Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Flödescytometri protokoll för Surface och intracellulära Antigen Analyser av neurala celltyper

Published: December 18, 2014 doi: 10.3791/52241

Introduction

Flödescytometri har i stor utsträckning utnyttjats i immunologi, hematologi och onkologi att definiera cellpopulationer via inneboende spridningsegenskaper, cellytantigen uttryck och andra fluorescensparametrar 1-3. Våra insikter blodslinje utveckling och sjukdom är ett resultat av en betydande grad av kontinuerlig förfining av denna metod efter dess genomförande 4,5. Ökad medvetenhet om den kvantitativa och övergripande analytisk potential flödescytometri har nyligen uppmuntrat dess mer utbredd användning inom stamcellsforskning och kan möjliggöra på liknande djupgående framsteg på kortare tidsram 6. Däremot har tillämpningen av flödescytometri att specifikt analysera och isolera neurala populationer länge uppfattats som en utmaning. I motsats till hematopoetiska celler som naturligt finns i suspension, är neurala celltyper vanligen skördas från alltför komplicerade källor som kan innehålla glia och olika other omgivande celler såväl som ett intrikat nätverk av processbärande neuroner. Följaktligen måste neurobiologi ännu inte genomfört mångsidighet flödescytometri till dess fullständiga potential i dagliga forskningsrutiner. Men så länge som kan alstras en livskraftig enkelcellsuspension (och protokoll har utarbetats och optimerats för detta ändamål 7), flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan anses vara en värdefull del av den analytiska repertoar i neurobiologi 8-11.

Figur 1
. Figur 1. Principen om flödescytometrianalyser och komponenter i en flödescytometer flödescytometrar omfattar tre huvudsystem: flödeskunskap, optik och elektronik. En strömlinjeformat flöde av celler i suspension (framställd från primär vävnad eller odling in vitro) åstadkommes genom manteln fluid via hydrodynamisk fokusering, begränsa urvalet till dess centrum kärna. De optiska delarna är sammansatta av lasrar som belyser flödet av celler och optiska filter som dirigerar signalen till lämpliga detektorer. Ljussignalerna detekterade omvandlas till elektroniska signaler, därefter behandlas av en dator och visualiseras på en bildskärm för dataanalys och gating. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Användare av flödescytometriska metoder vinst från åtminstone en grundläggande förståelse för de underliggande fundamenta, inklusive en cytometer byggstenar (för översikt se 12,13; se även figur 1). En laserstråle skär med en hydrodynamiskt fokuserad fluidic ström som innehåller celler i suspension, vilket i sin tur passerar genom laserstrålen i "enstaka fil" en efter en. Den interceptipå av en cell (eller någon annan partikel, för den delen) med laserresulterar i spridning av ljus från denna identifieringspunkt. Spritt ljus kan detekteras i fortsättning av laserriktningen (framåtspridning, associerad med storleken av partikeln), såväl som vinkelrätt mot dess riktning (sidospridning, vilket återspeglar granulosity av partikeln / cell). Dessa ovannämnda spridningsegenskaper inte kräver särskild märkning, vilket är anledningen till att en omärkt prov (eller också cellrester, luftbubblor, etc.) kommer att generera en signal (event) på bivariata framåtspridning mot sidopunktdiagram som vanligen används för inledande gating. Genom att använda lämpliga lasrar och filter specifika för motsvarande excitations- och emissionsspektra, kan en cell analyseras för dess positivitet, grad av styrka, eller frånvaro av fluorescerande markörer. Majoriteten av flödesapplikationer cytometrisk har fokuserat på karakterisering via cellytantigener. Till skillnad från det hematopoietiska lineage, har det neurala härstamning förblivit mindre utsträckning definieras enligt ytan epitop uttrycksmönster 5. En fördel med att utnyttja ytantigener är att levande celler kan utsättas för cellsortering paradigm såsom FACS. Däremot kräver intracellulär antigen färgning fixering och permeabilisering steg för att medla epitop-antikroppsinteraktion, utgör hinder tillämpningar efter som kräver levande celler. Notera sådana metoder kan fortfarande för många kvantitativa analyser 14 samt analyser nedströms för RNA och proteinuttryck 15. Hematologi, immunologi och onkologi har ofta använt mer än ett dussin markörer tillsammans för att definiera särskilda subpopulationer 16. Dessutom kan mass cytometri eller CyTOF nu användas för att analysera upp till 30 parametrar samtidigt 17,18.

För neurala stamceller samt primära kulturer 14,19,20 heterogeniteten av celler ivitro är ett vanligt fenomen 21-23. Cellerna inte representerar målgruppen intressanta förkroppsligar ett potentiellt confounding faktor för experimentell avläsning 24,25. Bekvämt, de olika cellulära delmängder som finns inom en heterogen cellsuspension bära distinkta (kända eller ännu Att att dechiffreras) antigen uttryck profiler, som kan användas för att definiera dessa olika populationer. Flödescytometri kan därmed spela en avgörande roll för att lösa cellulär heterogenitet och därigenom underlätta biomedicinska tillämpningar (in vitro-analyser, cellterapi) och optimera kvantitativa avläsning genom att fokusera på de mest relevanta delmängd 24,26. Olika ytantigen kombinationer har identifierats under de senaste åren för att göra det möjligt för kvantifiering och isolering av specifika neurala celltyper. Detta inkluderar CD133 för anrikning av neurala stamceller 27, en kombination av CD15 / CD24 / CD29 ytantigener för isolering av NSC, differentieringted neuron och neurallist celler 28 eller CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 att isolera neurala och gliaceller delmängder 25, bland annat signaturer 29,30. Bortom neuroner, gliaceller markörer inkluderar A2B5 31, CD44 25, NG2 32 och GLAST 33. En färsk publikation har utnyttjat mitthjärnan floorplate gångaren markör CORIN 34,35 att anrika dopaminerga prekursorer vid Parkinsons celltransplantation paradigm 36. CD-molekyler är inte bara markörer, men funktionellt relevanta förmedlare av cell-cell interaktioner och i en cell förmåga att reagera på signaler från extracellulära matrixmolekyler och tillväxtfaktorer 37. En strategi för att ytterligare förbättra den arsenal av kombinatoriska CD antigener att karakterisera neurala härstamning utveckling är att använda kända intracellulära markörer för att screena för och definiera CD antigenkombinationer för en viss celltyp av intresse. Vi har nyligen utnyttjat ett sådant tillvägagångssätt och identifierade CD49f - / CD200 höga kombiuttrycksmönster som en ny metod för att berika neuronala delmängder från neuralt differentierade inducerad pluripotenta stamceller kultursystem 38. Här inkluderar vi och diskuterar det senare protokollet (och valfria variationer därav) där färgning yta och intracellulär färgning kan användas samtidigt för att definiera neurala cellsubpopulationer med flödescytometri.

Figur 2
Figur 2. Flödesdiagram av experimentella protokollalternativ. Figuren visar en schematisk representation av de viktigaste stegen i protokollet. Valfria steg (CFSE dye eller intracellulär antigen märkning) anges med ljusgrå lådor. Efter skörden, är det viktigt att bedöma lönsamheten och cell antal neurala cellsuspensioner före cellytan färgning. Positivt somsåväl som negativa kontroller måste ingå förutom de prover av intresse. Prover kan analyseras genom flödescytometrisk analys och / eller används i cellsortering paradigm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Medan vi tidigare har använt primära antikroppen i kombination med sekundär antikropp för intracellulär färgning 38, introducerar vi nu icke kovalent märkning av den primära antikroppen via fluorescerande Fab-fragment (Zenon märkning) som en liten variation, vilket minskar stegen cellmanipulation 39. Dessutom som ytterligare ett exempel på protokollet mångsidighet, anställer vi en valfri märkning av en experimentell delmängd av karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) före ytan antigen färgning. Sådana CFSE pre-märkning möjliggör omedelbara direkt jämförelse av två cellinjer eller experimentella förhållanden (CFSE-märkta vs. omärkt) inom en enda provrör, minska variansen eller subtila skillnader i inkubationstid och spara antikropp. CFSE är en etablerad fluorescerande färgämne som ofta används för att spåra cell 40, i spridnings 41,42 och streckkoder experiment 43,44. Slutligen medan faktiska sorteringssteg (FACS, immunomagnetisk cellseparations eller immunopanning) är inte en del av detta protokoll, i princip, avverknings- och märkningsförfaranden som beskrivs här gör avkastnings prover som kan utsättas för ytan antigen- eller intracellulära märkning baserade sorterings applikationer 15 25,28.

Med denna artikel vill vi: sammanfatta en livskraftig ytantigen färgningsprotokollet 25,28, sammanfatta ett protokoll för detektion av intracellulära mål samt kombinerad yta och intracellulär antigenanalys 38, presentera en intracellulär CFSE färgämne märkning steg 41,45 som en experimentell alternativ för comjämförande analyser av neurala cellpopulationer, och sammanfatta metoder för att flödescytometrianalyser (lämpliga kontroller 13,46, grind strategi och presentation av data 47).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neural Cell Skörd

  1. Bedömning av mikroskop:
    1. Före initiering ett experiment, kontrollera status för kulturen med ljusfält eller faskontrastmikroskopi.
      OBS: Även om primär nervvävnad erhållen från dissektioner är i princip lika mottagliga för flödescytometrisk analys 14,28, observera att protokollet fokus ligger på celler från in vitro neurala cellsystem.
  2. Skörd av celler 7:
    1. Försiktigt tvätta skålen / kolv av vidhäftande celler med Mg2 + / Ca2 + fri fosfat-buffrad saltlösning (PBS) vid RT (t.ex., 5 ml för T75-flaska, 3 ml per brunn under 6-brunnar, eller 10 ml för 10 cm skål).
      OBS: PBS används i hela protokollet är Mg2 + / Ca2 + fri.
      1. För video exempel använda en T75 kolv SH-SY5Y neuroblastomaceller vid 80% sammanflytning. Applicera ytterligare tvättsteg i de fall däravse skräp är närvarande i skålen.
      2. Tänk tvättar med serumalbumininnehållande PBS 48, Percoll eller Ficoll 49 centrifuge gradienter och / eller kommersiellt tillgängliga pärlor 50,51. Avlägsnande av myelin och annan lipid eller andra föroreningar är kritisk, särskilt när vuxna primära vävnadskällor används.
    2. Lägg förvärmda (37 ° C) trypsin ersättningen vid en lämplig volym som täcker hela ytan av vävnadsodlingskärlet.
      OBS: Alternativt anser Accutase eller andra enzymatiska rötningsalternativ. Denna kritiska steget kan påverka negativt ytan epitop uttryck (se 7).
    3. Inkubera skålen / kolven vid 37 ° C under 2-5 minuter (beroende på celltypen) för att tillåta cellerna att lossna. Knacka försiktigt på vävnadsodlingskärlet eller i nivå med en serologisk pipett för att få bort cellerna. Undvik över matsmältningen (eftersom detta kan orsaka förlust cell och koagulering vid senare steg).
    4. Quench trypsin utbyte genom att tillsätta två gånger volymen av buffertflöde (2% FBS i PBS) och samla upp cellerna i en 15 ml koniska rör.
    5. Mal sönder försiktigt cellsuspensionen med hjälp av en mikroliter pipett (100 - 1000 l) eller en 5 ml serologisk pipett för att förbereda en enda cell suspension.
    6. Centrifugera cellerna vid 220 xg under 5 minuter vid 25 ° C. Försiktigt aspirera supernatanten lämnar pellet bakom.
    7. Åter avbryta pelleten i en lämplig volym av buffertflöde, beroende på storleken av pelleten (t.ex. för en sammanflytande T75 kolv SH-SY5Y celler den typiska avkastningen är minst 10 x 10 6 celler, i vilket fall cellerna resuspenderas i 5 ml buffertflöde).
      OBS: Om större bitar eller koagulering observeras, filtrera genom ett 30-100 ìm mesh.
  3. Cellräkning 52:
    1. Överför en liten alikvot av cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör och späd vid ett definierat förhållande i en volym av trypan blå eller en alternativ livskraft färgämne före överföring till en hemocytometer eller automatiserad cellräkningssystem.
    2. Späd cellsuspensionen till en koncentration av 1 x 10 6 livskraftiga celler / ml genom att tillsätta rätt volym buffert flöde eller PBS med 0,1% BSA (om du fortsätter med CFSE märkning).
      OBS: Propidiumjodid, 7-aminoactinomycin D, annexin V och kommersiellt tillgängliga ställbara livskraft analyssatser representerar alternativ för att bedöma lönsamheten av celler. Också apoptosanalyser med användning av kaspas-3-fluorescens som beskrivits tidigare 53 kan användas. Fluorescerande kanaler kommer att "ockuperat" av dessa reagenser som kan begränsa alternativen för efterföljande steg om de ingår i alla prover.

2. Intracellulär Dye Labeling Använda CFSE (Figur 3)

  1. Späd CFSE till en önskad förrådskoncentration som lätt kan användas.
    OBS: För dessa experiment en aktie koncentration av0,01 mM användes. Bestäm den optimala arbets koncentrationen av CFSE empiriskt.
  2. Lägg 10 pl av 0,01 mM CFSE lösning per ml celler (avsnitt 1.3.2, koncentration av 1 x 10 6 celler / ml i PBS + 0,1% BSA) under en slutlig koncentration av 0,1 pM. Kortfattat virvel att blanda väl.
    OBS: CFSE koncentrationer som används här är ungefär tio gånger lägre än de som normalt tillämpas i proliferationsanalyser, och därför celltoxicitet av färgämnet är minimal. Vi följer inte negativa effekter på cellernas livskraft.
  3. Inkubera under 5 min vid RT med konstant skakning (200 rpm). Skyddas från ljus.
  4. Släck färgämnet genom tillsats 5 volymer buffert flöde till rören. Centrifugera vid 94 xg under 5 min vid RT.
  5. Kasta bort supernatanten lämnar pelleten bakom. Återuppslamma cellerna med 5 volymer buffert flöde.
  6. Centrifugera vid 94 xg under 5 min vid RT. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i buffertflöde vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
  7. Lägg till ett lika stort antal ofärgade celler av intresse till det färgade cellsuspension. Fortsätt till ytan antigen färgningsprotokollet (avsnitt 3).

Figur 3
Figur 3. Detektering av differential CD ytantigen uttryck mellan två cellinjer via CFSE färgämne märkning. SH-SY5Y neuroblastomaceller är redan märkt med CFSE för senare identifiering i jämförelse med omärkta BJ fibroblaster. Co-färgning av blandprovet (höger sida) med ytmarkörer CD24 eller CD54 (båda konjugerad till APC) visar att cellinjer är lätt att skilja på grund av CFSE färgning (pilar = SH-SY5Y, pilspetsar = BJ fibroblaster). Majoriteten av SH-SY5Y-celler uttrycker CD24, men inte CD54 (ICAM-1). Däremot BJ fibroblaster (CFSE-negativ) är positiva för CD54 men till stor del negativa för CD24."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Cell ytfärgning

  1. Etikettrören inklusive prover och kritiska kontroller (se tabell 1).
Tube nej. Prov namn Antigen-fluorofor Utspädning
1 Ofärgade celler -
2 Enkel stained CD24-APC 01:50
3 Enkel stained TUJ1-Alexa Fluor 488 nm 1: 2000
4 Dubbel färgas CD24-APC 01:50
TUJ1-Alexa Fluor 488 nm 1: 2000
5 Enkel stained Sekundär bara: Alexa fluor 488nm 1: 2000

Tabell 1. L ista av rör som skall ingå i en typisk flödescytometri experiment. Tabellen visar en minimal uppsättning provrör som erfordras för en co-färgning experiment som beskrivits i denna video artikeln. En idealisk experiment måste omfatta alla nödvändiga kontroller (negativa och positiva samt kontroller ersättning) för noggrann tolkning av de resultat som uppnåtts.

  1. Lägg 100 pl cellsuspension (från avsnitt 2.7 eller 1.3.2) till varje 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    OBS: Se till att minst 0,1 x 10 6 celler är närvarande per 100 pl cellsuspension.
  2. Lägg fluorofor konjugerad antikropp till provet vid en lämplig utspädning.
    OBS: Bestäm arbets utspädning för varje antikropp före experimentet. Se tabell 2 för en lista of neurala ytantigener.
Antigen Celltyp Referens
CD15 Neurala stamceller [28, 67]
CD24 Neuronala celler [28, 68]
CD29 Neurala stamceller [28, 69, 70]
CD44 Gliaceller [25]
CD49f Neurala stamceller [38]
CD56 (NCAM) Neuronala celler [71]
CD133 Neurala stamceller [27]
CD184 Neurala stamceller och gliaceller [25]
CD200 Neuronala celler [38]
CD271 Neurallist stamceller
A2B5 Gliaceller [31]
CORIN Dopaminerga prekursorer [35, 36]
FORSE1 Neurala stamceller (NSC) [72]
GLAST Gliaceller [33]
NG2 Gliaceller [32]

Tabell 2. Val av neurala ytantigener. Denna tabell innehåller en lista över ytan epitoper befunnits uttryckas genom olika typer neurala cell att exemplifiera den ökande panel av ytantigener som används för att karakterisera neurala härstamning. Observera att det här valet är långt ifrån komplett och att de flesta av dessa markörer uttrycks också av en rad andra neurala och icke-neurala celler. Följaktligen kommer kombinationer av flera markörer krävas för att bättre definiera och isolera de angivna neurala delmängder.

    Inkubera i 30 minuter på en orbitalskak (200 rpm) i mörker.
  1. Flödesbufferttvätt
    1. Tillsätt 1 ml buffertflöde till rören. Centrifugera vid 380 xg under 4 minuter vid 4 ° C.
    2. Kasta bort supernatanten lämnar pelleten bakom.
  2. Upprepa tvättn igen.
  3. Efter den andra tvättningen, dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i buffertflöde till en slutlig volym av 100 | il.
  4. Använd prov för flödescytometrisk analys. Alternativt, fortsätt med avsnitt 4 och 5.
    OBS: Om celler ska sorteras och tas tillbaka i kultur efter FACS (dvs, livsduglig cellsuspension utan fixering eller permeabilization), tillämpa aseptisk teknik under skörden, färgning och analytiska steg.

4. Fixering och Permeabilization 38

  1. Fixering använder paraformaldehyd (PFA):
    1. Förbered fixeringsbuffert innehållande 2% PFA i PBS.
    2. Lägg 500 ul av fixeringsbuffert till 100 | il cellsuspension.
    3. Inkubera rören vid RT under 15 min på en orbital skakapparat (100 rpm) i mörker.
  2. PBS tvätt:
    1. Tillsätt 1 ml PBS till röret. Centrifugera vid 380 xg under 3 min vid 4 ° C.
    2. Kassera / dekantera supernatanten lämnar ca 100 | il i röret.
  3. Permeabilisering med Tween-20:
    1. Förbered permeabilization buffert innehållande 0,7% Tween-20 i PBS.
    2. Lägg 500 pl av permeabilization buffert till 100 | il cellsuspension.
    3. Inkubera rören vid RT under 15 min på en orbital skakapparat (100 rpm) i mörker.
  4. Tvätta cellerna en gång med PBS (som beskrivs i avsnitt 4.2) och avlägsna supernatanten från rören completely, vilket innebär att endast pelleten bakom.

5. Intracellulär Antigen Färgning 38 (Figur 4)

  1. Framställning av primära antikroppslösningar:
    1. Späd de primära antikropparna i utspädningsbuffert innehållande 1% bovint serumalbumin, 10% serum (t ex friska åsna eller getserum) och 0,5% Tween-20 i PBS.
      OBS: Välj serumet som ska användas beroende på art de sekundära antikropparna togs upp i.
    2. Alternativt kan du använda Zenon fluorescein märkning av den primära antikroppen enligt tillverkarens anvisningar.
      1. Bered en xg av primär antikropp i PBS vid en lämplig utspädning (total volym ≤ 20 pl).
      2. Lägg 5 pl av Zenon fluorescein IgG märkningsreagens (komponent A) till antikroppslösningen.
      3. Inkubera blandningen i 5 min vid RT.
      4. Lägg 5 pl av Zenon blockeringsreagens (komponent B) till reaktionsblandningen.
      5. Inkuberaav blandningen under 5 min vid RT. Applicera antikroppen till provet inom 30 min.
  2. Primär antikropp färgning:
    1. Lägg 100 pl av den primära antikroppslösningen till cellpelleten och försiktigt mal sönder för att blanda.
    2. Alternativt till Zenon fluoresceinmärkt antikropp till cellsuspensionen vid lämplig utspädning.
    3. Inkubera rören vid RT under 30 min på en orbital skakapparat (200 rpm), skyddad från ljus. Tvätta cellerna en gång med PBS (som beskriver i avsnitt 4.2) och avlägsna supernatanten från rören helt, vilket innebär att endast pelleten bakom.
  3. Sekundär färgning antikropp (krävs inte för Zenon fluorescein märkta antikroppar):
    1. Späd de sekundära antikropparna i PBS vid en lämplig koncentration.
    2. Lägg 100 pl av den sekundära antikroppslösningen till cellpelleten och försiktigt mal sönder för att blanda. Inkubera rören vid RT under 30 min på en skakanordning (200 rpm) i mörker.
  4. Tvätta proverna två gånger med PBS (som beskrivs i avsnitt 4.2).
  5. Tvätta en gång med buffert flöde (se avsnitt 3.5).
  6. Återsuspendera cellerna i ca 150 | il av buffertflöde och analysera på flödescytometern.

Figur 4
Figur 4. Samtidig färgning av ytan och intracellulära proteiner. Flödescytometri uppgifter exemplifierar en jämförelse mellan primär + sekundär antikroppsbaserad kontra Zenon fluorescein-baserade intracellulär färgning i kombination med ytan färgning. Exklusiv positivitet på y-axeln (övre vänstra kvadranten) och x-axeln (nedre högra kvadranten) visar celler färgade för MAP2 och CD24, respektive. Efter samtidig färgning, kan delas MAP2 och CD24 uttryck ses i övre högra kvadranten (höger paneler). Jämförelse av användning avAlexa Fluor 488. (Överst; AF488) kontra Zenon fluorescein (botten) för MAP2-märkning avkastning liknande resultat Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. flödescytometrisk analys

  1. Genomför flödescytometrisk analys omedelbart efter slutförandet av färgningsprotokollet med användning av en flödescytometer med lämpliga filter för signaldetektering. Använd 488 nm blå och 640 nm röd laser med FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), och FL-4 (675/25) bandpassfilter.
  2. Konfigurera primära grindar baserade på framåt och sidospridning exklusive skräp och döda celler.
  3. Ställ fluorescens grindar för yt- och intracellulär antigen till ≤0.5% baserat på de ofärgade prover och kompensation för spektral överlappning, använder en färgade kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet presenteras här möjliggör mångsidig experimentella metoder (Figur 2). I sin kortaste version (steg 1, 3 och 6), kan det anses en guide för enkel färgning av ytantigener. I sin mer komplex form, kan ett antal co-märkning paradigm med en rad intracellulära antigener eftersträvas (valfria steg 2 och / eller 4 till 5). Dessutom exemplifierar steg CFSE-märkning dess användbarhet för cellmärkning / spårning av subpopulationer i cell-cell interaktionsstudier eller flödescytometrisk streckkodning experiment (steg 2). Viabla cellpopulationer (erhållen från steg 2 och / eller 3) är mottagliga för cellsortering paradigm (FACS) och nedströms analys däribland post-sort cellodling. Å andra sidan, den kombinerade intracellulära och ytantigen färgning (steg 3 till 5)ger analytiska avläsningsmöjligheter i sin egen rätt. Till exempel identifierar samlokalisering av vissa CD antigener på särskilda undergrupper av neurala cellpopulationer (tillämpas av oss i Turaç m.fl. 38 att identifiera CD49f -. / CD200 höga signaturer för neuronal FACS). Dessa och andra exempel neurala markörer finns i tabell 2, varav CD15, CD29, CD49f och FORSE1, är främst förknippade med neurala stamceller och CD24 och CD56 är riklig på neuronala celler. Medan några av dessa markörer är exklusiva, kan olika färgningsintensitet och multivariat expressionsanalys bidra till att identifiera specifika marköruppsättningar för analys och isolering av vissa neurala subpopulationer.

Figur 3 exemplifierar typiska resultat från den kombinatoriska användningen av intracellulär färgämne och ytan färgning. Uppgifterna visar hur två olika cellpopulationer kan lätt urskiljas ina blandade provet på grund av att den tidigare märkningen av en av populationerna. Här, var SH-SY5Y neuroblastomaceller märkta med CFSE och utställnings fluorescens i den gröna kanalen (FL1, y-axeln) som är tydligt avskild från ofärgade andra populationen, i det här fallet BJ fibroblaster. Medan väletablerade karakteristisk fibroblast (CD54) och neurala (CD24) markörer visas (finns på deras respektive målgrupper, FL2 eller FL4 fluorescens, respektive; x-axeln) analoga metoder kan utnyttjas för att screena för ytterligare oidentifierade antigener. Vidare kan effekterna av cell-cell interaktioner av två (eller flera) subpopulationer som har märkts före samodling experiment studeras på detta sätt.

Figur 4 visar de ofärgade SH-SY5Y celler samt prover som färgats för CD24-APC och / eller den intracellulära neuronal MAP2 antigen (FITC kanal) efter fixering och permeabilization. Som det senare kan påverka spridningsegenskaper, baBAKGRUND fluorescens och ytan epitop färgning, tomter tjänar att dokumentera bibehållas ytuttryckning av neural CD24 efter intracellulär färgning. Dessutom är samlokalisering av neuronala MAP2 färgning på CD24-positiva fraktionen visas. Det är kritiskt att säkerställa naturlig detektion av ytantigenet genom jämförelse med CD24 ytexpression på levande celler. Dessutom specificitet den intracellulära upptäckt över bakgrunden, ospecifik antikroppsbindning och autofluorescens måste bekräftas. Upptäckt av intracellulära antigener via Zenon fluorescens-baserade eller primär + sekundär antikroppsbaserade strategier ger jämförbara resultat, vilket ger en logisk grund för att anse detta mer tidseffektiv metod (hoppa steg 5,3). Medan protokollet är robust och möjliggör den kombinerade detektion av ett område av ytan och intracellulära markörer med begränsad bakgrundsfluorescens, rekommenderas att noga följa de inkubationstider och tvättningsstegges i protokollet. Dessutom är det lämpligt att analysera minst tre oberoende experimentella upprepningar och att notera att märkning intensitet och ytan epitop stabilitet kan vara markör specifika och kan kräva ytterligare optimering. En gång fastställts för ett särskilt mål, trots saknar förmågan att analysera morfologiska egenskaper, flödescytometrisk detektion av ytan och intracellulära antigener eller intracellulära antigener enbart är kompatibel med konventionell fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras här är väl etablerad för neurala cellkulturer härledda från humana stamceller, men kan också tillämpas på andra neurala cellkällor inklusive primär vävnad eller neurala cellinjer. Förutom embryonala källor kan neurala stamceller eller progenitorceller extraheras från de neurogena regionerna av vuxna hjärnan 27. Dessutom flödescytometri och FACS kan utnyttjas för att kvantifiera, analysera och isolera olika cellpopulationer inklusive mogna nervceller 54, astroglia 33, microglial 55, oligodendrocyter 56 eller endotelceller 57 från postnatal hjärnvävnad.

Oavsett källan, att optimala förhållanden för fixering och permeabilization behov bestämmas för varje celltyp experimentellt, eftersom överskott av endera av stegen skulle kunna leda till en massiv förändring av spridningsegenskaper som påverkar flödescytometrisk avläsning. Effektivitet av protokollet beror också på stabilheten av ytmolekyler posta permeabilisering. Det bör noteras att olika ytan epitoper kan påverkas av cellmanipulation som en del av förfarandet i varierande grad. Också enzymatisk skörd med trypsin byte eller Liberase-1, till exempel, kan påverka en rad cellytan epitoper men i mindre utsträckning jämfört med användningen av Accutase eller papain 7.

Specifika epitoper kan påverkas av samma behandling paradigm i varierande grad: medan VCAM-1 (Vascular celladhesionsprotein-1; CD106) kan påverkas av avverkning, dissociation, fixering och permeabilisering i ett ganska känsligt sätt, ICAM-1 ( intercellulär adhesionsmolekyl-1; CD54) kan visa en mer robust uttrycksmönster bevaras under hela förfarandet 58.

Medan tidigare antingen ytan 25,28 eller intracellulär antigen märkning 14 har tillämpats i neurobiology paradigm, närmar kombinera både metod 38 kan ge nya neurala ytantigen kandidater och ge ytterligare cytometrisk avläsningsalternativ.

Vi genomför rutinmässigt ytan färgning steget före intracellulär antigen färgning och har använt den strategin att expandera vår uppsättning ytmarkörer för neuropoiesis 38 med hjälp av en rad mänskliga neurala cellinjer. Titrering av antikroppar och inkubationstider kommer behöva optimeras för respektive celltyper, målepitoper och experimentella paradigm. På samma sätt måste CFSE koncentrationen och mängden av celler som används per färgning optimeras för varje cellinje, eftersom inte alla cellinjer färgas på ett identiskt sätt med samma mängd CFSE koncentration.

CFSE har en topp excitation av 494 nm och topp utsläpp av 521 nm (grön kanal, FL-1 detektor), därav alla fluorescens spillover till andra kanaler måste kompenseras för att bestämma specifik fluorescens emission. Alternativa färger såsom Cell Trace Violet (CTV), Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD), Horisont V550, Horisont V450 har framgångsrikt beprövade för att användas i stället för CFSE 59,60.

I flödescytometri är det kritiskt för att bestämma den verkliga specifika fluorescerande signalen från bakgrunden. Därför är de mest lämpliga kontroller måste noggrant utvalda, och kan innefatta användning av en icke-neural eller på annat sätt negativt cellinje för att understryka antikroppsspecificiteten (sk intern negativa kontroller 38,46). Autofluorescens hos varje cellkälla måste beaktas. Isotypkontroller kan anses i stort sett onödigt i de flesta neurala celldetektering paradigm 13,46.

Med tanke på den stora variationen observerats i cellodlingssystem (särskilt sådana som framställts från stamceller) och färgningsproceduren, är införandet av biologiska replikat rekommenderas starkt. Det bör noteras att användning av genetiska reportrar är enannat sätt att använda neurala flödescytometri 61,62. Nyligen Maroof et al. Använde en Nkx2.1-GFP reporter strategi för att sortera olika kortikala liknande neuronala subpopulationer från mänskliga embryonala stamceller 63.

En upp-och-kommande område representeras av utforskning av neurala exosomer i biomedicinska områden så olika som tumörbiologi och neurodegeneration 64, och flödescytometri av exosomes eller deras isolering genom pärla baserade analyser ger viktiga verktyg för denna strävan 65. För tillhörande videoprotokoll se 66.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Tags

Neuroscience CD-markörer ytantigener intracellulära antigener flödescytometri neuroner gliaceller neurala stamceller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) CD24 CD54 CFSE
Flödescytometri protokoll för Surface och intracellulära Antigen Analyser av neurala celltyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter