقصر نسختها (الخطوات 1 و 3 و 6)، فإنه يمكن أن يعتبر دليلا لتلطيخ بسيط من المستضدات السطحية. في شكله أكثر تعقيدا، وعدد من نماذج التعاون لوضع العلامات مع مجموعة من مستضدات الخلايا يمكن متابعتها (اختياري الخطوات 2 و / أو 4 و 5). وعلاوة على ذلك، فإن الخطوة CFSE وضع العلامات تجسد فائدته لخلايا وضع العلامات / تتبع المجموعات السكانية الفرعية في الدراسات التفاعل خلية خلية أو تدفق التجارب cytometric المتوازية (الخطوة 2). السكان خلية قابلة للحياة (الحصول عليها من الخطوات 2 و / أو 3) قابلة للالخلية نماذج الفرز (FACS) وتحليل المصب بما في ذلك زراعة الخلايا بعد الفرز. من ناحية أخرى، جنبا إلى جنب داخل وسطح المستضد تلطيخ (الخطوات من 3 إلى 5)يوفر فرصا قراءات تحليلية في حد ذاتها. على سبيل المثال، تحديد شارك في توطين بعض المستضدات CD على مجموعات فرعية معينة من السكان الخلية العصبية (التي تطبقها لنا في Turaç وآخرون 38 لتحديد CD49f -. / CD200 التوقيعات عالية لالعصبية FACS). يتم توفير هذه والمثال علامات العصبية الأخرى في الجدول 2، منها CD15، CD29، CD49f وFORSE1، وترتبط في المقام الأول مع الخلايا الجذعية العصبية، وCD24 CD56 وفيرة وعلى الخلايا العصبية. بينما عدد قليل من هذه العلامات هي الحصري، يمكن أن شدة تلطيخ مختلفة، والتحليل متعدد المتغيرات التعبير تساعد على تحديد مجموعات علامة معينة للتحليل وعزل معينة القطعان العصبية.

الرقم 3 مثالا النتائج نموذجية تم الحصول عليها من استخدام اندماجي من الصبغة داخل الخلايا وتلطيخ السطح. وتشير البيانات إلى كيف يمكن بسهولة تمييز اثنين من السكان خلية متميزة طغ مختلطة عينة بسبب وضع العلامات مسبق من واحدة من السكان. هنا، وصفت الخلايا العصبية SH-SY5Y مع CFSE، ومضان المعرض في القناة الخضراء (FL1، المحور ص) أن من الواضح منفصلة عن سكان الثاني غير ملوثين، في هذه الحالة الخلايا الليفية BJ. في حين راسخة الليفية المميزة (CD54) وتظهر العصبية (CD24) علامات (موجودة على السكان المستهدفين كل منهما، FL2 أو مضان FL4، على التوالي؛ محور س) نهج مماثلة يمكن استغلالها للكشف عن مستضدات مجهولة الهوية إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن آثار التفاعلات خلية خلية من اثنين (أو أكثر) القطعان التي وصفت التجارب للمشاركة في الثقافة السابقة يمكن دراستها على هذا النحو.

ويبين الشكل 4 خلايا SH-SY5Y غير ملوثين وكذلك عينات الملون لCD24-APC و / أو داخل الخلايا العصبية مستضد MAP2 (قناة FITC) بعد تثبيت وpermeabilization. وبما أن هذا الأخير يمكن أن تؤثر على خصائص مبعثر، بامضان ckground وحاتمة سطح تلطيخ، والمؤامرات تعمل على توثيق الحفاظ التعبير سطح CD24 العصبي بعد تلطيخ الخلايا. وعلاوة على ذلك، يظهر شارك في توطين الخلايا العصبية تلطيخ MAP2 على جزء-CD24 إيجابي. فمن الأهمية بمكان لضمان الكشف المؤمنين من المستضد السطحي من خلال المقارنة لCD24 التعبير على سطح الخلايا الحية. خصوصية. علاوة على الكشف عن الخلايا على الخلفية، الأجسام المضادة غير محددة ملزمة وتألق ذاتي يحتاج إلى تأكيد. الكشف عن المستضدات داخل الخلايا عبر استراتيجيات قائمة على الأجسام المضادة الثانوية + الأولية استنادا مضان-زينون أو تؤدي إلى نتائج قابلة للمقارنة، والتي توفر الأساس المنطقي للنظر هذا النهج لمرة وكفاءة أكثر (تخطي الخطوة 5.3). في حين أن البروتوكول هو قوي وتمكن من الكشف عن الجمع بين مجموعة من السطح وعلامات داخل الخلايا مع مضان الخلفية محدود، فمن المستحسن أن الالتزام ارتباطا وثيقا مرات الحضانة وغسل الخطواتالمنصوص عليها في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فإنه من المستحسن لتحليل ثلاثة على الأقل يكرر التجريبية مستقلة وأن نلاحظ أن كثافة وضع العلامات والسطحية الاستقرار حاتمة يمكن أن يكون علامة محددة وربما تحتاج إلى مزيد من التحسين. مرة واحدة أنشئت لهدف معين، على الرغم تفتقر إلى القدرة على تحليل الخصائص المورفولوجية، وتدفق الكشف cytometric السطحية ومستضدات الخلايا أو مستضدات الخلايا وحده متوافقة مع المجهري مضان التقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تأسيس بروتوكول المعروضة هنا بشكل جيد للمزارع الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية، ولكن يمكن أن تطبق على قدم المساواة مع غيرها من مصادر الخلايا العصبية بما في ذلك الأنسجة الابتدائية أو خطوط الخلايا العصبية. بالإضافة إلى مصادر الجنينية، الخلايا الجذعية أو السلف العصبية يمكن استخراجه من المناطق العصبية من الدماغ البالغ 27. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي وFACS يمكن استغلالها لتحديد وتحليل وعزل السكان الخلية المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الناضجة 54، 33 دبق نجمي الخلايا، دبيقي 55، قليلة التغصن 56، أو الخلايا البطانية 57 من أنسجة المخ بعد الولادة.

بغض النظر عن المصدر، الظروف المثلى لتثبيت وpermeabilization ضرورة أن تحدد لكل نوع من الخلايا تجريبيا، كما تتجاوز أي من الخطوات يمكن أن يؤدي إلى تغيير هائل من الخصائص مبعثر تؤثر على تدفق cytometric قراءات. كفاءة بروتوكول يعتمد أيضا على STABILإيتي من جزيئات سطح مرحلة ما بعد permeabilization. وتجدر الإشارة إلى أن الحواتم سطح مختلفة يمكن أن تتأثر التلاعب خلية كجزء من الإجراء بدرجات متفاوتة. أيضا حصاد الأنزيمي مع استبدال التربسين أو liberase-1، على سبيل المثال، قد تؤثر مجموعة من الحواتم سطح الخلية ولكن بدرجة أقل مقارنة مع استخدام Accutase أو غراء 7.

قد تتأثر الحواتم محددة من قبل نفس النموذج العلاج إلى درجة متفاوتة: ففي حين VCAM-1 (الأوعية الدموية التصاق الخلية البروتين 1؛ CD106) يمكن أن تتأثر الحصاد، والتفكك، وتثبيت permeabilization بطريقة حساسة جدا، ICAM-1 ( بين الخلايا التصاق جزيء-1؛ CD54) قد عرض نمط التعبير أكثر قوة الحفاظ عليها في جميع أنحاء الداخلي 58.

بينما في السابق إما سطح 25،28 أو وضع العلامات مستضد الخلايا 14 تم تطبيقها في نماذج بيولوجيا الأعصاب، نهج الجمع بين كل من مethods 38 يمكن أن تسفر عن المرشحين المستضد السطحي العصبي الرواية وتوفير خيارات إضافية cytometric قراءات.

نحن بشكل روتيني بإجراء الخطوة تلطيخ السطح قبل الخلايا مستضد تلطيخ واستخدمت هذه الاستراتيجية لتوسيع مجموعة لدينا من علامات سطح لneuropoiesis 38 باستخدام مجموعة من خطوط الخلايا العصبية البشرية. والمعايرة من الأجسام المضادة والأوقات الحضانة يحتاج إلى أن يكون الأمثل لأنواع الخلايا منها، تستهدف الحواتم والنموذج التجريبي. وبالمثل، يجب أن يكون الأمثل للتركيز CFSE وكمية من الخلايا المستخدمة في تلوين لكل خط الخلية، حيث أن جميع خطوط الخلايا لا وصمة عار بطريقة متطابقة مع نفس الكمية من تركيز CFSE.

CFSE لديه الإثارة ذروتها من 494 نانومتر، والانبعاثات الذروة من 521 نانومتر (قناة خضراء، FL-1 كاشف)، وبالتالي أي امتداد مضان إلى قنوات أخرى يحتاج إلى تعويض لتحديد الانبعاثات مضان محدد. الأصباغ البديلة مثل CEليرة لبنانية تتبع البنفسج (CTV)، خلية انتشار صبغ eFluor 670 (CPD)، الأفق V550، V450 الأفق قد حوكموا بنجاح واختبار لاستخدامها بدلا من CFSE 59،60.

في التدفق الخلوي، فمن الأهمية بمكان لتحديد إشارة الفلورسنت محددة الفعلية من الخلفية. ولذلك، فإن الضوابط أنسب يجب أن يتم اختياره بعناية، ويمكن أن تشمل استخدام خط الخلايا غير العصبية أو سلبي على خلاف ذلك لتأكيد خصوصية الأجسام المضادة (ما يسمى ضوابط السلبية الداخلية 38،46). يجب أن تؤخذ تألق ذاتي من كل مصدر خلية في الاعتبار. ضوابط نمط إسوي يمكن اعتبار الاستغناء عنها إلى حد كبير في الكشف عن الخلايا العصبية أكثر النماذج 13،46.

ونظرا للتباين كبير لوحظ في أنظمة زراعة الخلايا (وخاصة تلك المشتقة من الخلايا الجذعية) والإجراء تلطيخ، ينصح بإدراج مكررات البيولوجية بقوة. وتجدر الإشارة إلى أن استخدام للصحفيين الجيني هوطريقة أخرى لاستخدام التدفق الخلوي العصبي 61،62. مؤخرا، يعد معروف وآخرون تستخدم نهجا مراسل Nkx2.1 GFP لفرز متميزة القطعان العصبية مثل القشرية-من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية 63.

ويمثل حقل صعود والمقبلة من خلال استكشاف exosomes العصبية في المناطق الطبية الحيوية متنوعة مثل علم الأحياء الورم والتنكس العصبي 64، والتدفق الخلوي من exosomes أو العزلة من خلال فحوصات القائم على حبة يوفر أدوات هامة لهذا المسعى 65. لبروتوكول الفيديو ذات علاقة انظر 66.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Tags

علم الأعصاب، العدد 94، علامات CD، المستضدات السطحية، مستضدات الخلايا، التدفق الخلوي، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الخلايا الجذعية العصبية، الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS)، CD24، CD54، CFSE
التدفق الخلوي بروتوكولات لالسطحية وبين الخلايا مستضد تحليلات العصبية أنواع الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter