Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

तंत्रिका कोशिका प्रकार की सतह के लिए फ्लो प्रोटोकॉल और intracellular एंटीजन विश्लेषण

Published: December 18, 2014 doi: 10.3791/52241
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1,4
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

Introduction

फ्लो बड़े पैमाने पर आंतरिक बिखराव गुण, कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति, और अन्य प्रतिदीप्ति मापदंडों 1-3 के माध्यम से सेल आबादी को परिभाषित करने के इम्यूनोलॉजी, रुधिर विज्ञान और ऑन्कोलॉजी में शोषण किया गया है। खून वंश विकास और रोग में हमारी अंतर्दृष्टि अपनी आरंभिक कार्यान्वयन 4,5 के बाद इस पद्धति की निरंतर शोधन का एक महत्वपूर्ण डिग्री करने के लिए एक परिणाम है। प्रवाह के मात्रात्मक और समग्र विश्लेषणात्मक क्षमता का जागरूकता बढ़ी cytometry के हाल ही में स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में अपनी और अधिक व्यापक उपयोग के लिए प्रोत्साहित किया है और एक छोटे समय सीमा 6 में इसी तरह गहरा प्रगति सक्षम हो सकता है। हालांकि, विशेष रूप से तंत्रिका आबादी का विश्लेषण और अलग करने के लिए फ्लो के आवेदन लंबे समय से चुनौतीपूर्ण के रूप में माना गया है। स्वाभाविक रूप से निलंबन में मौजूद hematopoietic कोशिकाओं के विपरीत, तंत्रिका कोशिका प्रकार के आम तौर glia और विभिन्न ओ शामिल हो सकते हैं कि जरूरत से ज्यादा जटिल स्रोतों से काटा जाता हैवहाँ आसपास की कोशिकाओं के साथ ही प्रक्रिया असर न्यूरॉन्स की एक जटिल नेटवर्क। नतीजतन, तंत्रिका जीव विज्ञान दैनिक अनुसंधान दिनचर्या में अपनी पूरी क्षमता के लिए फ्लो की चंचलता को लागू करने के लिए अभी तक है। हालांकि तंत्रिका जीव विज्ञान में विश्लेषणात्मक प्रदर्शनों की सूची का एक महत्वपूर्ण तत्व माना जा सकता है, के रूप में लंबे समय से एक व्यवहार्य एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है (और प्रोटोकॉल उद्देश्य है कि 7 के लिए तैयार कर लिया और अनुकूलित किया गया है) के रूप में, प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) 8-11।

चित्रा 1
। Fluidics, प्रकाशिकी और इलेक्ट्रॉनिक्स: प्रवाह cytometric विश्लेषण और एक प्रवाह cytometer के घटकों के चित्रा 1. सिद्धांत प्रवाह cytometers तीन मुख्य सिस्टम शामिल। निलंबन में कोशिकाओं की एक सुव्यवस्थित प्रवाह म्यान flui द्वारा पूरा किया है (प्राथमिक ऊतक या इन विट्रो संस्कृति में से तैयार)hydrodynamic के माध्यम से घ इसके केंद्र कोर करने के लिए नमूना सीमित केंद्रित थी। ऑप्टिकल भागों उपयुक्त डिटेक्टरों के लिए संकेत प्रत्यक्ष कि कोशिकाओं और ऑप्टिकल फिल्टर की धारा रोशन कि पराबैंगनीकिरण से बना रहे हैं। इलेक्ट्रॉनिक संकेतों, बाद में एक कंप्यूटर द्वारा संसाधित और डेटा विश्लेषण और gating के लिए एक निगरानी पर कल्पित करने के लिए परिवर्तित कर रहे हैं पता लगाया प्रकाश का संकेत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक कोशिकामापी की इमारत ब्लॉकों सहित अंतर्निहित बुनियादी बातों का कम से कम एक बुनियादी समझ से प्रवाह cytometric विधियों लाभ के उपयोगकर्ता (समीक्षा के लिए 12,13 देख, यह भी चित्रा 1 देखें)। एक लेजर बीम बदले में 'एकल फाइल' एक के बाद एक में लेजर बीम के माध्यम से पारित जो निलंबन में कोशिकाओं, जिसमें एक hydrodynamically ध्यान केंद्रित fluidic धारा के साथ intersects। interceptiइस पूछताछ के बिंदु से प्रकाश के प्रकीर्णन में लेजर परिणामों के साथ एक सेल (या उस बात के लिए किसी अन्य कण) की पर। (; कण / सेल की granulosity दर्शाती पक्ष स्कैटर) बिखरे हुए प्रकाश, साथ ही सीधा अपनी दिशा के लिए (कण के आकार के साथ जुड़े आगे तितर बितर, लेजर) दिशा की निरंतरता में पता लगाया जा सकता है। इन aforementioned बिखराव गुण (भी या सेलुलर मलबे, हवा के बुलबुले, आदि) एक unlabeled नमूना सामान्यतः प्रारंभिक gating के लिए प्रयोग किया जाता पक्ष तितर बितर साजिश बनाम द्विचर आगे तितर बितर पर एक संकेत (घटना) उत्पन्न होगा जो कारण है कि विशिष्ट लेबलिंग, की आवश्यकता नहीं है। उपयुक्त लेज़रों और इसी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए विशिष्ट फिल्टर का उपयोग करके, एक सेल अपनी सकारात्मकता, तीव्रता के स्तर पर, या फ्लोरोसेंट मार्करों के अभाव के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। प्रवाह cytometric अनुप्रयोगों के बहुमत कोशिका की सतह एंटीजन के माध्यम से लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है। हिमेटोपोयटिक lineag के विपरीतई, तंत्रिका वंश सतह मिलान अभिव्यक्ति पैटर्न 5 के अनुसार कम बड़े पैमाने पर परिभाषित कर रह गया है। सतह एंटीजन शोषण का एक फायदा जीवित कोशिकाओं ऐसे FACS के रूप में छँटाई लद सेल के अधीन किया जा सकता है। इसके विपरीत, intracellular प्रतिजन धुंधला व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता है कि बहाव के अनुप्रयोगों precluding, मिलान-एंटीबॉडी बातचीत में मध्यस्थता करने के निर्धारण और permeabilization के चरणों की आवश्यकता है। ध्यान से, इस तरह के दृष्टिकोण अभी भी कई मात्रात्मक assays के 14 के साथ ही शाही सेना और प्रोटीन अभिव्यक्ति 15 के लिए नीचे की ओर विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। रुधिर, इम्यूनोलॉजी और ऑन्कोलॉजी अक्सर विशेष उप-जनसंख्या 16 को परिभाषित करने के संयोजन के रूप में एक दर्जन से अधिक मार्कर का इस्तेमाल किया है। इसके अतिरिक्त, जन cytometry या CyTOF अब 30 मापदंडों एक साथ 17,18 अप करने के लिए विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

