Introduction
La citometría de flujo se ha explotado ampliamente en la inmunología, hematología y oncología para definir poblaciones de células a través de las propiedades intrínsecas de dispersión, antígeno de superficie de la célula de expresión, y otros parámetros de fluorescencia 1-3. Nuestros conocimientos sobre el desarrollo linaje de sangre y la enfermedad son el resultado de un grado significativo de el refinamiento continuo de esta metodología después de su aplicación inicial de 4,5. Una mayor conciencia del potencial analítico cuantitativo y global de citometría de flujo ha animado recientemente su uso más generalizado en la investigación con células madre y puede permitir igualmente profunda progreso en un marco de tiempo más corto 6. Sin embargo, la aplicación de citometría de flujo para analizar específicamente y aislar poblaciones neuronales durante mucho tiempo ha sido percibido como un reto. En contraste con las células hematopoyéticas que existen naturalmente en suspensión, tipos de células neuronales se cosechan típicamente de fuentes excesivamente complejos que pueden incluir células gliales y varios other células circundantes, así como una intrincada red de neuronas de procesos que soportan. En consecuencia, la neurobiología todavía tiene que aplicar la versatilidad de citometría de flujo a su potencial completo en las rutinas diarias de investigación. Sin embargo, siempre y cuando una suspensión de una sola célula viable puede ser generado (y protocolos se han ideado y optimizado para este fin 7), citometría de flujo y células activadas por fluorescencia (FACS) puede ser considerado como un valioso elemento del repertorio analítico en neurobiología 8-11.
. Figura 1. Principio de análisis de citometría de flujo y componentes de un citómetro de flujo flujo citómetros comprenden tres sistemas principales: hidráulica, óptica y electrónica. Un flujo aerodinámico de células en suspensión (preparado a partir de tejido primario o en cultivo in vitro) se lleva a cabo por el FLUI vainad través enfoque hidrodinámico, restringiendo la muestra a su núcleo central. Las partes ópticas se componen de láseres que iluminan la corriente de células y filtros ópticos que dirigen la señal a los detectores apropiados. Las señales de luz detectadas se convierten en señales electrónicas, posteriormente procesadas por una computadora y visualizados en un monitor para el análisis de datos y conmutación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los usuarios de los métodos de citometría de flujo de ganancias de al menos un conocimiento básico de los fundamentos subyacentes, como bloques de construcción de un citómetro (para revisión ver 12,13; también ver Figura 1). Un rayo láser se cruza con una corriente de fluido hidrodinámicamente enfocada que contiene las células en suspensión, que a su vez pasan a través del haz de láser en 'solo archivo' uno tras otro. El interceptien de una célula (o cualquier otra partícula, para el caso) con los resultados de láser en la dispersión de la luz desde este punto de interrogación. La luz dispersada se puede detectar en la continuación de la dirección láser (dispersión hacia adelante, asociado con el tamaño de la partícula), así como perpendicular a su dirección (dispersión lateral; reflejando la granulosidad de la partícula / célula). Estas propiedades de dispersión antes mencionados no requieren etiquetado específico, por lo que una muestra sin etiqueta (o también restos celulares, burbujas de aire, etc.) generará una señal (evento) en la dispersión hacia adelante frente bivariado lado gráfico de dispersión comúnmente utilizado para gating inicial. Mediante el uso de los láseres y filtros específicos para el correspondiente espectros de excitación y emisión adecuadas, una célula puede ser analizada por su positividad, el nivel de intensidad, o ausencia de marcadores fluorescentes. La mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo se han centrado en la caracterización a través de antígenos de superficie celular. A diferencia de la lineag hematopoyéticoe, el linaje neural ha permanecido menos ampliamente definida de acuerdo con los patrones de expresión de superficie epítopo 5. Una ventaja de la explotación de los antígenos de superficie es que las células vivas pueden ser sometidos a la celda paradigmas de clasificación, tales como FACS. En contraste, la tinción de antígeno intracelular requiere etapas de fijación y permeabilización de mediar en la interacción-epítopo de anticuerpo, lo que impide aplicaciones posteriores que requieren células viables. De nota, estos enfoques aún permiten para numerosos ensayos cuantitativos 14, así como los análisis aguas abajo para ARN y expresión de la proteína 15. Hematología, inmunología y oncología han utilizado a menudo más de una docena de marcadores en conjunto para definir determinadas subpoblaciones 16. Además, la citometría de masa o CyTOF ahora se pueden utilizar para analizar hasta 30 parámetros simultáneamente 17,18.
Para aplicaciones de células madre neurales, así como cultivos primarios 14,19,20 la heterogeneidad de las células envitro es un fenómeno común 21-23. Las células no representan a la población diana de interés encarnan un factor potencialmente de confusión para la lectura experimental 24,25. Convenientemente, los diferentes subconjuntos celulares presentes dentro de una suspensión de células heterogénea tienen perfiles de expresión de antígeno diferentes (conocidas o aún para ser descifrados), que pueden ser utilizados para definir estos diferentes poblaciones. La citometría de flujo por lo tanto puede desempeñar un papel crucial en la resolución de la heterogeneidad celular y, de ese modo, facilitar aplicaciones biomédicas (ensayos in vitro, la terapia celular) y optimizar lectura cuantitativa, centrándose en el subconjunto más relevantes 24,26. Varias combinaciones del antígeno de superficie han sido identificados en los últimos años para permitir la cuantificación y el aislamiento de tipos específicos de células neuronales. Esto incluye CD133 para el enriquecimiento de células madre neurales 27, una combinación de los CD15 / CD24 / CD29 antígenos de superficie para el aislamiento de NSC, Differentiated neuronas y las células de la cresta neural 28 o CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para aislar los nervios y subconjuntos gliales 25, entre otras firmas 29,30. Más allá de las neuronas, marcadores gliales incluyen A2B5 31, CD44 25, NG2 32 y GLAST 33. Una publicación reciente ha explotado el cerebro medio marcador precursor floorplate CORIN 34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos en el trasplante de células Parkinson paradigmas 36. Moléculas de CD no son únicos marcadores, pero funcionalmente relevantes mediadores de las interacciones célula-célula y de la capacidad de una célula para responder a las señales de las moléculas de la matriz extracelular y factores de crecimiento 37. Una estrategia de mejorar aún más el arsenal de antígenos CD combinatorias para caracterizar el desarrollo del linaje neural es el uso de marcadores intracelulares conocidos para detectar y definir combinaciones de antígenos CD para un tipo de célula particular de interés. Hemos explotado recientemente un enfoque de este tipo e identificado CD49f - / CD200 altos patrones de expresión combinatoria como un enfoque novedoso para enriquecer subconjuntos neuronales a partir de sistemas de cultivo de células madre pluripotentes inducidas neuralmente diferenciados 38. Aquí, incluimos y discutimos este último protocolo (y variaciones opcionales de los mismos) en los que tinción de la superficie y la tinción intracelular se pueden utilizar simultáneamente para definir subpoblaciones de células neuronales por citometría de flujo.
Figura 2. Diagrama de flujo de opciones de protocolo experimental. La figura representa una representación esquemática de las principales etapas implicadas en el protocolo. Pasos opcionales (tinte CFSE o etiquetado antígeno intracelular) se indican con cajas de color gris claro. Después de la cosecha, es esencial para evaluar la viabilidad celular y número de suspensiones de células neurales antes de la tinción de la superficie celular. Positivo comoasí como controles negativos se deben incluir además de las muestras de interés. Las muestras pueden ser analizadas mediante análisis de citometría de flujo y / o se utilizan en los paradigmas de clasificación de células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Si bien hemos utilizado anteriormente anticuerpo primario en combinación con el anticuerpo secundario para la tinción intracelular 38, introducimos ahora etiquetado no covalente del anticuerpo primario a través de fragmentos Fab fluorescentes (etiquetado Zenon) como una ligera variación, reduciendo así las etapas de la manipulación de células 39. Por otra parte, como un ejemplo más de la versatilidad del protocolo, empleamos un etiquetado facultativo de un subconjunto experimental por carboxifluoresceına succinimidiléster (CFSE) antes de salir a la superficie tinción antígeno. Tal pre-etiquetado CFSE permite la comparación inmediata directa de dos líneas celulares o condiciones experimentales (CFSE marcado vs. sin etiqueta) dentro de un único tubo de muestra, la reducción de la varianza o sutiles diferencias en el tiempo de incubación y el ahorro de anticuerpo. CFSE es un colorante fluorescente establecido que se utiliza comúnmente para el seguimiento de la célula 40, en la proliferación de 41,42 y 43,44 códigos de barras experimentos. Por último, mientras que los pasos reales (FACS, separación celular inmunomagnética o immunopanning) no forman parte de este protocolo, en principio, la recolección y el etiquetado que se describen aquí hacen muestras de rendimiento que se pueden someter a la superficie de antígeno o aplicaciones intracelulares basado etiquetado clasificación 15 25,28.
Con este artículo, nos proponemos: resumir una superficie viable protocolo de tinción antígeno 25,28, resumir un protocolo para la detección de dianas intracelulares, así como la superficie combinada y el análisis del antígeno intracelular de 38 años, presentar un paso CFSE etiquetado tinte intracelular 41,45 como opción experimental para comcomparativa análisis de poblaciones de células neuronales, y resumir los enfoques para el análisis de citometría de flujo (controles apropiados 13,46, apertura de puerta estrategia y datos de presentación 47).
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Protocol
1. Neural cosecha celular
- Evaluación por microscopio:
- Antes de iniciar un experimento, comprobar el estado de la cultura con la de campo claro o microscopía de contraste de fase.
NOTA: Mientras que el tejido neural primaria obtenida de disecciones es, en principio, igualmente susceptibles de análisis de citometría de flujo 14,28, por favor, tenga en cuenta que el enfoque del protocolo está en las células obtenidas de los sistemas de células neurales in vitro.
- Antes de iniciar un experimento, comprobar el estado de la cultura con la de campo claro o microscopía de contraste de fase.
- Recolección de las células 7:
- Lave suavemente el plato / recipiente con células adherentes con Mg 2 + / Ca 2+ de buffer fosfato salino (PBS) libre a temperatura ambiente (por ejemplo, 5 ml por frasco T75, 3 ml por pocillo de placa de 6 pocillos, o 10 ml de placa de 10 cm).
NOTA: El PBS utiliza en todo el protocolo es Mg 2 + / Ca 2+ libre.- Para el ejemplo de vídeo, utilice un matraz T75 de células de neuroblastoma SH-SY5Y en 80% de confluencia. Aplicar etapas de lavado adicionales en los casos enescombros considerable está presente en el plato.
- Considere lavados con PBS 48 que contiene albúmina, Percoll o Ficoll 49 gradientes de centrifugación de suero y / o cuentas disponibles en el mercado 50,51. La eliminación de la mielina y otro lípido u otros contaminantes es crítica, especialmente cuando se utilizan fuentes de tejidos primarios adultos.
- Añadir precalentado (37 ° C) la sustitución de tripsina en un volumen apropiado que cubre toda la superficie del recipiente de cultivo de tejidos.
NOTA: Como alternativa, considere Accutase u otras opciones de digestión enzimática. Este paso crítico puede afectar negativamente a la superficie epítopo expresión (véase 7). - Incubar la placa / matraz a 37 ° C durante 2 - 5 min (dependiendo del tipo de célula) para permitir que las células se despeguen. Golpee suavemente el recipiente de cultivo de tejidos o al ras con una pipeta serológica para desalojar las células. Evitar el exceso de digestión (ya que esto puede causar la pérdida de células y la coagulación en los pasos posteriores).
- Quench la sustitución de la tripsina mediante la adición de dos veces el volumen de tampón de flujo (2% de FBS en PBS) y recoger las células en un tubo cónico de 15 ml.
- Tritura suavemente la suspensión celular usando una pipeta de microlitro (100 - 1000 l) o una pipeta de 5 ml serológica para preparar una suspensión de células individuales.
- Centrifugar las células a 220 xg durante 5 min a 25 ° C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante dejando el sedimento atrás.
- Vuelva a suspender el sedimento en un volumen apropiado de tampón de flujo, dependiendo del tamaño de la pastilla (por ejemplo, para una confluentes T75 matraz de células SH-SY5Y el rendimiento típico es de al menos 10 x 10 6 células, en cuyo caso las células se resuspenden en 5 ml de tampón de flujo).
NOTA: Si se observan trozos más grandes o de coagulación, se filtra a través de un 30 - 100 micras de malla.
- Lave suavemente el plato / recipiente con células adherentes con Mg 2 + / Ca 2+ de buffer fosfato salino (PBS) libre a temperatura ambiente (por ejemplo, 5 ml por frasco T75, 3 ml por pocillo de placa de 6 pocillos, o 10 ml de placa de 10 cm).
- El recuento de células 52:
- Transferir una pequeña alícuota de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga y se diluye en una proporción definida en un volumen de trypan azul o un colorante de viabilidad alternativa antes de la transferencia a un hemocitómetro o sistema de conteo de células automatizado.
- Diluir la suspensión celular a una concentración de 1 x 10 6 células viables / ml mediante la adición del volumen apropiado de tampón de flujo o PBS con 0,1% de BSA (si proceder con el etiquetado CFSE).
NOTA: yoduro de propidio, 7-aminoactinomicina D, anexina V y kits de ensayo de viabilidad pueden solucionar disponibles comercialmente representan opciones alternativas con el fin de evaluar la viabilidad de las células. Además, ensayos de apoptosis usando la caspasa-3 de fluorescencia como se describió anteriormente 53 puede ser utilizado. Canales fluorescentes serán "ocupadas" por estos reactivos que pueden limitar las opciones para los pasos posteriores si se incluye en todas las muestras.
2. intracelular Tinte Etiquetado Usando CFSE (Figura 3)
- Diluir la CFSE a una concentración de stock deseada que puede ser utilizado fácilmente.
NOTA: Para estos experimentos una concentración madre deSe utilizó 0,01 mM. Determinar la concentración de trabajo óptimo de CFSE empíricamente. - Añadir 10 l de solución 0,01 mM CFSE por ml de células (Sección 1.3.2, la concentración de 1 x 10 6 células / ml en PBS + BSA al 0,1%) para una concentración final de 0,1 mM. Vórtice brevemente para mezclar bien.
NOTA: Las concentraciones CFSE utilizados aquí son aproximadamente diez veces menor que las que comúnmente aplicados en ensayos de proliferación, por lo tanto, la toxicidad celular del colorante es mínima. No observamos efectos negativos sobre la viabilidad celular. - Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con agitación constante (200 rpm). Proteger de la luz.
- Se inactiva el colorante mediante la adición de 5 volúmenes de tampón de flujo a los tubos. Centrifugar a 94 xg durante 5 min a TA.
- Descartar el sobrenadante dejando el sedimento atrás. Volver a suspender las células con 5 volúmenes de tampón de flujo.
- Centrifugar a 94 xg durante 5 min a TA. Descartar el sobrenadante y volver a suspender las células en tampón de flujo a una concentración de 1 x 10 6 células / ml.
- Añadir un número igual de células no teñidas de interés para la suspensión de células manchadas. Proceder a la superficie protocolo de tinción de antígeno (Sección 3).
Figura 3. Detección de la expresión diferencial de antígeno de superficie de CD entre dos líneas de células a través de células de neuroblastoma SH-SY5Y CFSE tinte etiquetado. Son pre-marcado con CFSE para su posterior identificación en comparación con fibroblastos BJ no marcados. Co-tinción de la muestra mixta (paneles de la derecha) con marcadores de superficie CD24 o CD54 (tanto conjugado con APC) demuestra que las líneas celulares son fácilmente distinguibles debido a la tinción CFSE (flechas = SH-SY5Y; puntas de flecha = BJ fibroblastos). La mayoría de las células SH-SY5Y expresan CD24 pero no CD54 (ICAM-1). En contraste, los fibroblastos BJ (CFSE-negativo) son positivos para CD54 pero en gran medida negativa para CD24.Objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. celular tinción de la superficie
- Tubos de etiquetas incluidas las muestras y los controles críticos (ver Tabla 1).
| Tubo no. | Nombre de la muestra | Antígeno-fluoróforo | Dilución |
| 1 | Células sin teñir | - | |
| 2 | Manchada Individual | CD24-APC | 1:50 |
| 3 | Manchada Individual | Tuj1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2000 |
| 4 | Doble manchada | CD24-APC | 1:50 |
| Tuj1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2000 | ||
| 5 | Manchada Individual | Secundaria solamente: Alexa fluor 488 nm | 1: 2000 |
Tabla 1. L ist de tubos para ser incluido en un flujo típico de citometría de experimento. La tabla muestra un conjunto mínimo de tubos de muestra requerido para un experimento de co-tinción descrito en este artículo de vídeo. Un experimento ideales debe incluir todos los controles necesarios (controles de compensación negativos y positivos, así como) para la correcta interpretación de los resultados obtenidos.
- Añadir 100 l de suspensión celular (de la Sección 2.7 o 1.3.2) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Asegúrese de que un mínimo de 0,1 x 10 6 células presentes por cada 100 l de suspensión celular. - Añadir fluoróforo anticuerpo conjugado a la muestra a una dilución apropiada.
NOTA: Determinar la dilución de trabajo para cada anticuerpo antes del experimento. Ver Tabla 2 para una lista of antígenos de superficie neural.
| Antígeno | Tipo de la célula | Referencia |
| CD15 | Las células madre neurales | [28, 67] |
| CD24 | Las células neuronales | [28, 68] |
| CD29 | Las células madre neurales | [28, 69, 70] |
| CD44 | Las células gliales | [25] |
| CD49f | Las células madre neurales | [38] |
| CD56 (NCAM) | Las células neuronales | [71] |
| CD133 | Las células madre neurales | [27] |
| CD184 | Las células madre neurales y células gliales | [25] |
| CD200 | Las células neuronales | [38] |
| CD271 | Las células madre de la cresta neural | |
| A2B5 | Las células gliales | [31] |
| CORIN | Precursores dopaminérgicos | [35, 36] |
| FORSE1 | Las células madre neurales (NSC) | [72] |
| GLAST | Las células gliales | [33] |
| NG2 | Las células gliales | [32] |
Tabla 2. Selección de los antígenos de superficie neuronales. Esta tabla proporciona una lista de los epítopos de superficie encontró que se expresa por varios tipos de células neuronales para ejemplificar el panel cada vez mayor de los antígenos de superficie utilizados para caracterizar el linaje neural. Tenga en cuenta que esta selección está lejos de ser completa y que la mayoría de estos marcadores también se expresan por una serie de otras células neuronales y no neuronales. En consecuencia, se requerirá una combinación de varios marcadores para definir y aislar los subconjuntos neuronales indicadas mejor.
- Incubar durante 30 min en un agitador orbital (200 rpm) en la oscuridad.
- Tampón de lavado de flujo
- Añadir 1 ml de tampón de flujo a los tubos. Se centrifuga a 380 g durante 4 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante dejando el sedimento atrás.
- Repita el paso de lavado de nuevo.
- Después del segundo lavado, decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en tampón de flujo a un volumen final de 100 microlitros.
- Utilice la muestra para el análisis de citometría de flujo. Como alternativa, proceda con la Sección 4 y 5.
NOTA: Si las células se deben ordenar y poner de nuevo en la cultura post-FACS (es decir, la suspensión de células viables sin fijación o permeabilización), aplicar técnicas asépticas durante la cosecha, las manchas y las medidas analíticas.
4. Fijación y permeabilización 38
- Fijación utilizando paraformaldehído (PFA):
- Prepare el buffer de fijación que contienen 2% PFA en PBS.
- Añadir 500 l de tampón de fijación a 100 l de suspensión celular.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador orbital (100 rpm) en la oscuridad.
- Prepare el buffer de fijación que contienen 2% PFA en PBS.
- PBS de lavado:
- Añadir 1 ml de PBS al tubo. Se centrifuga a 380 g durante 3 min a 4 ° C.
- Desechar / decantar el sobrenadante dejando aproximadamente 100 l en el tubo.
- La permeabilización con Tween-20:
- Preparar tampón de permeabilización que contiene 0,7% de Tween-20 en PBS.
- Añadir 500 l de tampón de permeabilización a 100 l de suspensión celular.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador orbital (100 rpm) en la oscuridad.
- Se lavan las células una vez con PBS (como se describe en la Sección 4.2) y eliminar el sobrenadante de los tubos completely, dejando sólo el pellet atrás.
5. intracelular de antígeno de tinción 38 (Figura 4)
- Preparación de las soluciones de anticuerpos primarios:
- Diluir los anticuerpos primarios en tampón de dilución que contiene 1% de albúmina de suero bovino, 10% de suero (por ejemplo, burro o suero de cabra normal) y 0,5% de Tween-20 en PBS.
NOTA: Elija el suero para ser utilizados en función de la especie de los anticuerpos secundarios se plantearon. - Alternativamente, utilizar Zenon etiquetado fluoresceína del anticuerpo primario de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar 1 mg de anticuerpo primario en PBS a una dilución apropiada (volumen total ≤ 20 l).
- Añadir 5 l de reactivo de Zenon fluoresceína IgG etiquetado (Componente A) a la solución de anticuerpo.
- Incubar la mezcla durante 5 min a TA.
- Añadir 5 l de Zenon reactivo de bloqueo (Componente B) a la mezcla de reacción.
- Incubarla mezcla durante 5 min a TA. Aplicar el anticuerpo a la muestra dentro de 30 min.
- Diluir los anticuerpos primarios en tampón de dilución que contiene 1% de albúmina de suero bovino, 10% de suero (por ejemplo, burro o suero de cabra normal) y 0,5% de Tween-20 en PBS.
- Tinción de anticuerpos primario:
- Añadir 100 l de la solución de anticuerpo primario al sedimento celular y se tritura suavemente para mezclar.
- Alternativamente, añadir Zenon fluoresceína anticuerpo marcado a la suspensión celular a la dilución apropiada.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador orbital (200 rpm), protegido de la luz. Se lavan las células una vez con PBS (como se describe en la Sección 4.2) y eliminar el sobrenadante de los tubos completamente, dejando sólo el pellet atrás.
- Tinción de anticuerpos secundaria (no es necesario para los anticuerpos Zenon fluoresceína etiquetados):
- Diluir la secundaria de anticuerpos en PBS a una concentración apropiada.
- Añadir 100 l de la solución de anticuerpo secundario al sedimento celular y se tritura suavemente para mezclar. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador (200 rpm) en la oscuridad.
- Lávese las muestras dos veces con PBS (como se describe en la Sección 4.2).
- Lavar una vez con tampón de flujo (ver sección 3.5).
- Vuelva a suspender las células en aproximadamente 150 l de tampón de flujo y analizar en el citómetro de flujo.
Figura 4. Co-tinción de la superficie y las proteínas intracelulares. Citometría de flujo de datos es un ejemplo de una comparación entre primaria + secundaria basada en anticuerpos frente a la tinción intracelular basado fluoresceína Zenon en combinación con tinción de la superficie. Positividad exclusiva en el eje y (cuadrante superior izquierdo) y el eje x (cuadrante inferior derecho) muestra células teñidas para MAP2 y CD24, respectivamente. Después de co-tinción, MAP2 compartida y la expresión CD24 pueden verse en el cuadrante superior derecho (paneles de la derecha). Comparación de utilizarAlexa fluor 488. (Arriba; AF488) versus Zenon fluoresceína (abajo) para rendimientos MAP2-etiquetado resultados similares Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Análisis de citometría de flujo
- Realizar un análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la finalización del protocolo de tinción usando un citómetro de flujo con filtros adecuados para la detección de la señal. Utilice 488 nm láser rojo azul nm y 640 con FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), y filtros FL-4 (675/25) de paso de banda.
- Configure puertas principales basados en la dispersión frontal y lateral con exclusión de los desechos y células muertas.
- Establecer puertas de fluorescencia para la superficie y el antígeno intracelular a ≤0.5% sobre la base de las muestras y la compensación no teñidas de solapamiento espectral utilizando controles manchadas individuales.
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Representative Results
El protocolo que aquí se presenta permite enfoques versátil experimentales (Figura 2). En su versión más corta (pasos 1, 3 y 6), que puede considerarse una guía para la tinción simple de los antígenos de superficie. En su forma más compleja, una serie de paradigmas co-etiquetado con una gama de antígenos intracelulares puede ser perseguido (pasos opcionales 2 y / o 4 a 5). Por otra parte, el paso CFSE etiquetado ejemplifica su utilidad para la célula de etiquetado / seguimiento de las subpoblaciones en estudios de interacción célula-célula o flujo experimentos de citometría de código de barras (paso 2). Poblaciones de células viables (obtenidos a partir de los pasos 2 y / o 3) son susceptibles a la celda paradigmas (FACS) y análisis de aguas abajo, incluyendo el cultivo de células post-especie. Por otra parte, la tinción de antígenos intracelulares y de superficie combinados (pasos 3 a 5)proporciona oportunidades de lectura de análisis en su propio derecho. Por ejemplo, la identificación de co-localización de ciertos antígenos CD en subconjuntos particulares de las poblaciones de células neuronales (aplicadas por nosotros en Turac et al 38 para identificar CD49f -. / CD200 altas firmas para neuronal FACS). Estos y otros ejemplos de marcadores neuronales se proporcionan en la Tabla 2, de los cuales CD15, CD29, CD49f y FORSE1, se asocian principalmente con células madre neurales, y CD24 y CD56 son abundantes en las células neuronales. Si bien algunos de estos marcadores son exclusivos, diferentes intensidades de tinción y análisis de expresión multivariante pueden ayudar a identificar conjuntos de marcadores específicos para el análisis y el aislamiento de determinadas subpoblaciones neuronales.
La Figura 3 es un ejemplo de los resultados típicos obtenidos a partir de la utilización combinatoria de colorante intracelular y tinción de la superficie. Los datos muestran cómo dos poblaciones de células diferentes se pueden distinguir fácilmente ina mezcla de la muestra debido a la etiquetado previo de una de las poblaciones. Aquí, las células de neuroblastoma SH-SY5Y fueron marcadas con CFSE, y la fluorescencia de exposiciones en el canal verde (FL1; eje y) que es claramente separadas de la segunda población sin teñir, en este caso fibroblastos BJ. Mientras fibroblastos característica bien establecida (CD54) y neural (CD24) marcadores se muestran (presente en sus respectivas poblaciones objetivo; FL2 o fluorescencia FL4, respectivamente; eje x) enfoques análogos pueden ser explotados para la detección de antígenos adicionales no identificados. Además, los efectos de las interacciones célula-célula de dos (o más) subpoblaciones que fueron etiquetados experimentos de co-cultivo antes se pueden estudiar de esta manera.
La Figura 4 muestra las células no teñidas SH-SY5Y, así como muestras teñidas para CD24-APC y / o el antígeno MAP2 neuronal intracelular (canal FITC) después de la fijación y permeabilización. Como este último puede afectar a las propiedades de dispersión, bafluorescencia ckground y tinción epítopo superficie, las parcelas sirven para documentar la expresión superficial de CD24 mantenido neuronal después de la tinción intracelular. Además, se muestra la co-localización de la tinción neuronal MAP2 en la fracción CD24-positivo. Es fundamental para garantizar la detección fiel del antígeno de superficie en comparación con la expresión en superficie CD24 en células vivas. Por otra parte la especificidad de la detección intracelular más de fondo, la unión de anticuerpos no específicos y autofluorescencia deben ser confirmadas. La detección de antígenos intracelulares a través de estrategias basadas en anticuerpos primarios y secundarios + Zenon fluorescencia de base o produce resultados comparables, lo que proporciona una justificación para considerar este enfoque eficiente en el tiempo más (omitiendo el paso 5.3). Mientras que el protocolo es robusto y permite la detección combinada de una gama de superficie y los marcadores intracelulares con limitada fluorescencia de fondo, se recomienda a adherirse estrechamente a los tiempos de incubación y etapas de lavadoproporcionado en el protocolo. Por otra parte, es aconsejable para analizar al menos tres repeticiones experimentales independientes y tomar nota de que la intensidad de etiquetado y la superficie de la estabilidad puede ser epítopo-marcador específico y puede requerir una mayor optimización. Una vez establecido para un objetivo particular, a pesar de que carecen de la capacidad de analizar las características morfológicas, el flujo de detección de citometría de la superficie y los antígenos intracelulares o antígenos intracelulares solo es compatible con microscopía de fluorescencia convencional.
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Discussion
El protocolo presentado aquí está bien establecido para los cultivos de células neurales derivadas de células madre humanas, pero se puede aplicar igualmente a otras fuentes de células neuronales incluyendo tejido primario o líneas celulares neuronales. Además de las fuentes embrionarias, las células madre o progenitoras neurales pueden ser extraídos de las regiones neurogénicas de cerebro adulto de 27. Además, la citometría de flujo FACS y se pueden explotar para cuantificar, analizar y aislar diversas poblaciones de células incluyendo neuronas maduras 54, 33, astroglia microglial 55, 56, oligodendrocitos o células endoteliales 57 de tejido de cerebro postnatal.
Independientemente de la fuente, las condiciones óptimas para la fijación y permeabilización de la necesidad que se determinarán para cada tipo de célula experimentalmente, como exceso de cualquiera de los pasos podría dar lugar a un cambio masivo de las propiedades de dispersión que afectan a la lectura de citometría de flujo. Eficiencia del protocolo depende también de la stabildad de las moléculas de la superficie publicar permeabilización. Cabe señalar que los diferentes epítopos de superficie pueden ser afectados por la manipulación de células como parte del procedimiento para diversos grados. También la recolección de reemplazo enzimático con tripsina o Liberase-1, por ejemplo, puede afectar a una gama de epítopos de la superficie celular, pero en un grado menor en comparación con el uso de Accutase o papaína 7.
Epítopos específicos pueden verse afectados por el mismo paradigma de tratamiento en un grado variable: mientras que VCAM-1 (proteína de adhesión celular vascular-1; CD106) puede verse afectada por la cosecha, la disociación, la fijación y permeabilización de una manera muy sensible, ICAM-1 ( molécula de adhesión intercelular-1; CD54) puede mostrar un patrón de expresión más robusto conservado durante todo el procedimiento 58.
Si bien anteriormente ya sea superficial o 25,28 etiquetado antígeno intracelular 14 se han aplicado en los paradigmas neurobiología, enfoques combinando métodos 38 puede producir nuevos candidatos de antígenos de superficie neuronal y ofrecer opciones de citometría de lectura adicionales.
Rutinariamente realizamos el paso de tinción de la superficie antes de la tinción del antígeno intracelular y hemos utilizado esa estrategia para ampliar nuestro conjunto de marcadores de superficie para neuropoiesis 38 usando una variedad de líneas de células neurales humanas. Necesitará Titulación de anticuerpos y los tiempos de incubación para ser optimizado para los respectivos tipos de células, el objetivo de epítopos y paradigma experimental. Del mismo modo, la concentración de CFSE y la cantidad de células usadas por tinción deben ser optimizados para cada línea celular, ya que no todas las líneas celulares se tiñen de una manera idéntica con la misma cantidad de la concentración de CFSE.
CFSE tiene un pico de excitación de 494 nm y emisión máxima de 521 nm (canal verde; FL-1 detector), por lo tanto, cualquier desbordamiento de fluorescencia a otros canales tiene que ser compensado para determinar la emisión de fluorescencia específica. Tintes alternativos como Cell Traza Violeta (CTV), proliferación de células tinte eFluor 670 (CPD), Horizonte V550, Horizonte V450 ha sido probado para ser utilizado en lugar de 59,60 CFSE éxito.
En la citometría de flujo, es fundamental para determinar la señal fluorescente específica real de fondo. Por lo tanto, los controles más apropiados tienen que ser elegidos cuidadosamente, y pueden incluir el uso de una línea de células no neuronales o de otra manera negativa para subrayar la especificidad del anticuerpo (denominado controles negativos internos 38,46). Autofluorescencia de cada fuente de célula debe ser tenida en cuenta. Isotipo controles pueden ser considerados en gran parte prescindible en la detección de células más neural paradigmas 13,46.
Dada la considerable variación observada en los sistemas de cultivo de células (en particular las derivadas de células madre) y del procedimiento de tinción, la inclusión de réplicas biológicas es muy recomendable. Cabe señalar que el uso de reporteros genéticos es unaotra manera de utilizar el flujo neuronal citometría de 61,62. Recientemente, Maroof et al. Utiliza un enfoque reportero-Nkx2.1 GFP para ordenar distintas subpoblaciones neuronales corticales similares a partir de células madre embrionarias humanas 63.
Un campo de up-and-coming está representada por la exploración de los exosomas neuronales en áreas biomédicas tan diversos como la biología del tumor y la neurodegeneración 64, y citometría de flujo de exosomas o su aislamiento mediante ensayos basados en perlas proporciona herramientas importantes para esta búsqueda 65. Para el protocolo video relacionado ver 66.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) |  Life Technologies |
11330057 | |
| DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies |
14190169 | |
| Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies |
10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies |
11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies |
12604013 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies |
15250061 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth |
335.3 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe |
K41-001 | |
| Tween-20 Detergent | Calbiochem |
655205 | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience |
65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem |
A1584 | |
| Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore |
SCGPU02RE | |
| Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC |
156367 | |
| Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC |
156499 | |
| Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One |
188271 | |
| Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One |
227261 | |
| Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen |
S03710150 | |
| Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning |
4125 | |
| Pipet tips (1-200 µl) | Corning |
4126 | |
| Pipet tips (100-1000 µl) | Corning |
4129 | |
| Serological pipets, 5 ml | Corning |
4051 | |
| Serological pipets, 10 ml | Corning |
4101 | |
| Serological pipets, 25 ml | Corning |
4251 | |
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt |
72,699 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One |
616201 | |
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt |
72,695,500 | |
| Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience |
17-0247-42 | Working dilution 1:50 |
| Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience |
12-0549-42 | Working dilution 1:50 |
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance |
PRB-435P | Working dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies |
A21206 | Working dilution 1:2,000 |
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies |
Z-25342 | |
| Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld |
0640010 | |
| Vortex | Scientific Industries |
G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf |
5355 000.001 | |
| Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) |
653118 | |
| Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab |
91-PSPIN-24R | |
| Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph |
543-12310-00 | |
| Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich |
4480-50 | |
| Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific |
51026640 | |
| CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific |
51026331 | |
| Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences |
158320 | |
| Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss |
451212 | |
| Pipet controller, accu-jet pro | Brand |
26303 | |
| Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson |
F144563 | |
| Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson |
F144565 | |
| Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson |
F144566 |
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