Introduction
Durchflusszytometrie wurde ausgiebig in der Immunologie, Hämatologie und Onkologie ausgenutzt, um Zellpopulationen über Eigenstreueigenschaften, Zelloberflächen-Antigen-Expression und andere Fluoreszenzparameter 1-3 definieren. Unsere Erkenntnisse über Blutslinie Entwicklung und Krankheit sind das Ergebnis in erheblichem Maße von der kontinuierlichen Verfeinerung dieser Methode nach ihrer erstmaligen Anwendung 4,5. Bewusstsein für die quantitative und die allgemeine analytische Potenzial der Durchflusszytometrie wurde vor kurzem aufgefordert seine weitere Verbreitung in der Stammzellforschung und können ähnlich tiefgreifende Fortschritte in einem kürzeren Zeitrahmen 6 zu ermöglichen. Allerdings ist die Anwendung der Durchflusszytometrie gezielt zu analysieren und zu isolieren, neuronale Populationen solange anspruchs wahrgenommen. Im Gegensatz zu den blutbildenden Zellen, die natürlicherweise in Suspension vorhanden sind, werden neuronalen Zelltypen in der Regel durch zu komplexe Quellen, die Glia und verschiedene o umfassen können geerntetther umgebenden Zellen sowie ein dichtes Netz von Prozesstragenden Neuronen. Folglich hat noch Neurobiologie, um die Vielseitigkeit der Durchflusszytometrie auf seine vollständige Potential im täglichen Forschungsroutinen implementieren. Jedoch solange eine tragfähige Einzelzellsuspension erzeugt werden können (und Protokollen entwickelt worden und zu diesem Zweck optimiert 7), Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann als wertvoller Bestandteil des analytischen Repertoire der Neurobiologie werden 8-11.
. Abbildung 1. Prinzip der Durchflusszytometrie und Komponenten von einem Durchflusszytometer Durchflusszytometer umfassen drei Hauptsysteme: Fluidtechnik, Optik und Elektronik. Eine stromlinienförmige Strömung der Zellen in Suspension wird durch die Hülle flui erreicht (von primärem Gewebe oder in vitro-Kultur hergestellt)d mittels hydrodynamischer Fokussierung, die Einschränkung der Probe zu seiner Mittelkern. Die optischen Teile sind von Lasern, die den Strom von Zellen und optische Filter, die das Signal an den entsprechenden Detektoren lenken beleuchten zusammensetzt. Die festgestellt werden, um elektronische Signale, anschließend von einem Computer verarbeitet und auf einem Monitor für die Datenanalyse und Gating visualisiert Lichtsignale umgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Benutzer von durchflusszytometrischen Methoden profitieren von mindestens einem grundlegenden Verständnis der zugrunde liegenden Fundamentaldaten einschließlich Bausteine eines Zytometer (für einen Überblick siehe 12,13; siehe auch Abbildung 1). Ein Laserstrahl schneidet mit einem hydrodynamisch fokussiert fluidischen Strom, der die Zellen in Suspension, die wiederum durch den Laserstrahl in 'Datei' eine nach der anderen vorbei enthält. Die interceptiauf einer Zelle (oder einer anderen Partikel, in diesem Fall) mit den Laser-Ergebnisse bei der Streuung von Licht, das von diesem Abfragepunkt. Streulicht kann in Weiterführung der Laserrichtung (Vorwärtsstreuung, wobei die Größe der Teilchen verbunden ist), als auch senkrecht zu seiner Verschieberichtung detektiert werden (side scatter; Reflektieren des granulosity der Partikel / Zelle). Diese zuvor genannten Streueigenschaften erfordern keine spezielle Kennzeichnung, weshalb ein unmarkierter Probe (oder auch Zelltrümmer, Luftblasen, etc.) ein Signal (event) auf der bivariate Vorwärtsstreuung im Vergleich zu Seitenstreudiagramm üblicherweise zur ersten Gating verwendet zu generieren. Unter Verwendung der entsprechenden Laser und die spezifisch für die entsprechende Anregungs- und Emissionsspektren Filter kann eine Zelle für seine Positivität, Intensität oder Abwesenheit von Fluoreszenzmarkern analysiert werden. Die Mehrheit der Durchflusszytometrie-Anwendungen haben sich auf die Charakterisierung über Zelloberflächenantigene gerichtet. Im Gegensatz zu den hämatopoetischen LineagE hat die neuronalen Linie nach Oberflächen Epitop Expressionsmuster 5 blieb weniger ausführlich definiert. Ein Vorteil der Nutzung von Oberflächenantigenen ist, dass lebende Zellen unterzogen, um das Sortieren Paradigmen, wie FACS-Zelle sein. Im Gegensatz dazu intrazelluläres Antigen-Färbung erfordert Fixierung und Permeabilisierung Schritte, um die Epitop-Antikörper-Wechselwirkung vermitteln, ausschließt nachgelagerten Anwendungen, die lebensfähige Zellen erfordern. Der Hinweis, derartige Ansätze noch für zahlreiche quantitative Assays 14 sowie Downstream-Analysen von RNA und Protein-Expression 15 ermöglichen. Hämatologie, Immunologie und Onkologie haben oft zusammen verwendet mehr als ein Dutzend Marker für bestimmte Subpopulationen 16 zu definieren. Darüber hinaus können Massen Zytometrie oder CyTOF jetzt zur Analyse von bis zu 30 Parameter gleichzeitig 17,18 werden.
Für neurale Stammzellen Anwendungen sowie Primärkulturen 14,19,20 die Heterogenität von Zellenvitro ist ein häufiges Phänomen 21-23. Die Zellen, die nicht die Zielgruppe von Interesse verkörpern eine potentiell verwirrenden Faktor für experimentelle Auslesen 24,25. Günstig sind die verschiedenen zellulären innerhalb einer heterogenen Zellsuspension vorliegenden Teilmengen tragen distinct (bekannt oder noch zu entschlüsseln) Antigen-Expressionsprofile, die verwendet werden können, um diese verschiedenen Populationen zu definieren. Durchflusszytometrie kann daher eine entscheidende Rolle bei der Lösung von zellulärer Heterogenität und damit zu erleichtern biomedizinische Anwendungen (in vitro-Assays, Zelltherapie) und optimieren quantitative Auslesen durch die Konzentration auf die wichtigsten Teilmenge 24,26. Verschiedene Oberflächenantigenkombinationen wurden in den letzten Jahren erkannt worden, die Quantifizierung und Isolierung von bestimmten neuronalen Zelltypen ermöglichen. Dies beinhaltet CD133 zur Anreicherung von neuralen Stammzellen 27, eine Kombination aus den CD15 / CD24 / CD29-Oberflächenantigene für die Isolierung von NSC, Differenzierungten Neurons und Neuralleistenzellen 28 oder CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 auf neuronale und gliale Teilmengen 25, unter anderen Signaturen 29,30 isolieren. Jenseits Neuronen, Glia Marker umfassen A2B5 31, CD44 25, NG2 32 und GLAST 33. Eine aktuelle Publikation hat die Mittelhirn Bodenplatte Vorläufer Marker CORIN 34,35 für dopaminerge Vorstufen in Parkinson Zelltransplantation bereichern genutzt Paradigmen 36. CD-Moleküle sind nicht nur Marker, sondern funktionell relevante Mediatoren von Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Fähigkeit einer Zelle, auf Hinweise von extrazellulären Matrixmolekülen reagieren und Wachstumsfaktoren 37. Eine Strategie, die weitere Verbesserung der Arsenal von kombinatorischen CD-Antigene zu charakterisieren neuronalen Linie Entwicklung ist es, bekannte intrazelluläre Marker verwenden, um für einen bestimmten Zelltyp von Interesse zu screenen und zu definieren CD Antigenkombinationen. Vor kurzem haben wir ausgenutzt solchen Ansatz und identifiziert CD49f - / CD200 hochkombiExpressionsMuster als neuer Ansatz zur Anreicherung von neuronalen Teilmengen von neural differenzierten induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkultursystemen 38. Hier sind und die letztere Protokoll (und optionalen Varianten davon), in der Oberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung gleichzeitig zur Definition neuronaler Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden diskutieren wir.
Abbildung 2: Flussdiagramm des Versuchsprotokoll-Optionen. Die Figur zeigt eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte im Protokoll beteiligt. Optionale Schritte (CFSE Farbstoff oder intrazelluläres Antigen Kennzeichnung) sind je nach hellgrau-Boxen angezeigt. Nach der Ernte wird es notwendig, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl von neuronalen Zellsuspensionen vor der Zelloberflächenfärbung beurteilt. Positive wiesowie negative Kontrollen müssen zusätzlich zu den Proben von Interesse sein sollte. Die Proben können durch Durchflusszytometrie analysiert und / oder in Zellsortierung Paradigmen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Während wir zuvor verwendeten primären Antikörper in Kombination mit sekundären Antikörper für die intrazelluläre Färbung 38 führen wir nun nicht kovalente Markierung des primären Antikörpers durch Fluoreszenz-Fab-Fragmente (Zenon Kennzeichnung) als geringfügige Veränderung, wodurch die Schritte der Bearbeitung der Zellen 39 verringert wird. Außerdem ist als weiteres Beispiel für das Protokoll der Vielseitigkeit, nutzen wir ein optional Kennzeichnung einer Versuchsmenge von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) vor der Oberflächenantigen-Färbung. Solche CFSE vorge Kennzeichnung ermöglicht die sofortige direkten Vergleich zweier Zelllinien oder experimentellen Bedingungen (Vs CFSE-markierten. unmarkiert) innerhalb eines einzelnen Probenröhrchen, die Verringerung Varianz oder feine Unterschiede in der Inkubationszeit und Speichern Antikörper. CFSE ist ein etablierter Fluoreszenz-Farbstoff, der üblicherweise für Zellverfolgung 40 verwendet wird, bei der Proliferation 41,42 und Strichcodes Experimenten 43,44. Schließlich, während eigentliche Sortierschritte (FACS, immunomagnetischen Zelltrennung oder Immunopanning) sind nicht Teil des Protokolls im Prinzip die hier beschriebenen Ernte und Kennzeichnungsverfahren liefern zwar Proben, ausgesetzt sind, können an die Oberfläche Antigen oder die intrazelluläre Markierung basierte Sortieranwendungen werden 15 25,28.
Mit diesem Artikel wollen wir: Zusammenfassend eine tragfähige Oberflächenantigen Färbeprotokoll 25,28 fassen ein Protokoll zum Nachweis von intrazellulären Ziele sowie kombinierte Oberflächen- und intrazelluläres Antigen Analyse 38, präsentieren eine intrazelluläre Farbstoff CFSE Markierungsschritt 41,45 als experimentelle Option für comvergleichende Analysen von neuronalen Zellpopulationen, und fassen Ansätze zur zytometrische Analyse (geeignete Kontrollen 13,46, Gating-Strategie und Datendarstellung 47) fließen.
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Protocol
1. Neuronale Zellernte
- Bewertung durch Mikroskop:
- Vor Beginn eines Experiments, überprüfen Sie den Status der Kultur mit Hellfeld oder Phasenkontrastmikroskopie.
HINWEIS: Während primäre von Dissektionen erhalten Nervengewebe ist prinzipiell gleichermaßen zugänglich zytometrische Analyse 14,28 fließen, beachten Sie bitte, dass der Fokus des Protokolls ist auf Zellen, die aus in vitro neuronale Zellsystemen erhalten.
- Vor Beginn eines Experiments, überprüfen Sie den Status der Kultur mit Hellfeld oder Phasenkontrastmikroskopie.
- Ernten der Zellen 7:
- Die Schale / Kolben von adhärenten Zellen mit Mg 2+ schonend waschen / Ca 2+ freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (beispielsweise 5 ml für T75-Kolben wurden 3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platte oder 10 ml für 10 cm Schale).
HINWEIS: Der PBS im gesamten Protokoll ist Mg 2+ / Ca 2+ frei.- Für das Video beispielsweise mit einem T75-Kolben von SH-SY5Y Neuroblastomzellen bei 80% Konfluenz. Übernehmen zusätzliche Waschschritte für den Fall,erhebliche Rückstände ist in der Schale vorhanden.
- Betrachten Sie Waschungen mit Serumalbumin enthaltenden PBS 48, Percoll oder Ficoll 49 Zentrifugation Steigungen und / oder handelsübliche Perlen 50,51. Entfernen von Myelin und andere Lipid oder anderen Verunreinigungen kritisch ist, insbesondere, wenn erwachsene primären Gewebequellen verwendet werden.
- Hinzufügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin Austausch an einem geeigneten Volumen, der die gesamte Fläche der Gewebekulturbehälter umfasst.
HINWEIS: Sie betrachten Accutase oder andere enzymatische Verdauung Optionen. Dieser entscheidende Schritt kann sich negativ auf Oberflächen Epitop Ausdruck (siehe 7). - Die Schale / Kolben bei 37 ° C für 2 inkubieren - 5 min (in Abhängigkeit vom Zelltyp), um Zellen zu trennen. Klopfen Sie leicht die Zellkulturgefäß oder bündig mit einer serologischen Pipette, um die Zellen zu entfernen. Vermeiden Sie zu der Verdauung (da dies zu Zellverlust und Gerinnung bei späteren Schritten verursachen).
- Quench das Trypsin Ersatz durch Zugabe des doppelten Volumens von Strömungspuffer (2% FBS in PBS) und sammle die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Verreiben Sie vorsichtig die Zellsuspension mit Hilfe einer Mikroliterpipette (100 - 1000 ul) oder ein 5 ml serologische Pipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Zentrifugiere die Zellen bei 220 g für 5 min bei 25 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren Verlassen des Pellet hinter.
- Re-suspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Strömungspuffer in Abhängigkeit von der Größe des Pellets (beispielsweise für einen konfluenten T75-Flasche von SH-SY5Y-Zellen die typische Ausbeute von mindestens 10 x 10 6 Zellen, wobei die Zellen werden in 5 ml-Fluß-Puffer) resuspendiert.
HINWEIS: Wenn größere Brocken oder Gerinnungseingehalten werden, durch ein 30-Filter - um Maschenweite 100.
- Die Schale / Kolben von adhärenten Zellen mit Mg 2+ schonend waschen / Ca 2+ freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (beispielsweise 5 ml für T75-Kolben wurden 3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platte oder 10 ml für 10 cm Schale).
- Zellzählung 52:
- Übertragen einer kleinen Aliquot der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnt in einem festen Verhältnis in einem Volumen von trypan blau oder eine Alternative Lebensfähigkeit Farbstoff vor der Übertragung auf einem Hämozytometer oder automatisierte Zellzählung System.
- Verdünne die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml durch Zugabe des geeigneten Strömungsvolumen Puffer oder PBS mit 0,1% BSA (wenn mit CFSE Markierungsverfahrens).
HINWEIS: Propidiumiodid, 7-Aminoactinomycin, Annexin V und im Handel erhältliche fixierbar Lebensfähigkeit Assay-Kits stellen alternative Möglichkeiten, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu beurteilen. Auch Apoptose-Assays unter Verwendung von Caspase-3-Fluoreszenz wie zuvor beschrieben 53 verwendet werden. Fluorescent Kanäle durch diese Reagenzien, die die Optionen für den nachfolgenden Schritten begrenzen können, wenn in allen Proben enthalten "besetzt" werden.
2. Intrazelluläre Farbstoffmarkierung Verwendung CFSE (Figur 3)
- Verdünne die CFSE zu einer gewünschten Ausgangskonzentration, die leicht verwendet werden kann.
HINWEIS: Für diese Experimente eine Stammkonzentration von0,01 mm verwendet. Bestimmen Sie die optimale Arbeitskonzentration von CFSE empirisch. - Zugabe von 10 ul 0,01 mM CFSE-Lösung pro ml Zellen (Abschnitt 1.3.2, der Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in PBS + 0,1% BSA) für eine Endkonzentration von 0,1 uM. Vortexen gut mischen.
HINWEIS: hier verwendeten CFSE Konzentrationen etwa zehnfach geringer als die, die üblicherweise in Proliferationstests angewendet, damit Zelltoxizität des Farbstoffs ist minimal. Wir haben nicht zu beobachten negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. - Inkubation für 5 min bei RT unter konstantem Schütteln (200 rpm). Vor Licht schützen.
- Quenche die Farbstoff durch Zugabe von 5 Volumina Flusspuffer zu den Rohren. Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT.
- Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter. Resuspendieren der Zellen mit 5 Volumina Flusspuffer.
- Zentrifugieren bei 94 × g für 5 min bei RT. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Fügen Sie die gleiche Anzahl von ungefärbten Zellen von Interesse für die Zellsuspension gefärbt. Fahren Sie mit der Oberfläche Antigen-Färbung Protokoll (Abschnitt 3).
Abbildung 3. Nachweis der Differenz CD-Oberflächen-Antigen-Expression zwischen zwei Zelllinien mittels CFSE Farbstoffmarkierung. SH-SY5Y Neuroblastomzellen sind bereits beschriftet mit CFSE zur späteren Identifizierung im Vergleich zum unmarkierten BJ Fibroblasten. Co-Färbung der Mischprobe (rechte Felder) mit Oberflächenmarker CD24 oder CD54 (beide konjugiert an APC) zeigt, dass Zelllinien sind leicht zu unterscheiden durch den CFSE-Färbung (Pfeile = SH-SY5Y, Pfeilspitzen = BJ Fibroblasten). Die Mehrheit der SH-SY5Y-Zellen exprimieren CD24 nicht aber CD54 (ICAM-1). Im Gegensatz dazu BJ Fibroblasten (CFSE-negativ) sind positiv für CD54, aber weitgehend negativ für CD24."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
3. Zelloberflächenfärbung
- Beschriften Sie die Röhrchen mit Proben und kritische Kontrollgruppe (siehe Tabelle 1).
| Rohr-Nr. | Beispielnamen | Antigen-Fluorophor | Verdünnung |
| 1 | Ungefärbte Zellen | - | |
| 2 | Einzelbunt | CD24-APC | 1.50 |
| 3 | Einzelbunt | TuJ1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 |
| 4 | Doppelbunt | CD24-APC | 1.50 |
| TuJ1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 | ||
| 5 | Einzelbunt | Sekundäre nur: Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 |
Tabelle 1 L ist von Rohren in einer typischen Durchflusszytometrie Experiment einbezogen werden. Die Tabelle zeigt nur eine minimale Anzahl von Probenröhrchen für eine in diesem Video-Artikel beschriebenen Co-Färbung Experiment erforderlich. Ein ideales Experiment muss alle erforderlichen Kontrollen (negativ, positiv sowie eine Entschädigung Kontrollen) für eine genaue Interpretation der erzielten Ergebnisse umfassen.
- 100 l Zellsuspension (von Abschnitt 2.7 oder 1.3.2) zu jeder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, ein Minimum von 0,1 x 10 6 Zellen pro 100 ul der Zellsuspension vorhanden sind. - Hinzufügen Fluorophor konjugiert Antikörper an die Probe bei einer geeigneten Verdünnung.
HINWEIS: Bestimmen Sie die Arbeitslösung für jeden Antikörper vor dem Experiment. Siehe Tabelle 2 für eine Liste of neuronalen Oberflächenantigene.
| Antigen | Zelltyp | Hinweis |
| CD15 | Neurale Stammzellen | [28, 67] |
| CD24 | Neuronalen Zellen | [28, 68] |
| CD29 | Neurale Stammzellen | [28, 69, 70] |
| CD44 | Gliazellen | [25] |
| CD49f | Neurale Stammzellen | [38] |
| CD56 (NCAM) | Neuronalen Zellen | [71] |
| CD133 | Neurale Stammzellen | [27] |
| CD184 | Neurale Stammzellen und Gliazellen | [25] |
| CD200 | Neuronalen Zellen | [38] |
| CD271 | Neuralleiste Stammzellen | |
| A2B5 | Gliazellen | [31] |
| CORIN | Dopaminergen Vorläufer | [35, 36] |
| FORSE1 | Neurale Stammzellen (NSC) | [72] |
| GLAST | Gliazellen | [33] |
| NG2 | Gliazellen | [32] |
Tabelle 2. Auswahl der neuronalen Oberflächenantigene. Diese Tabelle enthält eine Liste von Oberflächenepitopen gefunden, die von verschiedenen neuronalen Zelltypen exprimiert wird, um die wachsende Gruppe von Oberflächenantigenen verwendet werden, um die neuronale Linie kenn exemplifizieren werden. Man beachte, dass diese Auswahl ist bei weitem nicht vollständig ist und die meisten von diesen Markierungen werden auch durch eine Reihe von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen exprimiert wird. Folglich werden Kombinationen mehrerer Marker erforderlich, um besser zu definieren und zu isolieren, die die angegebenen neuronalen Subsets werden.
- Inkubieren für 30 min auf einem Horizontalschüttler (200 rpm) in der Dunkelheit.
- Flusspuffer Wasch
- 1 ml der Pufferströmung an den Rohren. Zentrifuge bei 380 × g für 4 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen Verlassen des Pellet hinter.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
- Nach dem zweiten Waschen, Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in Fließpuffer auf ein Endvolumen von 100 ul.
- Verwenden Probe für die Durchflusszytometrie. Alternativ fahren Sie mit Abschnitt 4 und 5.
HINWEIS: Wenn Zellen sortiert werden und wieder in Kultur nach der FACS sind (dh lebensfähige Zellsuspension ohne Fixierung oder Permeabilisierung) gelten aseptische Technik bei der Ernte, Färbung und Analyseschritte.
4. Fixierung und Permeabilisierung 38
- Fixierung mit Paraformaldehyd (PFA):
- Bereiten Fixierungspuffer, der 2% PFA in PBS.
- Gib 500 ul Fixierungspuffer auf 100 & mgr; l Zellsuspension.
- Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln.
- Bereiten Fixierungspuffer, der 2% PFA in PBS.
- PBS-Wasch:
- 1 ml PBS, um das Rohr. Zentrifuge bei 380 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Entsorgen / Dekantieren des Überstandes verlassen etwa 100 ul in die Röhre.
- Permeabilisierung mit Tween-20:
- Bereiten Permeabilisierung Puffer mit 0,7% Tween-20 in PBS.
- Gib 500 ul Permeabilisierung Puffer auf 100 & mgr; l Zellsuspension.
- Die Röhrchen bei RT für 15 min inkubieren, auf einem Orbitalschüttler (100 Upm) im Dunkeln.
- Mit PBS (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben) Waschen Sie die Zellen einmal und Überstand aus dem Röhrchen Completely, so dass nur das Pellet hinter.
5. Intrazelluläre Antigen Staining 38 (Figur 4)
- Herstellung von primären Antikörperlösungen:
- Verdünne die primären Antikörper in Verdünnungspuffer, der 1% Rinderserumalbumin, 10% Serum (zB normale Esel oder Ziegenserum) und 0,5% Tween-20 in PBS.
HINWEIS: Wählen Sie das Serum je nach Art der Sekundärantikörper wurden angehoben, um verwendet werden. - Alternativ verwenden Zenon Fluorescein Markierung des primären Antikörpers nach den Anweisungen des Herstellers.
- Herstellung von 1 & mgr; g des primären Antikörpers in PBS bei einer geeigneten Verdünnung (Gesamtvolumen ≤ 20 ul).
- Mit 5 ul Zenon Fluorescein IgG Markierungsreagenz (Komponente A) zu der Antikörperlösung.
- Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT.
- Mit 5 ul Zenon Blockierungsreagenz (Komponente B) zu dem Reaktionsgemisch.
- Bebrütendie Mischung für 5 min bei RT. Anwenden des Antikörpers an die Probe innerhalb von 30 min.
- Verdünne die primären Antikörper in Verdünnungspuffer, der 1% Rinderserumalbumin, 10% Serum (zB normale Esel oder Ziegenserum) und 0,5% Tween-20 in PBS.
- Primäre Antikörper-Färbung:
- Füge 100 & mgr; l des primären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen.
- Alternativ hinzuzufügen Zenon Fluorescein markierten Antikörper zu der Zellsuspension bei der geeigneten Verdünnung.
- Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min Inkubieren auf einem Schüttler (200 rpm), vor Licht geschützt. Mit PBS Waschen Sie die Zellen einmal (wie beschrieben in Abschnitt 4.2) und Überstand aus den Röhrchen vollständig, so dass nur das Pellet hinter.
- Sekundäre Antikörper-Färbung (nicht für den Zenon Fluorescein markierten Antikörpern erforderlich):
- Verdünne die sekundären Antikörper in PBS in einer geeigneten Konzentration.
- Füge 100 & mgr; l des sekundären Antikörperlösung zu dem Zellpellet und sanft verrieben zu mischen. Die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 min auf einem Schüttler (200 rpm) im Dunkeln inkubiert.
- Zweimal mit PBS waschen Sie die Proben (wie in Abschnitt 4.2 beschrieben).
- Einmal mit Fließpuffer waschen (siehe Abschnitt 3.5).
- Wieder die Zellen in ungefähr 150 & mgr; l Fließpuffer und von der Strömungs analysieren Cytometer.
Abbildung 4. Co-Färbung der Oberfläche und intrazellulären Proteinen. Durchflusszytometrie Daten veranschaulicht einen Vergleich zwischen primären + Sekundärantikörperbasis gegen Zenon Fluorescein basierende intrazelluläre Färbung in Kombination mit Oberflächenfärbung. Exclusive Positivität auf der y-Achse (obere linke Quadrant) und der x-Achse (untere rechte Quadrant) zeigt Zellen, die für MAP2 und CD24, angefärbt. Nach Co-Färbung kann geteilt MAP2 und CD24 Expression in der oberen rechten Quadranten (rechte Bilder) zu sehen. Vergleich mitAlexa Fluor 488. (Oben; AF488) gegenüber Zenon Fluorescein (unten) für MAP2-Markierungsausbeuten ähnliche Ergebnisse Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
6. Analyse über Durchflusszytometrie
- Zuführen durchflusszytometrische Analyse unmittelbar nach der Beendigung des Färbeprotokoll mit einem Durchflusszytometer mit entsprechenden Filtern zur Signalerkennung. Verwenden 488 nm blau und rot 640 nm Laser mit FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) und FL-4 (675/25) Bandpassfiltern.
- Up Haupttore auf der Grundlage der nach vorn und Seitenstreuung ohne Schmutz und abgestorbene Zellen ein.
- Stellen Fluoreszenz Tore für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen ≤0.5% bezogen auf den nicht markierten Proben und die Entschädigung für spektrale Überlappung mit einzelnen Bunt Kontrollen.
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Representative Results
Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt vielseitige experimentelle Ansätze (Abbildung 2). In seiner kürzesten Ausführung (Schritte 1, 3 und 6), kann es als eine Führung für einfache Färbung von Oberflächenantigenen ist. In seiner komplexeren Form kann eine Reihe von Co-Kennzeichnung Paradigmen mit einer Reihe von intrazellulären Antigenen (optional Schritte 2 und / oder 4 bis 5) fortgesetzt. Darüber hinaus ist die CFSE-Markierungsschritt beispielhaft für seine Nützlichkeit für die Zellmarkierung / Tracking von Subpopulationen in Zell-Zell-Wechselwirkungsstudien oder durchflusszytometrische Barcode-Experimente (Schritt 2). Lebensfähige Zellpopulationen (aus Schritt 2 erhalten und / oder 3) zugänglich sind Sortier Paradigmen (FACS) und nachgeschaltete Analyse einschließlich Post-Sortierzellkulturzelle. Andererseits wird (Schritte 3 bis 5) die kombinierte intrazellularen und Oberflächenantigen Färbungbietet analytischen Auslesemöglichkeiten in seinem eigenen Recht. Zum Beispiel identifiziert Kolokalisation bestimmter CD-Antigenen auf bestimmte Untergruppen von neuronalen Zellpopulationen (von uns in Turac et al 38 angelegt, um CD49f identifizieren -. / CD200 Hoch Signaturen für neuronale FACS). Diese und andere Beispiel neuronale Marker sind in der Tabelle 2, die CD15, CD29, CD49f und FORSE1, überwiegend mit neuronalen Stammzellen vorgesehen und CD24 und CD56 sind reichlich auf neuronale Zellen. Während einige dieser Marker sind exklusiv, können verschiedene Färbungsintensitäten und multivariate Expressionsanalyse der Suche nach spezifischen Markersets für die Analyse und Isolierung von bestimmten neuronalen Subpopulationen zu identifizieren.
Abbildung 3 zeigt beispielhaft aus der kombinatorischen Einsatz von intrazellulären Färbung und Oberflächenfärbung erhalten typische Ergebnisse. Die Daten zeigen, wie zwei unterschiedliche Zellpopulationen kann ich leicht zu unterscheidenna gemischten Probe aufgrund des Standes der Kennzeichnung von einer der Populationen. Hier wurden SH-SY5Y Neuroblastomzellen mit CFSE markiert und Ausstellungs Fluoreszenz im grünen Kanal (FL1, y-Achse), die deutlich getrennt von der ungefärbten zweite Population, in diesem Fall BJ Fibroblasten. Während etablierte Kenn Fibroblasten (CD54) und neuronale (CD24) Markierungen angezeigt werden (über ihre jeweiligen Zielgruppen vorhanden sind; FL2 oder FL4 Fluoreszenz zeigen; x-Achse) analoger Ansätze können genutzt werden, um für zusätzlichen identifizierten Antigene screenen. Außerdem können die Wirkungen der Zell-Zell-Wechselwirkungen von zwei (oder mehr) Teilgesamtheiten, die vor der Co-Kultur-Experimente markiert wurden auf diese Weise untersucht werden.
Abbildung 4 zeigt die ungefärbten SH-SY5Y Zellen sowie Proben für CD24-APC und / oder intrazellulären neuronalen MAP2 Antigen (FITC Kanal) nach der Fixierung und Permeabilisierung gefärbt. Wie kann dieser Streueigenschaften beeinflussen, background Fluoreszenz und Oberflächen Epitop-Färbung, die Grundstücke dienen, aufrechterhalten Oberflächenexpression von CD24 neuronale nach intrazelluläre Färbung zu dokumentieren. Darüber hinaus wird die Co-Lokalisation von neuronalen MAP2 Färbung auf der CD24-positiven Fraktion gezeigt. Es ist kritisch, treu Detektion des Oberflächenantigens durch Vergleich mit CD24-Oberflächenexpression von lebenden Zellen sicherzustellen. Außerdem Spezifität der intrazellulären Nachweis über Hintergrund, nicht-spezifische Antikörperbindung und Autofluoreszenz muss bestätigt werden. Der Nachweis von intrazellulären Antigenen über Zenon fluoreszenzbasierte oder primäre + sekundäre Antikörper-basierte Strategien liefert vergleichbare Ergebnisse, die eine Begründung für die Berücksichtigung dieser zeiteffizienter Ansatz (Überspringen von Schritt 5.3) zur Verfügung stellt. Während sich das Protokoll robuster und ermöglicht die kombinierte Erkennung einer Reihe von Oberflächen und intrazelluläre Marker mit begrenzten Hintergrundfluoreszenz, ist es empfehlenswert, die eng mit den Inkubationszeiten und Waschschritte einzuhaltenim Protokoll vorgesehen. Darüber hinaus ist es ratsam, mindestens drei unabhängigen Versuchswiederholungen zu analysieren und festzustellen, dass die Markierungsintensität und Oberflächen Epitop Stabilität markerspezifischen sein und kann eine weitere Optimierung erforderlich. Nachdem für ein bestimmtes Ziel etabliert, obwohl die Fähigkeit fehlt, morphologische Merkmale zu analysieren, durchflusszytometrischen Nachweis von Oberflächenantigenen und intrazelluläre oder intrazelluläre Antigene allein mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie kompatibel.
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Discussion
Die hier vorgestellte Protokoll ist für neuronale Zellkulturen aus menschlichen Stammzellen gegründet, kann aber auch für andere neurale Zellquellen angewendet werden, einschließlich primärer Gewebe oder neuronalen Zelllinien. Neben embryonalen Quellen kann neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen aus den neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns 27 extrahiert werden. Außerdem Durchflusszytometrie und FACS kann genutzt werden, um zu quantifizieren, zu analysieren und zu isolieren verschiedenen Zellpopulationen einschließlich reifen Neuronen 54, 33 Astroglia, Mikroglia 55, Oligodendrozyten 56 oder Endothelzellen 57 von postnatalen Hirngewebe werden.
Unabhängig von der Quelle, optimale Bedingungen für die Fixierung und Permeabilisierung Notwendigkeit, für jeden Zelltyp experimentell bestimmt werden, wie von mehr als einer der Schritte zu massiver Änderung Streuungseigenschaften beeinflussen durchflusszytometrischen Auslese führen. Effizienz des Protokolls hängt auch von der stabilkeit der Oberflächenmoleküle veröffentlichen Permeabilisierung. Es sollte beachtet werden, daß verschiedene Oberflächen Epitope können durch Zellmanipulation als Teil des Verfahrens, in unterschiedlichem Maße beeinflusst werden. Auch enzymatische Ernte mit Trypsin Ersatz oder Liberase-1, zum Beispiel, kann eine Reihe von Zelloberflächenepitope aber in einem geringeren Ausmaß im Vergleich zu der Verwendung von Accutase oder Papain 7 beeinflussen.
Spezifische Epitope können durch die gleiche Behandlung Paradigma in unterschiedlichem Maße betroffen sein: während VCAM-1 (Vascular Zelladhäsionsprotein-1; CD106) durch Ernte, Dissoziation, Fixierung und Permeabilisierung in einer sehr empfindlich Weise beeinflusst werden, ICAM-1 ( Intercellular Adhesion Molecule-1, CD54) können eine robustere Expressionsmuster während des gesamten Verfahrens 58 erhaltenen anzuzeigen.
Während früher entweder Oberfläche 25,28 oder intrazelluläre Antigen Kennzeichnung 14 haben in der Neurobiologie Paradigmen angewendet wurde, nähert Kombination sowohl methoden 38 neuartigen neuronalen Oberflächenantigen Kandidaten zu erhalten und zusätzliche cytometric Anzeige-Optionen.
Wir routinemßig die Oberfläche Färbeschritt vor intrazelluläres Antigen-Färbung durchzuführen und haben diese Strategie verwendet, um unsere Satz von Oberflächenmarkern für neuropoiesis 38 mit einer Reihe von menschlichen neuronalen Zelllinien einzuführen. Titration von Antikörpern und Inkubationszeiten müssen für die jeweiligen Zelltypen optimiert werden, Zielepitope und experimentelle Paradigma. Ebenso muss die CFSE-Konzentration und die Menge der Zellen pro Färbung verwendet für jede Zelllinie optimiert werden, da nicht alle Zellinien Fleck in identischer Weise mit der gleichen Menge an CFSE-Konzentration.
CFSE einen Peak Anregung 494 nm und Emissionspeaks von 521 nm (grün Kanal; FL-1-Detektor), daher ist jede Fluoreszenzstreuung zu anderen Kanälen kompensiert werden muss, um spezifische Fluoreszenzemission zu bestimmen. Alternative Farbstoffe wie Cell Trace Violet (CTV), Zellproliferation Dye eFluor 670 (CPD), Horizont V550, V450 Horizon wurden erfolgreich bewährten statt CFSE 59,60 verwendet werden.
In der Durchflusszytometrie ist es kritisch, den tatsächlichen spezifischen Fluoreszenzsignals von Hintergrund zu bestimmen. Daher haben die am besten geeigneten Kontrollen sorgfältig gewählt werden, und kann die Verwendung einer nicht-neuronalen oder anderweitig negativen Zellinie Antikörper-Spezifität unterstreichen (so genannte interne Negativkontrollen 38,46). Autofluoreszenz von jedem Zellquelle berücksichtigt werden. Isotypkontrollen kann als weitgehend entbehrlich in den meisten neuronalen Zellerkennungsparadigmen 13,46 werden.
Angesichts der in Zellkultursystemen beobachtet beträchtliche Variation (insbesondere aus Stammzellen) und des Färbeverfahrens wird der Einschluss biologischer Replikaten dringend empfohlen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Verwendung von genetischen Reporter ist ein werdenandere Möglichkeit, neuronale Durchflusszytometrie 61,62 zu verwenden. Vor kurzem Maroof et al. Verwendeten ein Nkx2.1-GFP-Reporter Ansatz für deutliche kortikale artigen neuronalen Subpopulationen von humanen embryonalen Stammzellen 63 zu sortieren.
Ein Auf-und-kommenden Feld wird durch die Erforschung der neuronalen Exosomen in der biomedizinischen so unterschiedlichen Bereichen wie der Tumorbiologie und Neurodegeneration 64 vertreten, und Durchflusszytometrie von Exosomen oder ihre Isolierung von Wulst basierte Assays stellt ein wichtiges Instrument für diese Quest 65. Für verwandte Video-Protokoll siehe 66.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) |  Life Technologies |
11330057 | |
| DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies |
14190169 | |
| Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies |
10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies |
11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies |
12604013 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies |
15250061 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth |
335.3 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe |
K41-001 | |
| Tween-20 Detergent | Calbiochem |
655205 | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience |
65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem |
A1584 | |
| Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore |
SCGPU02RE | |
| Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC |
156367 | |
| Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC |
156499 | |
| Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One |
188271 | |
| Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One |
227261 | |
| Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen |
S03710150 | |
| Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning |
4125 | |
| Pipet tips (1-200 µl) | Corning |
4126 | |
| Pipet tips (100-1000 µl) | Corning |
4129 | |
| Serological pipets, 5 ml | Corning |
4051 | |
| Serological pipets, 10 ml | Corning |
4101 | |
| Serological pipets, 25 ml | Corning |
4251 | |
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt |
72,699 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One |
616201 | |
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt |
72,695,500 | |
| Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience |
17-0247-42 | Working dilution 1:50 |
| Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience |
12-0549-42 | Working dilution 1:50 |
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance |
PRB-435P | Working dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies |
A21206 | Working dilution 1:2,000 |
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies |
Z-25342 | |
| Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld |
0640010 | |
| Vortex | Scientific Industries |
G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf |
5355 000.001 | |
| Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) |
653118 | |
| Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab |
91-PSPIN-24R | |
| Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph |
543-12310-00 | |
| Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich |
4480-50 | |
| Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific |
51026640 | |
| CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific |
51026331 | |
| Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences |
158320 | |
| Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss |
451212 | |
| Pipet controller, accu-jet pro | Brand |
26303 | |
| Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson |
F144563 | |
| Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson |
F144565 | |
| Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson |
F144566 |
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