तंत्रिका स्टेम सेल अनुप्रयोगों के साथ ही प्राथमिक संस्कृतियों 14,19,20 कोशिकाओं की विविधता में लिएइन विट्रो एक आम घटना 21-23 है। ब्याज का लक्ष्य आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं कोशिकाओं प्रयोगात्मक readout के 24,25 के लिए एक संभावित confounding कारक प्रतीक रहे। सुविधाजनक, एक विषम सेल निलंबन के भीतर मौजूद विभिन्न सेलुलर कैंपेन्स इन विभिन्न आबादियों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो अलग (जाना जाता है या अभी तक deciphered जा सकता है) प्रतिजन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, सहन। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की सुविधा है, इसलिए इस प्रकार, सेलुलर विविधता को हल करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं और प्रवाह cytometry (इन विट्रो assays, सेल थेरेपी) और सबसे अधिक प्रासंगिक सबसेट 24,26 पर ध्यान केंद्रित करके मात्रात्मक readout के अनुकूलन। विभिन्न सतह प्रतिजन संयोजन विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार के quantitation और अलगाव की अनुमति के लिए पिछले कुछ वर्षों में पहचान की गई है। यह तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 27, एनएससी के अलगाव के लिए CD15 / CD24 / CD29 सतह एंटीजन का एक संयोजन, differentia के संवर्धन के लिए CD133 शामिलटेड न्यूरॉन और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 28 या CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 अन्य हस्ताक्षर 29,30 के बीच तंत्रिका और glial कैंपेन्स 25, अलग करने के लिए। न्यूरॉन्स के अलावा, glial मार्करों A2B5 31 CD44 25, NG2 32 और GLAST 33 में शामिल हैं। हाल के एक प्रकाशन पार्किंसंस कोशिका प्रत्यारोपण में डोपामिनर्जिक व्यापारियों के लिए समृद्ध करने के लिए मध्यमस्तिष्क floorplate अग्रदूत मार्कर CORIN 34,35 36 लद का शोषण किया है। सीडी अणुओं केवल मार्कर नहीं कर रहे हैं, लेकिन सेल सेल बातचीत की और एक सेल की क्षमता के कार्यात्मक प्रासंगिक मध्यस्थों बाह्य मैट्रिक्स अणुओं से संकेत करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए और विकास के 37 कारकों। आगे तंत्रिका वंश विकास चिह्नित करने के लिए मिश्रित सीडी एंटीजन के शस्त्रागार को बढ़ाने की एक रणनीति के ब्याज की एक विशेष सेल प्रकार के लिए सीडी प्रतिजन संयोजन के लिए स्क्रीन और परिभाषित करने के लिए जाना जाता है इंट्रासेल्युलर मार्कर का उपयोग करने के लिए है। हमने हाल ही में इस तरह के एक दृष्टिकोण शोषण और सीडी 4 की पहचान की है9 फ - / CD200 neurally भेदभाव प्रेरित स्टेम सेल संस्कृति सिस्टम 38 से न्यूरोनल कैंपेन्स समृद्ध बनाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण के रूप में उच्च मिश्रित अभिव्यक्ति पैटर्न। यहाँ, हम में शामिल हैं और बाद के प्रोटोकॉल (और उसके वैकल्पिक रूपों) में जो सतह धुंधला और intracellular धुंधला फ्लो द्वारा तंत्रिका कोशिका उप-जनसंख्या को परिभाषित करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है पर चर्चा की।

चित्रा 2
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विकल्पों में से चित्रा 2. प्रवाह आरेख। आंकड़ा प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख कदम के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है। वैकल्पिक कदम (CFSE डाई या intracellular प्रतिजन लेबलिंग) हल्के भूरे रंग के बॉक्स से संकेत कर रहे हैं। कटाई के बाद, यह कोशिका की सतह धुंधला करने से पहले तंत्रिका कोशिका निलंबन की व्यवहार्यता और सेल नंबर का आकलन करने के लिए आवश्यक है। सकारात्मक रूप मेंसाथ ही नकारात्मक नियंत्रण हित के नमूनों के अलावा में शामिल होने की जरूरत है। नमूने प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया है और / या सेल छँटाई लद में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हम पहले से intracellular धुंधला 38 के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयोजन में प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, अब हम जिससे सेल हेरफेर 39 के इस कदम को कम करने, एक मामूली बदलाव के रूप में फ्लोरोसेंट फैब टुकड़े (Zenon लेबलिंग) के माध्यम से प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर-सहसंयोजक लेबलिंग परिचय। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा का एक और उदाहरण के रूप में, हम प्रतिजन धुंधला करने के लिए सतह से पहले succinimidyl एस्टर (CFSE) Carboxyfluorescein से एक प्रयोगात्मक सबसेट का एक वैकल्पिक लेबलिंग रोजगार। इस तरह के CFSE पूर्व लेबलिंग दो सेल लाइनों या प्रयोगात्मक शर्तों के तत्काल सीधी तुलना (सक्षम बनाता हैबनाम CFSE लेबल। एक भी नमूना ट्यूब, विचरण या ऊष्मायन समय में सूक्ष्म अंतर को कम करने और एंटीबॉडी बचत के भीतर) लेबल हटाया गया। CFSE सामान्यतः प्रसार 41,42 और barcoding प्रयोगों 43,44 में, सेल ट्रैकिंग 40 के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक स्थापित फ्लोरोसेंट रंजक है। वास्तविक छँटाई कदम (FACS, immunomagnetic सेल जुदाई या immunopanning) इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं हैं, जबकि अंत में, सिद्धांत रूप में, यहाँ वर्णित कटाई और लेबलिंग प्रक्रियाओं antigen- या intracellular लेबलिंग आधारित छँटाई अनुप्रयोगों के लिए सतह के अधीन किया जा सकता है कि उपज नमूने 15 25,28।

इस लेख के साथ, हम करने के लिए लक्ष्य: एक के रूप में एक intracellular CFSE डाई लेबलिंग कदम 41,45 मौजूद है, एक इंट्रासेल्युलर ठिकानों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के साथ ही संयुक्त सतह और intracellular प्रतिजन विश्लेषण 38 को संक्षेप में, एक व्यवहार्य सतह प्रतिजन धुंधला प्रोटोकॉल 25,28 को संक्षेप में कॉम के लिए प्रयोगात्मक विकल्पparative तंत्रिका कोशिका आबादी का विश्लेषण करती है, और cytometric विश्लेषण (रणनीति और डेटा प्रस्तुति 47 gating उचित नियंत्रण 13,46,) प्रवाह करने के लिए दृष्टिकोण संक्षेप।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तंत्रिका कोशिका संचयन

  1. माइक्रोस्कोप से आकलन:
    1. एक प्रयोग की शुरुआत करने से पहले, उज्ज्वल क्षेत्र या चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ संस्कृति की स्थिति की जाँच करें।
      नोट: dissections से प्राप्त प्राथमिक तंत्रिका ऊतक है, सिद्धांत रूप में, समान रूप से उत्तरदायी cytometric विश्लेषण 14,28 प्रवाह करने के लिए, प्रोटोकॉल का ध्यान इन विट्रो तंत्रिका कोशिका प्रणालियों से प्राप्त कोशिकाओं पर है कि कृपया ध्यान दें।
  2. कटाई कोशिकाओं 7:
    1. धीरे 2 + मिलीग्राम के साथ पक्षपाती कोशिकाओं के पकवान / कुप्पी धोने / सीए 2 + मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) आरटी पर (जैसे, T75 कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर, 6 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति 3 मिलीग्राम, या 10 मिलीलीटर के लिए 10 सेमी पकवान)।
      नोट: पीबीएस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया 2 मिलीग्राम + / सीए 2 + मुक्त है।
      1. वीडियो उदाहरण के लिए, 80% confluency पर एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं का एक T75 कुप्पी का उपयोग करें। मामलों में जहां अतिरिक्त धोने कदम लागू करेंकाफी मलबा पकवान में मौजूद है।
      2. सीरम albumin युक्त पीबीएस 48, Percoll, या Ficoll 49 centrifugation के ढ़ाल और / या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोती 50,51 साथ washes के बारे में सोचें। माइलिन और अन्य लिपिड या अन्य प्रदूषणों से निकालना वयस्क प्राथमिक ऊतक स्रोतों का इस्तेमाल किया जा रहा है, खासकर जब महत्वपूर्ण है।
    2. टिशू कल्चर पोत की पूरी सतह को शामिल किया गया है कि एक उचित मात्रा में पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin प्रतिस्थापन जोड़ें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, Accutase या अन्य एंजाइमी पाचन विकल्पों पर विचार करें। यह महत्वपूर्ण कदम नकारात्मक (7 देखें) सतह मिलान अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है।
    3. कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुमति देने के लिए (सेल प्रकार पर निर्भर करता है) 5 मिनट - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान / फ्लास्क सेते हैं। धीरे कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक pipet साथ टिशू कल्चर पोत या फ्लश नल। (इस रूप में बाद के चरणों में सेल घटाने और थक्के का कारण बन सकता है) पाचन के ऊपर से बचें।
    4. क्यूदो बार प्रवाह बफर (पीबीएस में 2% FBS) की मात्रा जोड़कर ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन uench और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा।
    5. एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए - (1000 μl 100) या एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet धीरे एक माइक्रोलीटर pipet का उपयोग सेल निलंबन triturate।
    6. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 220 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सावधानी के पीछे गोली छोड़ने पर तैरनेवाला aspirate।
    7. पुनः निलंबित गोली (के आकार पर निर्भर करता है, प्रवाह बफर का एक उचित मात्रा में गोली जैसे, एसएच SY5Y कोशिकाओं के एक मिला हुआ T75 कुप्पी के लिए विशिष्ट उपज कम से कम 10 x 10 6 कोशिकाओं है, जो मामले की कोशिकाओं में प्रवाह बफर के 5 एमएल) में resuspended हैं।
      नोट: बड़ा हिस्सा या थक्के मनाया जाता है, तो एक 30 के माध्यम से फिल्टर - 100 माइक्रोन जाल।
  3. सेल गिनती 52:
    1. टीआर की मात्रा में एक परिभाषित अनुपात पर एक microcentrifuge ट्यूब के लिए सेल निलंबन के एक छोटे से विभाज्य स्थानांतरण और पतलाypan नीले या एक hemocytometer को हस्तांतरण या स्वचालित सेल गिनती प्रणाली से पहले एक वैकल्पिक व्यवहार्यता डाई।
    2. (CFSE लेबलिंग के साथ आगे बढ़ने से अगर) 0.1% BSA के साथ प्रवाह बफर या पीबीएस की उचित मात्रा जोड़कर 1 एक्स 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए सेल निलंबन पतला।
      नोट: propidium आयोडाइड, 7-aminoactinomycin डी, Annexin वी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिक्स व्यवहार्यता परख किट कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के क्रम में वैकल्पिक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं। पहले से 53 में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में वर्णित इसके अलावा, apoptosis के assays के कस्पासे 3 प्रतिदीप्ति का उपयोग कर। फ्लोरोसेंट चैनलों सभी नमूनों में शामिल अगर बाद के चरणों के लिए विकल्प सीमित कर सकता है जो इन अभिकर्मकों द्वारा "पर कब्जा कर लिया" हो जाएगा।

CFSE का प्रयोग 2. Intracellular डाई लेबलिंग (चित्रा 3)

  1. आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक वांछित शेयर एकाग्रता के लिए CFSE पतला।
    नोट: इन प्रयोगों के एक शेयर की एकाग्रता के लिए0.01 मिमी इस्तेमाल किया गया था। अनुभव से CFSE का इष्टतम काम कर रहे एकाग्रता का निर्धारण।
  2. 0.1 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं की मिलीलीटर प्रति 0.01 मिमी CFSE समाधान (धारा 1.3.2, पीबीएस + 0.1% BSA में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता) के 10 μl जोड़ें। संक्षेप में भंवर मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    नोट: यहां इस्तेमाल CFSE सांद्रता के बारे में डाई की विषाक्तता सेल इसलिए, सामान्यतः प्रसार assays में लागू किया लोगों की तुलना में कम दस गुना कर रहे हैं कम है। हम सेल व्यवहार्यता पर नकारात्मक प्रभाव का पालन नहीं करते हैं।
  3. लगातार झटकों (200 आरपीएम) के साथ आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  4. ट्यूबों के लिए प्रवाह बफर के 5 संस्करणों जोड़कर डाई बुझाना। आरटी पर 5 मिनट के लिए 94 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. पीछे गोली छोड़ने सतह पर तैरनेवाला त्यागें। प्रवाह बफर के 5 संस्करणों के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए 94 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में प्रवाह बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित / एमएल।
  7. दाग सेल निलंबन के लिए ब्याज की बेदाग कोशिकाओं की संख्या बराबर जोड़ें। प्रतिजन धुंधला प्रोटोकॉल (धारा 3) सतह के लिए आगे बढ़ें।

चित्रा 3
CFSE डाई लेबलिंग। एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं के माध्यम से दो सेल लाइनों के बीच अंतर सीडी सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति की चित्रा 3. जांच-पूर्व में चिह्नित कर रहे लेबल हटाया गया बी.जे. fibroblasts की तुलना में बाद में पहचान के लिए CFSE साथ। (; तीर = बी.जे. fibroblasts के तीर = एसएच SY5Y) सतह मार्कर CD24 या CD54 (दोनों एपीसी संयुग्मित) के साथ मिश्रित नमूना (सही पैनल) के सह-धुंधला सेल लाइनों की वजह से CFSE धुंधला करने के लिए आसानी से साफ़ कर रहे हैं कि यह दर्शाता है। एसएच SY5Y कोशिकाओं के बहुमत CD24 लेकिन नहीं CD54 (ICAM-1) व्यक्त करते हैं। इसके विपरीत, बी.जे. fibroblasts (नकारात्मक CFSE) CD54 के लिए सकारात्मक है लेकिन CD24 के लिए काफी हद तक नकारात्मक हैं।"Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. सेल सतह धुंधला

  1. नमूने और महत्वपूर्ण नियंत्रण (1 टेबल देखें) सहित लेबल ट्यूबों।
ट्यूब नहीं। नमूना नाम एंटीजन-फ्लोरोफोरे घोला
1 बेदाग कोशिकाओं -
2 एकल दाग CD24-एपीसी 1:50
3 एकल दाग TUJ1-एलेक्सा Fluor 488nm 1: 2000
4 सना हुआ डबल CD24-एपीसी 1:50
TUJ1-एलेक्सा Fluor 488nm 1: 2000
5 एकल दाग माध्यमिक केवल: एलेक्सा Fluor 488nm 1: 2000

ट्यूब की तालिका 1. एल IST प्रयोग cytometry के एक विशिष्ट प्रवाह में शामिल किया जाना है। तालिका इस वीडियो लेख में वर्णित एक सह-धुंधला प्रयोग के लिए आवश्यक नमूना ट्यूब की एक न्यूनतम सेट से पता चलता है। एक आदर्श प्रयोग प्राप्त परिणामों की सटीक व्याख्या के लिए सभी आवश्यक नियंत्रण (नकारात्मक, सकारात्मक रूप में अच्छी तरह से मुआवजा नियंत्रण) को शामिल करने की जरूरत है।

  1. प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (धारा 2.7 या 1.3.2 से) सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि 0.1 x 10 6 कोशिकाओं की एक न्यूनतम सेल निलंबन के 100 μl प्रति मौजूद हैं बनाओ।
  2. एक उपयुक्त कमजोर पड़ने पर नमूना फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: प्रयोग करने से पहले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने काम कर निर्धारण करते हैं। एक सूची ओ के लिए 2 टेबल देखेंएफ तंत्रिका सतह एंटीजन।
एंटीजन सेल प्रकार संदर्भ
CD15 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं [28, 67]
CD24 Neuronal कोशिकाओं [28, 68]
CD29 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं [28, 69, 70]
CD44 Glial कोशिकाओं [25]
CD49f तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं [38]
CD56 (NCAM) Neuronal कोशिकाओं [71]
CD133 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं [27]
CD184 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और glial कोशिकाओं [25]
CD200 Neuronal कोशिकाओं [38]
CD271 तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं
A2B5 Glial कोशिकाओं [31]
CORIN डोपामिनर्जिक व्यापारियों [35, 36]
FORSE1 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) [72]
GLAST Glial कोशिकाओं [33]
NG2 Glial कोशिकाओं [32]

तंत्रिका सतह एंटीजन की तालिका 2. चुनाव में। इस तालिका तंत्रिका वंश विशेषताएँ इस्तेमाल सतह एंटीजन की बढ़ती पैनल उदाहरण देना करने के लिए विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकार से व्यक्त हो पाया सतह epitopes की एक सूची प्रदान करता है। इस चयन पूर्ण और इन मार्करों के अधिकांश भी अन्य तंत्रिका और गैर-तंत्रिका कोशिकाओं की एक सीमा से व्यक्त कर रहे हैं कि से दूर जा रहा है कि ध्यान दें। नतीजतन, कई मार्करों के संयोजन बेहतर परिभाषित करने और संकेत दिया तंत्रिका सबसेट को अलग-थलग करने की आवश्यकता होगी।

    अंधेरे में एक कक्षीय प्रकार के बरतन (200 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  1. फ्लो बफर धोने
    1. ट्यूबों के लिए प्रवाह बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 380 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. पीछे गोली छोड़ने सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  2. फिर से धोने कदम दोहराएँ।
  3. दूसरे धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला छानना और 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए प्रवाह बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  4. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए नमूना का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, धारा 4 और 5 के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: कोशिकाओं को हल और संस्कृति के बाद FACS में वापस डाल जा रहे हैं (यानी, निर्धारण या permeabilization के बिना व्यवहार्य सेल निलंबन), फसल, धुंधला और विश्लेषणात्मक चरणों के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक लागू होते हैं।

4. फिक्सेशन और Permeabilization 38

  1. फिक्सेशन का उपयोग कर paraformaldehyde (पीएफए):
    1. पीबीएस में 2% पीएफए ​​युक्त निर्धारण बफर तैयार करें।
    2. सेल निलंबन के 100 μl करने के निर्धारण बफर के 500 μl जोड़ें।
    3. अंधेरे में एक कक्षीय प्रकार के बरतन (100 आरपीएम) पर 15 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं।
  2. पीबीएस धो:
    1. ट्यूब के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 380 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. ट्यूब में लगभग 100 μl छोड़ने सतह पर तैरनेवाला छानना / त्यागें।
  3. बीच 20 के साथ permeabilization:
    1. पीबीएस में 0.7% बीच 20 से युक्त permeabilization के बफर तैयार करें।
    2. सेल निलंबन के 100 μl के लिए permeabilization के बफर के 500 μl जोड़ें।
    3. अंधेरे में एक कक्षीय प्रकार के बरतन (100 आरपीएम) पर 15 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं।
  4. (धारा 4.2 में वर्णित) पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और ट्यूब सह से सतह पर तैरनेवाला हटानेmpletely, पीछे ही गोली छोड़कर।

5. Intracellular एंटीजन धुंधला 38 (चित्रा 4)

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की तैयारी:
    1. 1% गोजातीय सीरम albumin, 10% सीरम (जैसे, सामान्य गधा या बकरी सीरम) और 0.5% बीच 20 पीबीएस में युक्त कमजोर पड़ने बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला।
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी में उठाए गए थे प्रजातियों के आधार पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए सीरम चुनें।
    2. वैकल्पिक रूप से, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी की Zenon fluorescein लेबलिंग का उपयोग करें।
      1. एक उपयुक्त कमजोर पड़ने (20 μl ≤ कुल मात्रा) में पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के एक माइक्रोग्राम प्रति तैयार करें।
      2. एंटीबॉडी समाधान करने के लिए Zenon fluorescein आईजीजी लेबलिंग अभिकर्मक (घटक) के 5 μl जोड़ें।
      3. आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
      4. प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए Zenon अवरुद्ध अभिकर्मक (घटक बी) के 5 μl जोड़ें।
      5. सेनाआरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण। 30 मिनट के भीतर नमूना करने के लिए एंटीबॉडी लागू करें।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला:
    1. सेल गोली प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए triturate।
    2. वैकल्पिक रूप से, उपयुक्त कमजोर पड़ने पर सेल निलंबन के लिए Zenon fluorescein लेबल एंटीबॉडी जोड़ें।
    3. प्रकाश से सुरक्षित एक कक्षीय प्रकार के बरतन (200 आरपीएम), पर 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं। (धारा 4.2 में वर्णन किया गया है) के रूप में पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और पीछे ही गोली छोड़ रहा है, पूरी तरह से ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. (Zenon fluorescein लेबल वाले एंटीबॉडी के लिए आवश्यक नहीं है) माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला:
    1. एक उपयुक्त एकाग्रता में पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला।
    2. सेल गोली माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए triturate। अंधेरे में एक प्रकार के बरतन (200 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं।
  4. (धारा 4.2 में वर्णित) पीबीएस के साथ नमूने दो बार धोएं।
  5. प्रवाह बफर के साथ एक बार धो (धारा 3.5 देखें)।
  6. प्रवाह बफर के लगभग 150 μl में कोशिकाओं पुनः निलंबित और प्रवाह पर विश्लेषण करते हैं।

चित्रा 4
सतह और intracellular प्रोटीन की चित्रा 4. सह-धुंधला। प्रवाह cytometry डेटा माध्यमिक + प्राथमिक सतह धुंधला के साथ संयोजन में Zenon fluorescein आधारित इंट्रासेल्युलर धुंधला बनाम एंटीबॉडी आधारित बीच एक तुलना एक मिसाल है। Y अक्ष (ऊपरी बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग) और एक्स-अक्ष (कम सही चक्र) पर विशेष सकारात्मकता क्रमशः MAP2 और CD24 के लिए दाग कोशिकाओं से पता चलता है। सह-धुंधला करने के बाद, साझा MAP2 और CD24 अभिव्यक्ति ऊपरी सही चक्र (सही पैनल) में देखा जा सकता है। का उपयोग करने की तुलनाएलेक्सा Fluor 488। MAP2 लेबलिंग पैदावार इसी तरह के परिणाम के लिए Zenon fluorescein (नीचे) बनाम (ऊपर AF488) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. संकेत का पता लगाने के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर धुंधला प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद तुरंत प्रवाह cytometric विश्लेषण का संचालन। फ्लोरिडा -1 (533/30), फ्लोरिडा -2 (585/40), और फ्लोरिडा -4 (675/25) bandpass फिल्टर के साथ 488 एनएम नीले और 640 एनएम लाल लेजर का उपयोग करें।
  2. मलबे और मृत कोशिकाओं को छोड़कर आगे और पक्ष बिखराव के आधार पर प्राथमिक फाटकों को निर्धारित करें।
  3. सतह और एकल दाग नियंत्रण का उपयोग कर वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए बेदाग नमूने और मुआवजे के आधार पर ≤0.5% करने के intracellular प्रतिजन के लिए सेट प्रतिदीप्ति फाटकों।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बहुमुखी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण (चित्रा 2) के लिए अनुमति देता है। इसके लिए कम से कम संस्करण में, यह सतह एंटीजन की सरल धुंधला के लिए एक गाइड माना जा सकता है (1, 3 और 6 कदम)। इसकी और अधिक जटिल रूप में, इंट्रासेल्युलर एंटीजन की एक सीमा के साथ सह-लेबलिंग मानदंड की एक संख्या (दो और / या 4 से 5 वैकल्पिक कदम) चलाया जा सकता है। इसके अलावा, CFSE लेबलिंग कदम सेल सेल बातचीत के अध्ययन में उप-जनसंख्या का सेल लेबलिंग / नज़र रखने के लिए इसकी उपयोगिता एक मिसाल है या cytometric बारकोडिंग प्रयोगों (चरण 2) प्रवाह। व्यवहार्य सेल आबादी (चरण 2 से प्राप्त की है और / या 3) छँटाई लद (FACS) और बाद क्रमबद्ध सेल संस्कृति सहित बहाव के विश्लेषण प्रकोष्ठ के लिए उत्तरदायी हैं। दूसरी ओर, संयुक्त intracellular और सतह प्रतिजन धुंधला (3 से 5 कदम)अपने आप में विश्लेषणात्मक readout के अवसर प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, (- न्यूरोनल FACS के लिए / CD200 उच्च हस्ताक्षर। CD49f की पहचान के लिए Turaç एट अल 38 में हमारे द्वारा लागू) तंत्रिका कोशिका आबादी के विशेष सबसेट पर कुछ सीडी एंटीजन की सह स्थानीयकरण की पहचान। इन और अन्य उदाहरण तंत्रिका मार्कर CD15, CD29, CD49f और FORSE1, मुख्य रूप से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के साथ जुड़े रहे हैं, जिनमें से 2 टेबल में प्रदान की जाती है, और CD24 और CD56 neuronal कोशिकाओं पर प्रचुर मात्रा में होते हैं। इन मार्करों के कुछ विशेष कर रहे हैं, अलग धुंधला तीव्रता और बहुभिन्नरूपी अभिव्यक्ति विश्लेषण विश्लेषण और विशेष रूप से तंत्रिका उप-जनसंख्या के अलगाव के लिए विशिष्ट मार्कर सेट की पहचान करने में मदद कर सकते हैं।

चित्रा 3 इंट्रासेल्युलर डाई और सतह धुंधला के मिश्रित उपयोग से प्राप्त विशिष्ट परिणाम एक मिसाल है। डेटा दो अलग सेल आबादी आसानी से मैं प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि कैसे दिखानेना होने के कारण आबादी में से एक की पूर्व लेबलिंग करने के लिए नमूना मिलाया। इधर, एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं CFSE साथ लेबल रहे थे, और ग्रीन चैनल (FL1; Y अक्ष) में प्रदर्शनी प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से यह है कि इस मामले बी.जे. fibroblasts में, बेदाग दूसरा आबादी से अलग। जबकि अच्छी तरह से स्थापित विशेषता तंतुप्रसू (CD54) और तंत्रिका (CD24) मार्करों दिखाए जाते हैं (उनके संबंधित लक्ष्य आबादी पर उपस्थित; FL2 या क्रमशः FL4 प्रतिदीप्ति; एक्स अक्ष) के अनुरूप दृष्टिकोण अतिरिक्त अज्ञात एंटीजन लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, पूर्व सह संस्कृति प्रयोगों लेबल रहे थे कि दो (या अधिक) उप-जनसंख्या का सेल सेल बातचीत के प्रभाव को इस तरह से अध्ययन किया जा सकता है।

चित्रा 4 निर्धारण और permeabilization के बाद CD24-एपीसी और / या intracellular न्यूरोनल MAP2 प्रतिजन (FITC चैनल) के लिए दाग बेदाग एसएच SY5Y कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से नमूनों से पता चलता है। बिखराव गुणों को प्रभावित कर सकते हैं उत्तरार्द्ध, बीए के रूप मेंckground प्रतिदीप्ति और सतह मिलान धुंधला, भूखंडों के intracellular धुंधला के बाद तंत्रिका CD24 के बनाए रखा सतह अभिव्यक्ति दस्तावेज़ करने के लिए काम करते हैं। इसके अलावा, CD24 पॉजिटिव अंश पर न्यूरोनल MAP2 धुंधला की सह स्थानीयकरण दिखाया गया है। यह जीवित कोशिकाओं पर CD24 सतह अभिव्यक्ति की तुलना द्वारा सतह प्रतिजन के वफादार पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। पृष्ठभूमि पर इंट्रासेल्युलर का पता लगाने के अलावा विशिष्टता, गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी और Autofluorescence होने की पुष्टि करने की जरूरत है। Zenon प्रतिदीप्ति आधारित या प्राथमिक + माध्यमिक एंटीबॉडी आधारित रणनीतियों के माध्यम से इंट्रासेल्युलर एंटीजन की जांच में यह और अधिक समय कुशल दृष्टिकोण (लंघन कदम 5.3) पर विचार के लिए एक औचित्य प्रदान करता है जो तुलनीय परिणाम, अर्जित करता है। प्रोटोकॉल मजबूत है और सतह और सीमित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति साथ इंट्रासेल्युलर मार्करों की एक सीमा के संयुक्त पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है, यह बारीकी से ऊष्मायन बार और वाशिंग चरणों का पालन करने की सिफारिश की हैप्रोटोकॉल में प्रदान की है। इसके अलावा, यह कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगात्मक दोहराता विश्लेषण करने के लिए और मार्कर-विशिष्ट हो सकता है कि लेबलिंग तीव्रता और सतह मिलान स्थिरता नोट करने के लिए और आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती सलाह दी जाती है। एक बार रूपात्मक सुविधाओं का विश्लेषण करने की क्षमता की कमी के बावजूद, अकेले परंपरागत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है सतह और intracellular एंटीजन या intracellular एंटीजन की cytometric का पता लगाने के प्रवाह, एक विशेष लक्ष्य के लिए स्थापित किया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से मानव स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों के लिए स्थापित किया गया है, लेकिन उतना ही प्राथमिक ऊतक या तंत्रिका कोशिका लाइनों सहित अन्य तंत्रिका कोशिका स्रोतों के लिए लागू किया जा सकता है। भ्रूण स्रोतों के अलावा, तंत्रिका स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं वयस्क मस्तिष्क 27 की तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से निकाला जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह cytometry और FACS परिपक्व न्यूरॉन्स 54, अस्थिकणिका 33, microglial 55, oligodendrocytes 56, या प्रसव के बाद मस्तिष्क के ऊतकों से endothelial कोशिकाओं 57 सहित विभिन्न सेल आबादी, यों का विश्लेषण और अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

चरणों में से किसी का अतिरिक्त प्रवाह cytometric readout को प्रभावित करने बिखराव गुणों का एक विशाल परिवर्तन करने के लिए ले जा सकता है के रूप में भले ही स्रोत का निर्धारण और permeabilization के जरूरत के लिए इष्टतम स्थितियों, प्रयोगात्मक प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना है। प्रोटोकॉल की क्षमता भी stabil पर निर्भर करता हैसतह अणुओं के अल्पसंख्यक permeabilization के बाद। यह अलग सतह epitopes डिग्री अलग करने की प्रक्रिया के हिस्से के रूप में सेल में गड़बड़ी से प्रभावित किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन या liberase-1 के साथ एंजाइमी कटाई, उदाहरण के लिए, Accutase या papain 7 के उपयोग की तुलना में कोशिका की सतह epitopes की लेकिन एक डिग्री कम करने के लिए एक सीमा को प्रभावित कर सकता है।

विशिष्ट epitopes एक अलग डिग्री करने के लिए एक ही इलाज प्रतिमान से प्रभावित किया जा सकता है: जबकि Vcam-1 (नाड़ी कोशिका आसंजन प्रोटीन-1; CD106) एक काफी संवेदनशील तरीके से कटाई, पृथक्करण, निर्धारण और permeabilization से प्रभावित किया जा सकता है, ICAM-1 ( कहनेवाला आसंजन अणु-1; CD54) प्रक्रिया 58 भर में संरक्षित एक और अधिक मजबूत अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित कर सकता है।

14 तंत्रिका जीव विज्ञान मानदंड में लागू किया गया है कि पहले या तो सतह 25,28 या intracellular प्रतिजन लेबलिंग, वहीं दोनों एम के संयोजन दृष्टिकोणउपन्यास तंत्रिका सतह प्रतिजन उम्मीदवारों उपज और अतिरिक्त cytometric readout के विकल्प प्रदान कर सकते हैं 38 ethods।

हम नियमित रूप से intracellular प्रतिजन धुंधला करने से पहले सतह धुंधला कदम का संचालन और मानव तंत्रिका कोशिका लाइनों की एक श्रृंखला का उपयोग neuropoiesis 38 के लिए सतह मार्करों के हमारे सेट का विस्तार करने की रणनीति है कि इस्तेमाल किया है। एंटीबॉडी और ऊष्मायन बार का अनुमापन, संबंधित प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता epitopes और प्रयोगात्मक प्रतिमान लक्ष्य होगा। नहीं सभी सेल लाइनों CFSE एकाग्रता का एक ही राशि के साथ एक समान फैशन में दाग के रूप में इसी तरह, CFSE एकाग्रता और धुंधला प्रति इस्तेमाल कोशिकाओं की राशि प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

(; फ्लोरिडा -1 डिटेक्टर ग्रीन चैनल), इसलिए अन्य चैनलों के लिए किसी भी प्रतिदीप्ति बाहर छलकते विशिष्ट प्रतिदीप्ति उत्सर्जन निर्धारित करने के लिए मुआवजा दिया जाना चाहिए CFSE एक चोटी पर 494 एनएम उत्तेजना और 521 एनएम के शिखर उत्सर्जन है। ऐसे CE के रूप में वैकल्पिक रंजकडालूँगा ट्रेस वायलेट (केबल टीवी), सेल प्रसार डाई eFluor 670 (सीपीडी), क्षितिज V550 के, क्षितिज V450 सफलतापूर्वक करने की कोशिश की और इसके बजाय CFSE 59,60 के लिए इस्तेमाल किया जा परीक्षण किया गया है।

प्रवाह cytometry में, यह पृष्ठभूमि से वास्तविक विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, सबसे उचित नियंत्रण सावधानी से चुना जाना है, और एंटीबॉडी विशिष्टता को रेखांकित करने के लिए एक गैर-तंत्रिका या अन्यथा नकारात्मक सेल लाइन का उपयोग शामिल हो सकते हैं (ताकि आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण 38,46 कहा जाता है)। प्रत्येक कोशिका के स्रोत के autofluorescence को ध्यान में रखा जाना चाहिए। निर्धारण नियंत्रण 13,46 लद सबसे तंत्रिका कोशिका का पता लगाने में काफी हद तक नगण्य माना जा सकता है।

सेल संस्कृति प्रणालियों में मनाया काफी भिन्नता (स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न विशेष रूप से उन) को देखते हुए और धुंधला प्रक्रिया की, जैविक प्रतिकृति के शामिल किए जाने की जोरदार सिफारिश की है। यह आनुवंशिक संवाददाताओं का उपयोग एक है कि ध्यान दिया जाना चाहिएअन्य तरीके से 61,62 cytometry के तंत्रिका प्रवाह का उपयोग करने के लिए। हाल ही में, Maroof एट अल। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 63 से अलग कॉर्टिकल तरह न्यूरोनल उप-जनसंख्या सॉर्ट करने के लिए एक Nkx2.1-GFP संवाददाता दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया।

एक आ रहा है-और-क्षेत्र ट्यूमर जीव विज्ञान और neurodegeneration 64 के रूप में विविध जैव चिकित्सा क्षेत्रों में तंत्रिका exosomes के अन्वेषण के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है, और exosomes का प्रवाह cytometry या मनका आधारित assays से उनके अलगाव इस खोज 65 के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है। संबंधित वीडियो प्रोटोकॉल के लिए 66 देखते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 94 सीडी मार्करों सतह एंटीजन इंट्रासेल्युलर एंटीजन फ्लो न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (FACS) CD24 CD54 CFSE छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल
तंत्रिका कोशिका प्रकार की सतह के लिए फ्लो प्रोटोकॉल और intracellular एंटीजन विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., … More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter