Introduction
Flowcytometrie is uitgebreid in de immunologie, hematologie en oncologie benut om celpopulaties te definiëren via intrinsieke scatter eigenschappen, celoppervlakantigeen expressie en andere fluorescentie parameters 1-3. Het inzicht in bloedlijn ontwikkeling en ziekte resultaat in belangrijke mate van de continue verfijning van deze methode na de eerste uitvoering 4,5. Toegenomen bewustzijn van de kwantitatieve en de algemene analytische mogelijkheden van flowcytometrie heeft onlangs haar meer wijdverspreid gebruik in stamcelonderzoek aangemoedigd en kan op dezelfde diepe vooruitgang in een korter tijdsbestek 6 mogelijk te maken. De toepassing van flowcytometrie specifiek analyseren en te isoleren neurale populaties is lang beschouwd als een uitdaging. In tegenstelling tot hematopoëtische cellen die van nature voorkomen in suspensie worden neurale celtypes typisch geoogst uit te ingewikkelde bronnen kunnen glia en diverse oTher omringende cellen en een ingewikkeld netwerk van proces dragende neuronen. Bijgevolg neurobiologie heeft nog tot uitvoering van de veelzijdigheid van flowcytometrie om zijn volledige potentieel in de dagelijkse routines onderzoek. Zolang echter als een levensvatbare enkele celsuspensie kan worden gegenereerd (en protocollen ontwikkeld en geoptimaliseerd daartoe 7), flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden beschouwd als een waardevol bestanddeel van de analytische repertoire neurobiologie 8-11.
. Figuur 1. Principe van flowcytometrische analyse en componenten van een stromingscytometer flowcytometers bestaan uit drie belangrijke systemen: fluïdica, optica en elektronica. Een gestroomlijnde stroming van cellen in suspensie (bereid uit primair weefsel of in vitro kweek) wordt bewerkstelligd door de huls fluid via hydrodynamische focussen, het beperken van het monster naar het centrum kern. De optische onderdelen zijn samengesteld uit lasers die de stroom van cellen en optische filters die het signaal naar de geschikte detectoren direct verlichten. De lichtsignalen gedetecteerd worden omgezet naar elektronische signalen, vervolgens verwerkt door een computer en gevisualiseerd op een monitor voor data-analyse en gating. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Gebruikers van stromingscytometrische methoden winst van ten minste een basiskennis van de onderliggende fundamentals waaronder bouwstenen van een cytometer's (zie voor een overzicht 12,13; zie ook figuur 1). Een laserstraal snijdt een hydrodynamisch gerichte vloeibare stroom die de cellen in suspensie, waardoor pass laserstraal 'bestand' achter elkaar bevat. De interceptiop een cel (of een ander deeltje, wat dat betreft) met de laser resulteert in de verstrooiing van licht van deze ondervragingspunt. Strooilicht kan worden gedetecteerd in het verlengde van de laser richting (voorwaartse verstrooiing, die bij de omvang van het deeltje), alsmede loodrecht op de richting (zijwaartse verstrooiing, die de granulosity van de deeltjes / cel). Deze voornoemde scatter eigenschappen geen specifieke etikettering, dat is de reden waarom een ongemerkt monster (of ook cellulaire puin, luchtbellen, enz.) Een signaal (event) op de bivariate voorwaartse verstrooiing versus kant scatterplot vaak gebruikt voor de initiële venstertijd zal genereren vereisen. Door de geschikte lasers en filters specifiek voor de overeenkomstige excitatie en emissie spectra kan een cel worden geanalyseerd op positiviteit, intensiteit of afwezigheid van fluorescente merkers. De meeste flowcytometrische toepassingen gericht op de karakterisering via celoppervlakte antigenen. In tegenstelling tot de hematopoietische lineage is de neurale stam bleef minder uitgebreid gedefinieerd volgens oppervlak epitoop expressiepatronen 5. Een voordeel exploiteren oppervlakteantigenen is dat levende cellen kunnen worden gesorteerd paradigma zoals FACS cel. In tegenstelling, intracellulaire antigeen kleuring vereist fixatie en permeabilisatie stappen om de epitoop-antilichaam interactie bemiddelen, zich verzet tegen downstream toepassingen die levensvatbare cellen nodig. Van de nota, dergelijke benaderingen nog steeds de mogelijkheid voor tal van kwantitatieve assays 14 als downstream analyses voor RNA en eiwit expressie 15. Hematologie, immunologie en oncologie zijn vaak meer dan een dozijn markers in samenhang met bepaalde subpopulaties 16 definiëren. Daarnaast kan de massa cytometrie of CyTOF nu worden gebruikt voor het analyseren tot 30 parameters tegelijkertijd 17,18.
Voor neurale stamcellen aanvragen evenals primaire culturen 14,19,20 de heterogeniteit van cellen invitro is een veel voorkomend verschijnsel 21-23. De cellen die geen deel uitmaken van de doelgroep van belang belichamen een potentieel verstorende factor voor experimentele uitlezing 24,25. Op geschikte wijze de verschillende cellulaire subsets aanwezig in een heterogene celsuspensie aangebracht onderscheiden (bekend of nog te ontcijferd) antigeen expressie profielen die kunnen worden gebruikt om deze verschillende populaties te definiëren. Flowcytometrie kan dus een cruciale rol spelen bij het oplossen van de cellulaire heterogeniteit en, daardoor, biomedische toepassingen te vergemakkelijken (in vitro testen, celtherapie) en optimaliseren van kwantitatieve uitlezing door te focussen op de meest relevante subset 24,26. Diverse oppervlakte-antigeen combinaties zijn geïdentificeerd in de afgelopen jaren aan de kwantificering en isolatie van specifieke neurale celtypes mogelijk te maken. Dit omvat CD133 voor de verrijking van neurale stamcellen 27, een combinatie van de CD15 / CD24 / CD29 oppervlakte-antigenen voor de isolatie van NSC, differentiated neuron en de neurale lijst cellen 28 of CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 om neurale en gliale subsets 25, onder andere handtekeningen 29,30 isoleren. Beyond neuronen, gliale merkers omvatten A2B5 31, CD44 25, NG2 32 en GLAST 33. Een recente publicatie is gebruik gemaakt van de middenhersenen vloerplaat voorloper marker CORIN 34,35 te verrijken voor dopaminerge voorlopers in Parkinson celtransplantatie paradigma 36. CD moleculen niet alleen markers, maar functioneel relevante mediatoren van cel-cel interacties en het vermogen van een cel om te reageren op signalen van extracellulaire matrix moleculen en groeifactoren 37. Een strategie voor verdere verbetering van de arsenaal van combinatorische CD antigenen neurale stam ontwikkeling karakteriseren bekende intracellulaire merkers gebruikt voor het screenen en bepalen CD antigeen combinaties voor een bepaald celtype. We hebben onlangs uitgebuit een dergelijke aanpak en geïdentificeerd CD49f - / CD200 hoge combinatorische expressie patronen als een nieuwe benadering voor het verrijken van neuronale subsets van neuraal gedifferentieerde geïnduceerde pluripotente stamcellen kweeksystemen 38. Hier nemen we bespreken laatstgenoemde protocol (en optioneel variaties daarvan), waarbij het oppervlak kleuring en intracellulaire kleuring gelijktijdig worden gebruikt voor het definiëren neurale celtypes door flowcytometrie.
Figuur 2. Stroomdiagram van experimentele protocolopties. De figuur toont een schematische weergave van de belangrijkste stappen van het protocol. Optionele stappen (CFSE kleurstof of intracellulaire antigeen etikettering) zijn aangegeven met licht grijze vakken. Na oogsten, is het essentieel om de levensvatbaarheid en aantal cellen van neurale celsuspensies voor celoppervlak kleuring beoordelen. Positiefen negatieve controles dienen te worden opgenomen naast de interessante monsters. Monsters kunnen worden geanalyseerd door flowcytometrische analyse en / of worden gebruikt in cel sortering paradigma's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Hoewel we eerder gebruik primair antilichaam in combinatie met secundaire antilichaam voor intracellulaire kleuring 38, is er nu niet covalente labeling van het primaire antilichaam fluorescente Fab fragmenten (Zenon etikettering) als een lichte variatie, waardoor de stappen celmanipulatieniveau 39 verminderen. Bovendien, als een ander voorbeeld van de veelzijdigheid van het protocol, in dienst nemen we een facultatieve etikettering van een experimentele deelverzameling door carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voorafgaand aan het antigeen kleuring oppervlak. Dergelijke CFSE pre-labeling kan de onmiddellijke directe vergelijking van twee cellijnen of experimentele condities (CFSE-gelabelde vs. ongelabelde) binnen een enkel monster buis, het verminderen van variantie of subtiele verschillen in incubatietijd en opslaan antilichaam. CFSE is een gevestigde fluorescerende kleurstof die vaak wordt gebruikt voor het cell tracking 40, in proliferatie 41,42 en barcoding experimenten 43,44. Tot slot, terwijl de werkelijke sorteer- stappen (FACS, immunomagnetische celscheiding of immunopanning) maken geen deel uit van dit protocol, in principe, de oogst en de etikettering procedures hier beschreven doen opbrengst monsters die kunnen worden onderworpen aan antigeen of intracellulaire-etikettering gebaseerd sorteren toepassingen oppervlak 15 25,28.
Met dit artikel willen we: samenvatten een levensvatbare oppervlakte-antigeen kleuringsprotocol 25,28, vatten een protocol voor de detectie van intracellulaire targets alsmede gecombineerd oppervlak en intracellulaire antigeen analyse 38, presenteren een intracellulaire CFSE kleurstof etikettering stap 41,45 als een experimentele optie voor comvergelijkende analyses van neurale celpopulaties, en samenvatten benaderingen cytometrieanalyse (passende controles 13,46, gating strategie en presentatie van gegevens 47) stromen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Neurale Cell Oogsten
- Beoordeling door microscoop:
- Voorafgaand aan de start van een experiment, controleer dan de status van de cultuur met heldere-veld of fasecontrastmicroscopie.
OPMERKING: Terwijl de primaire neuraal weefsel verkregen van dissecties is, in beginsel, ook vatbaar voor cytometrieanalyse 14,28 stromen, let op dat de focus van het protocol is op cellen verkregen uit in vitro neurale cel systemen.
- Voorafgaand aan de start van een experiment, controleer dan de status van de cultuur met heldere-veld of fasecontrastmicroscopie.
- Oogsten cellen 7:
- Voorzichtig wassen de schotel / kolf van hechtende cellen met Mg2 + / Ca2 + vrij met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld 5 ml voor T75 kolf, 3 ml per putje 6-well plaat, of 10 ml van 10 cm schotel).
OPMERKING: De PBS gebruikt in het protocol is Mg 2+ / Ca 2+ gratis.- Voor de video Gebruik bijvoorbeeld een T75 fles van SH-SY5Y neuroblastomacellen op 80% confluentie. Breng additionele wasstappen wanneeraanzienlijke afval is aanwezig in de schotel.
- Overweeg wast met serum-albumine met PBS 48, Percoll, of Ficoll- 49 centrifugeren gradiënten en / of in de handel verkrijgbare kralen 50,51. Verwijdering van myeline en andere lipide of andere verontreinigingen kritisch, vooral wanneer volwassen primaire weefselbronnen worden gebruikt.
- Voeg voorverwarmde (37 ° C) trypsine vervanging door een geschikt volume dat het gehele oppervlak van het weefselkweekvat omvat.
OPMERKING: U kunt ook overwegen Accutase of andere enzymatische vertering opties. Deze cruciale stap kunnen een negatieve invloed hebben op het oppervlak epitoop expressie (zie 7). - Incubeer de schotel / kolf bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten (afhankelijk van het celtype) om cellen los. Tik voorzichtig de weefselkweek schip of spoelen met een serologische pipet om de cellen te verwijderen. Voorkomen dat over de spijsvertering (want dit kan de cel verlies en stolling in latere stappen veroorzaken).
- Quench de trypsine vervangen door toevoeging tweemaal de volumestroom buffer (2% FBS in PBS) en verzamelen van de cellen in een 15 ml conische buis.
- Voorzichtig vermaal de celsuspensie met een microliter pipet (100 - 1.000 III) of 5 ml serologische pipet om een celsuspensie te bereiden.
- Centrifugeer de cellen bij 220 g gedurende 5 min bij 25 ° C. Zuig voorzichtig het supernatant het verlaten van de pellet achter.
- Resuspendeer de pellet in een geschikt volume flow buffer, afhankelijk van de grootte van de pellet (bijvoorbeeld voor een confluente T75 fles van SH-SY5Y cellen typisch rendement ten minste 10 x 10 6 cellen, waarbij de cellen zijn geresuspendeerd in 5 ml buffer stroming).
OPMERKING: Als grotere brokken of stolling worden waargenomen, filtreer door een 30-100 micrometer mesh.
- Voorzichtig wassen de schotel / kolf van hechtende cellen met Mg2 + / Ca2 + vrij met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld 5 ml voor T75 kolf, 3 ml per putje 6-well plaat, of 10 ml van 10 cm schotel).
- Celtelling 52:
- Breng een kleine hoeveelheid van de celsuspensie aan een microcentrifugebuis en verdund in een gedefinieerde verhouding in een volume van trypan blauw of een alternatief levensvatbaarheid kleurstof vóór de overdracht naar een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem.
- Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 1 x 10 6 levensvatbare cellen / ml door toevoeging van de juiste hoeveelheid stroom of PBS met 0,1% BSA (als verdergaat met CFSE labeling).
OPMERKING: Propidiumjodide, 7-amino-actinomycine D, annexine V en commercieel verkrijgbaar bevestigbaar levensvatbaarheid assay kits vertegenwoordigen alternatieve mogelijkheden om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen. Ook apoptose assays met caspase-3 fluorescentie zoals eerder beschreven 53 worden gebruikt. TL-kanalen zal worden "bezet" door deze reagentia die de mogelijkheden voor verdere stappen kunnen beperken indien opgenomen in alle monsters.
2. Intracellular Dye Labeling Met behulp van CFSE (figuur 3)
- Verdun de CFSE een gewenste voorraad concentratie die gemakkelijk kan worden gebruikt.
LET OP: Voor deze experimenten een voorraad concentratie van0,01 mM werd gebruikt. Bepaal de optimale werkende concentratie van CFSE empirisch. - Voeg 10 ul van 0,01 mM CFSE oplossing per ml cellen (paragraaf 1.3.2, concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml in PBS + 0,1% BSA) voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 uM. Kort vortex goed te mengen.
OPMERKING: CFSE concentraties die hier gebruikt zijn ongeveer tien maal lager dan de algemeen toegepaste proliferatie assays derhalve cel toxiciteit van de kleurstof is minimaal. We hebben geen negatieve effecten op de levensvatbaarheid van de cellen te observeren. - Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder constant schudden (200 rpm). Beschermen tegen licht.
- Doof de kleurstof met 5 volumestromen buffer toe te voegen aan de buizen. Centrifugeer bij 94 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant laat de pellet achteren. Resuspendeer de cellen met 5 volumes stroom buffer.
- Centrifugeer bij 94 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in flow buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg een gelijk aantal ongekleurde cellen van belang om de gekleurde celsuspensie. Ga verder met antigen kleuringsprotocol (hoofdstuk 3) de oppervlakte.
Figuur 3. Detectie van differentiële CD oppervlakte-antigeen-expressie van twee cellijnen via kleurstof CFSE labeling. SH-SY5Y neuroblastoma cellen vooraf gelabeld met CFSE vervolgens te identificeren in vergelijking met ongelabelde BJ fibroblasten. Co-kleuring van het mengmonster (rechts panelen) met oppervlakte markers CD24 of CD54 (zowel geconjugeerd aan APC) toont aan dat cellijnen zijn gemakkelijk te onderscheiden vanwege de CFSE kleuring (pijlen = SH-SY5Y; pijlpunten = BJ fibroblasten). De meerderheid van SH-SY5Y-cellen brengen CD24, maar niet CD54 (ICAM-1). In tegenstelling, BJ fibroblasten (CFSE-negatief) zijn positief voor CD54 maar grotendeels negatief voor CD24."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
3. celoppervlak kleuring
- Etiket buizen met inbegrip van monsters en kritische controles (zie tabel 1).
| Buis niet. | Monster naam | Antigeen-fluorofoor | Verdunning |
| 1 | Ongekleurde cellen | - | |
| 2 | Single-lood | CD24-APC | 01:50 |
| 3 | Single-lood | TUJ1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 |
| 4 | Dubbel glas in lood | CD24-APC | 01:50 |
| TUJ1-Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 | ||
| 5 | Single-lood | Secundaire alleen: Alexa Fluor 488 nm | 1: 2.000 |
Tabel 1. L ist buizen worden in een typisch stroomcytometrie experiment. De tabel geeft een minimale set monsterbuizen nodig voor co-kleuring experiment in dit artikel beschreven video. Een ideale experiment moet alle noodzakelijke controles (negatief, evenals de positieve compensatie controles) voor een nauwkeurige interpretatie van de verkregen resultaten omvatten.
- Voeg 100 ul celsuspensie (uit paragraaf 2.7 en 1.3.2) aan elke 1,5 ml microcentrifugebuis.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er een minimum van 0,1 x 10 6 cellen aanwezig per 100 ul celsuspensie zijn. - Voeg fluorofoor geconjugeerd antilichaam aan het monster bij een geschikte verdunning.
OPMERKING: Bepaal werkverdunning voor elk antilichaam voorafgaand aan het experiment. Zie tabel 2 voor een lijst of neurale oppervlakteantigenen.
| Antigeen | Cell Type | Verwijzing |
| CD15 | Neurale stamcellen | [28, 67] |
| CD24 | Neuronale cellen | [28, 68] |
| CD29 | Neurale stamcellen | [28, 69, 70] |
| CD44 | Gliacellen | [25] |
| CD49f | Neurale stamcellen | [38] |
| CD56 (NCAM) | Neuronale cellen | [71] |
| CD133 | Neurale stamcellen | [27] |
| CD184 | Neurale stamcellen en gliacellen | [25] |
| CD200 | Neuronale cellen | [38] |
| CD271 | Neurale stamcellen | |
| A2B5 | Gliacellen | [31] |
| CORIN | Dopaminerge voorlopers | [35, 36] |
| FORSE1 | Neurale stamcellen (NSC) | [72] |
| GLAST | Gliacellen | [33] |
| NG2 | Gliacellen | [32] |
Tabel 2. Selectie van neurale oppervlakte-antigenen. Deze tabel geeft een overzicht van de oppervlakte epitopen gevonden door verschillende neurale celtypes worden uitgedrukt aan de toenemende panel van oppervlakte-antigenen gebruikt om de neurale lineage karakteriseren illustreren. Deze opties verre van volledig en dat de meeste van deze merkers wordt ook uitgedrukt door een reeks andere neurale en niet-neurale cellen. Bijgevolg zullen combinaties van verschillende merkers nodig zijn om beter te definiëren en te isoleren aangegeven neurale subsets.
- Incubeer gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) in het donker.
- Flow buffer wassen
- Voeg 1 ml buffer stroom aan de buizen. Centrifugeer bij 380 g gedurende 4 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant laat de pellet achteren.
- Herhaal de wasstap opnieuw.
- Na de tweede wasbeurt, decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in flow buffer tot een eindvolume van 100 pl.
- Gebruik monster voor flowcytometrische analyse. Als alternatief, ga verder met hoofdstuk 4 en 5.
OPMERKING: Als de cellen moeten worden gesorteerd en zet terug in de cultuur post-FACS (dwz levensvatbare celsuspensie zonder fixatie of permeabilisatie), toepassing van aseptische technieken tijdens de oogst, vlekken en analytische stappen.
4. Fixatie en Permeabilisatie 38
- Fixatie met paraformaldehyde (PFA):
- Bereid fixatie buffer bevattende 2% PFA in PBS.
- Voeg 500 ul van fixatie buffer 100 pl celsuspensie.
- Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudapparaat (100 rpm) in het donker.
- Bereid fixatie buffer bevattende 2% PFA in PBS.
- PBS wassen:
- Voeg 1 ml PBS aan de buis. Centrifugeer bij 380 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Gooi / Schenk de bovenstaande vloeistof laat ongeveer 100 pi in de buis.
- Permeabilisatie met Tween-20:
- Bereid permeabilisatie buffer dat 0,7% Tween-20 in PBS.
- Voeg 500 ul van permeabilisatie buffer 100 pl celsuspensie.
- Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudapparaat (100 rpm) in het donker.
- Was de cellen eenmaal met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2) en de bovenstaande vloeistof uit de buizen completely, waardoor alleen de pellet achter.
5. De intracellulaire Antigen kleuring 38 (figuur 4)
- Vervaardiging van primaire antilichaam oplossingen:
- Verdun het primaire antilichamen in verdunning buffer met 1% runderserumalbumine, 10% serum (bijvoorbeeld normale ezel of geit serum) en 0,5% Tween-20 in PBS.
OPMERKING: Kies het serum worden gebruikt afhankelijk van de soort de secundaire antilichamen zijn gerezen in. - Of gebruik Zenon fluoresceïne kenmerken van het primaire antilichaam volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 1 ug van primair antilichaam in PBS bij een geschikte verdunning (totaal volume ≤ 20 pi).
- Voeg 5 gl Zenon fluoresceïne IgG labeling reagens (Component A) aan het antilichaam oplossing.
- Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ul van Zenon blokkerende reagens (Component B) aan het reactiemengsel.
- Broedenhet mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het antilichaam aan het monster binnen 30 minuten.
- Verdun het primaire antilichamen in verdunning buffer met 1% runderserumalbumine, 10% serum (bijvoorbeeld normale ezel of geit serum) en 0,5% Tween-20 in PBS.
- Primaire antilichaamkleuring:
- Voeg 100 ul van de primaire antilichaamoplossing de celpellet en voorzichtig vermaal te mengen.
- Alternatief voeg Zenon fluoresceïne gelabeld antilichaam aan de celsuspensie in de geschikte verdunning.
- Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm), beschermd tegen licht. Was de cellen eenmaal met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2) en de bovenstaande vloeistof uit de buizen volledig, waardoor alleen de pellet achter.
- Secundair antilichaam kleuring (niet vereist voor de Zenon fluoresceïne gemerkte antilichamen):
- Verdun het secundaire antilichamen in PBS bij een geschikte concentratie.
- Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam oplossing voor de celpellet en voorzichtig vermaal te mengen. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) in het donker.
- Was de monsters twee keer met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2).
- Een keer wassen met stroom buffer (zie paragraaf 3.5).
- Resuspendeer de cellen in ongeveer 150 pl stroming buffer en geanalyseerd op de flowcytometer.
Figuur 4. Co-kleuring van het oppervlak en intracellulaire eiwitten. Flowcytometrie data illustreert een vergelijking tussen eerste + tweede antilichaam-gebaseerde versus Zenon fluoresceïne gebaseerde intracellulaire kleuring in combinatie met oppervlakte kleuring. Exclusief positiviteit op de y-as (kwadrant linksboven) en de x-as (kwadrant rechtsonder) toont cellen gekleurd voor MAP2 en CD24 resp. Na co-kleuring worden gedeeld MAP2 en CD24 expressie te zien in het kwadrant rechtsboven (rechts panelen). Vergelijking van het gebruikAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluoresceïne (onderaan) voor MAP2-labelingsopbrengsten soortgelijke resultaten Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6. Flowcytometrische Analyse
- Voer flowcytometrische analyse onmiddellijk na de voltooiing van de kleuring protocol met een flow cytometer met geschikte filters voor signaaldetectie. Gebruik 488 nm blauwe en 640 nm rode laser met FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) en FL-4 (675/25) banddoorlaatfilters.
- Het opzetten van primaire poorten op basis van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing exclusief puin en dode cellen.
- Stel fluorescentie poorten voor oppervlakte en intracellulaire antigeen aan ≤0.5% op basis van de niet-gekleurde monsters en compensatie voor spectrale overlap met behulp van enkele gebrandschilderde controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde protocol maakt veelzijdig experimentele benaderingen (figuur 2). In de kortste versie (stappen 1, 3 en 6), kan worden beschouwd als een gids voor eenvoudige kleuring van oppervlakte-antigenen. In een meer complexe vorm kan een aantal co-labeling paradigma met een reeks intracellulaire antigenen worden nagestreefd (optionele stappen 2 en / of 4 tot 5). Bovendien is de CFSE-etikettering stap een voorbeeld van het nut ervan voor mobiele etikettering / het volgen van subpopulaties in cel-cel interactie onderzoeken of stroomcytometrische barcoding experimenten (stap 2). Levensvatbare celpopulaties (verkregen bij stap 2 en / of 3) zijn vatbaar gesorteerd paradigma (FACS) en downstream analyse waaronder post-soort celkweek cel. Aan de andere kant, de gecombineerde intracellulaire en oppervlakte antigen kleuring (stappen 3-5)biedt analytische uitlezing mogelijkheden in zijn eigen recht. Bijvoorbeeld, het identificeren van co-lokalisatie van bepaalde CD-antigenen op bepaalde deelverzamelingen van neurale celpopulaties (door ons toegepast in Turaç et al 38 tot CD49f identificeren -. / CD200 hoge handtekeningen voor neuronale FACS). Deze en andere bijvoorbeeld neurale markers zijn in Tabel 2, die CD15, CD29, CD49f en FORSE1, worden hoofdzakelijk geassocieerd met neurale stamcellen en CD24 en CD56 zijn overvloedig op neuronale cellen. Hoewel enkele van deze markers zijn exclusief, kunnen verschillende vlekken intensiteiten en multivariate expressie analyse helpt specifieke marker sets te identificeren voor analyse en isolatie van specifieke neurale subpopulaties.
Figuur 3 illustreert karakteristieke resultaten verkregen uit de combinatoriële gebruik van intracellulaire kleurstof en oppervlakte kleuring. De gegevens tonen hoe twee verschillende celpopulaties gemakkelijk te onderscheiden ina gemengd monster door voorafgaande etikettering van één van de populaties. Hier werden SH-SY5Y neuroblastoma cellen gelabeld met CFSE en vertonen fluorescentie in het groene kanaal (FL1 y-as) die duidelijk van de ongekleurde tweede populatie, in dit geval BJ fibroblasten. Terwijl de gevestigde karakteristieke fibroblast (CD54) en neurale (CD24) markers worden getoond (aanwezig op hun respectievelijke doelgroepen; VT2 of FL4 fluorescentie, respectievelijk; x-as) analoge benaderingen kunnen worden benut om het scherm voor extra geïdentificeerde antigenen. Bovendien kunnen de effecten van cel-cel interacties van twee (of meer) subpopulaties die werden geëtiketteerd co-cultuur experimenten onderzocht op deze manier.
Figuur 4 toont het ongekleurde SH-SY5Y cellen alsmede monsters gekleurd voor CD24-APC en / of de intracellulaire neuronale MAP2 antigeen (FITC kanaal) na fixatie en permeabilisatie. Als laatste kan beïnvloeden verstrooiingseigenschappen, baCHTERGROND fluorescentie en oppervlakte epitoop vlekken, de percelen dienen te onderhouden oppervlakte-expressie van neurale CD24 documenteren na intracellulaire kleuring. Bovendien wordt de co-lokalisatie van neuronale MAP2 vlekken op de CD24-positieve fractie getoond. Het is cruciaal om getrouw detectie van het oppervlak antigeen verzekeren vergelijking met CD24 oppervlakte expressie op levende cellen. Bovendien specificiteit van de intracellulaire detectie op achtergrond, niet-specifieke antilichaambinding en autofluorescentie dient te worden bevestigd. Detectie van intracellulaire antigenen via Zenon fluorescentie-gebaseerde of primaire + secundaire strategieën antilichamen gebaseerde levert vergelijkbare resultaten, die een reden voor gezien dit meer tijd-efficiënte aanpak (het overslaan van stap 5.3) biedt. Terwijl het protocol is robuust en kan de gecombineerde detectie van een reeks oppervlak en intracellulaire merkers met beperkte achtergrond fluorescentie, wordt aanbevolen nauw hechten aan de incubatietijden en wasstappenvoorzien in het protocol. Voorts verdient het aanbeveling om ten minste drie onafhankelijke experimenten herhalingen te analyseren en dat etikettering intensiteit en stabiliteit oppervlak epitoop merker-specifiek mee en kunnen verdere optimalisatie vereisen. Eenmaal gevestigd voor een bepaald doel, ondanks ontbreken van de mogelijkheid om morfologische kenmerken te analyseren, stroomcytometrische detectie van oppervlakte en intracellulaire antigenen of intracellulaire antigenen alleen is compatibel met conventionele fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol is goed vastgesteld voor neurale celculturen afkomstig van menselijke stamcellen, maar ook kan worden toegepast op andere neurale cel bronnen primaire weefsel of neurale cellijnen. Naast embryonale bronnen, kunnen neurale stamcellen of voorlopercellen worden gewonnen uit de neurogene gebieden van volwassen hersenen 27. Bovendien flowcytometrie en FACS kan worden benut om te kwantificeren, te analyseren en te isoleren diverse celpopulaties waaronder volwassen neuronen 54, astroglia 33, microglia 55, oligodendrocyten 56, of endotheelcellen 57 van postnatale hersenweefsel.
Ongeacht de bron optimale omstandigheden voor fixatie en permeabilisatie moeten worden bepaald voor elk celtype experimenteel als boven elk van de stappen kunnen leiden tot een grote verandering van verstrooiingseigenschappen invloed flowcytometrische uitlezing. Efficiëntie van het protocol ook afhankelijk van de stabilteit van het oppervlak moleculen te posten permeabilisatie. Opgemerkt moet worden dat verschillende oppervlakte epitopen kunnen worden beïnvloed door celmanipulatie kader van de procedure in verschillende mate. Ook enzymatische oogst met trypsine vervanging of Liberase-1, kan bijvoorbeeld een reeks celoppervlak epitopen maar in mindere mate vergeleken met het gebruik van Accutase of papaïne 7 beïnvloeden.
Specifieke epitopen kunnen worden getroffen door dezelfde behandelingsparadigma verschillende mate: terwijl VCAM-1 (vasculaire celadhesie proteïne-1; CD106) kan worden beïnvloed door het oogsten, dissociatie, fixatie en permeabilisatie in een zeer gevoelige wijze, ICAM-1 ( intercellulaire adhesiemolecuul-1; CD54) kan een meer robuuste expressie patroon bewaard gedurende de hele procedure 58 weer te geven.
Terwijl eerder op aarde 25,28 of intracellulaire antigeen etikettering 14 hebben in de neurobiologie paradigma's zijn toegepast, benadert combinatie van beide methode 38 kan roman neurale oppervlakte-antigeen kandidaten opleveren en zorgen voor extra cytometrisch uitlezing opties.
We routinematig uitvoeren van het oppervlak vlekken stap voorafgaand aan het intracellulaire antigeen vlekken en gebruik hebben gemaakt van die strategie om onze set van oppervlakte markers uitbreiden voor neuropoiesis 38 met behulp van een scala van menselijke neurale cellijnen. Titratie van antilichamen en incubatietijden moeten worden geoptimaliseerd voor de respectievelijke celtypen, gericht epitopen en experimentele paradigma. Evenzo moeten de CFSE concentratie en de hoeveelheid gebruikte cellen per kleuring worden geoptimaliseerd voor elke cellijn, omdat niet alle cellijnen vlek op dezelfde wijze met dezelfde hoeveelheid CFSE concentratie.
CFSE heeft een piek excitatie van 494 nm en piek emissie van 521 nm (groen kanaal; FL-1 detector), dus ieder fluorescentie spill andere kanalen moet worden gecompenseerd fluorescentie-emissie bepaald. Alternatieve kleurstoffen zoals Cell Trace Violet (CTV), Celproliferatie Dye eFluor 670 (CPD), Horizon V550, V450 Horizon zijn met succes beproefd en getest om te worden gebruikt in plaats van CFSE 59,60.
In flowcytometrie, is het essentieel om de werkelijke specifieke fluorescente signaal van de achtergrond te bepalen. Daarom is de meest passende controles moeten zorgvuldig worden gekozen, en kunnen met behulp van een niet-neurale of anderszins negatieve cellijn te antilichaamspecificiteit onderstrepen (zogenaamde interne negatieve controles 38,46). Autofluorescentie van elke celbron moet rekening worden gehouden. Isotypecontroles kan worden beschouwd als grotendeels overbodig in de meeste neurale cel detectie paradigma 13,46.
Gezien de aanzienlijke variatie waargenomen in celkweek systemen (name afkomstig van stamcellen) en de kleuring procedure, wordt de opname van biologische replica sterk aanbevolen. Opgemerkt wordt dat het gebruik van genetische reporters isanderszins neurale stroom gebruiken cytometrie 61,62. Onlangs, Maroof et al. Gebruikte een Nkx2.1-GFP reporter benadering van verschillende corticale-achtige neuronale subpopulaties van menselijke embryonale stamcellen 63 afstand.
Een up-and-komende gebied wordt vertegenwoordigd door de exploratie van neurale exosomen in biomedische gebieden zo divers als de tumor biologie en neurodegeneratie 64, en flowcytometrie van exosomen of hun isolement door-kraal-gebaseerde testen levert belangrijke gereedschappen voor deze quest 65. Voor gerelateerde video-protocol zie 66.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) |  Life Technologies |
11330057 | |
| DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies |
14190169 | |
| Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies |
10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies |
11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies |
12604013 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies |
15250061 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth |
335.3 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe |
K41-001 | |
| Tween-20 Detergent | Calbiochem |
655205 | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience |
65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem |
A1584 | |
| Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore |
SCGPU02RE | |
| Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC |
156367 | |
| Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC |
156499 | |
| Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One |
188271 | |
| Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One |
227261 | |
| Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen |
S03710150 | |
| Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning |
4125 | |
| Pipet tips (1-200 µl) | Corning |
4126 | |
| Pipet tips (100-1000 µl) | Corning |
4129 | |
| Serological pipets, 5 ml | Corning |
4051 | |
| Serological pipets, 10 ml | Corning |
4101 | |
| Serological pipets, 25 ml | Corning |
4251 | |
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt |
72,699 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One |
616201 | |
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt |
72,695,500 | |
| Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience |
17-0247-42 | Working dilution 1:50 |
| Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience |
12-0549-42 | Working dilution 1:50 |
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance |
PRB-435P | Working dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies |
A21206 | Working dilution 1:2,000 |
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies |
Z-25342 | |
| Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld |
0640010 | |
| Vortex | Scientific Industries |
G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf |
5355 000.001 | |
| Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) |
653118 | |
| Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab |
91-PSPIN-24R | |
| Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph |
543-12310-00 | |
| Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich |
4480-50 | |
| Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific |
51026640 | |
| CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific |
51026331 | |
| Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences |
158320 | |
| Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss |
451212 | |
| Pipet controller, accu-jet pro | Brand |
26303 | |
| Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson |
F144563 | |
| Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson |
F144565 | |
| Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson |
F144566 |
References
- Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
- Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
- Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
- Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
- McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
- Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
- Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
- Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
- Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
- Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
- Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
- Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
- Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
- Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
- Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
- Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
- Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
- Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
- Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
- Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
- Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
- Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
- Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
- Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
- Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
- Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
- Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
