Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52242
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3, 2, 2, 1, 2,3
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 3Biology Program, Iowa State University

Introduction

ثمة مسألة رئيسية مع تنفيذ العلاجات المفيدة لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي هي في تطوير طرق فعالة منع المزيد من تدهور وتسهيل استعادة وظيفة أيضا. استراتيجية مبتكرة هي وراثيا الخلايا الجذعية مهندس خارج الحي، لإنتاج عوامل اعصاب، قبل الزرع الخاصة بهم. هذا المزيج من العلاج القائم على الخلايا، إلى جانب وجود نوع من العلاج الجيني، ويوفر وسيلة قوية لعلاج المرض أو الإصابة الناجمة عن وفاة الخلايا العصبية في الجهاز العصبي.

عوامل عصبية ضرورية للنمو وبقاء الخلايا العصبية النامية وكذلك صيانة واللدونة من الخلايا العصبية الناضجة. وقد أظهر عدد من الدراسات الأدوار الهامة من عوامل عصبية في تعزيز النمو الأولي والتفريق بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي (CNS والجهاز العصبي المحيطي)، وأنها يمكن أيضا أن يحفز تجديد في المختبر وفينماذج نيمال الإصابة العصبية 1. وأعربت المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF) غاية في الجهاز العصبي المركزي وتلعب أدوارا هامة في تنظيم التطور العصبي، اللدونة متشابك وإصلاح 2. خط المشتقة من الخلايا الدبقية عامل التغذية العصبية (GDNF) يعزز بقاء العديد من أنواع الخلايا العصبية بما في ذلك الدوبامين وmotorneurons 3. وهكذا، استراتيجية هامة لإصلاح العصبي هو توفير مصادر خارجية من عوامل عصبية إلى المناطق المصابة أو المريضة من الجهاز العصبي.

الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام متعددة القدرات (اللجان الدائمة) عقد إمكانات كبيرة للتسليم من البروتينات العلاجية لعلاج الجهاز العصبي التالفة أو المريضة. وقد اجتذب زرع اللجان الدائمة اهتماما كبيرا في الجهود الرامية إلى تطوير علاجات خلية القاعدة متوافقة المرضى منذ لديهم عدد من المزايا بما في ذلك، 1) السهولة النسبية من العزلة وصيانة، 2) قدرة multipotential، 3) المخاوف الأخلاقية قليلا، 4) القدرة على البقاء والهجرة بعد زرع و5) إمكانية زرع ذاتي 4،5. وقد تم الإبلاغ عن نتائج واعدة مع استخدام اللجان الدائمة ساذجة وهندستها وراثيا في النماذج الحيوانية لعدد من الظروف العصبية المختلفة، بما في ذلك إصابة في العمود الفقري الحبل 6،7، 8،9 السكتة الدماغية، المايلين نقص 10، وتنكس الشبكية 11-13. اقتران زرع الخلايا مع تسليم عوامل عصبية من الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا هي رواية واستراتيجية مهمة إصلاح العصبية.

خطوة أساسية في تطوير النظم العلاجية تسليم العامل القائم على الخلية لتحديد صحة طبيعية من الخلايا المهندسة. على هذا النحو، وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة لتقييم المعلمات نمو العامة للخلايا الجذعية البالغة وراثيا. مدخلا مهما لتقييم بسرعة المعلمات خلايا متعددة هو لتوظيف الخلوية القائم على صورة عالية من خلال screeninز (HTS)، غالبا ما يشار إلى ارتفاع باسم الفحص المحتوى (HCS) إجراءات 14. تسمح هذه التقنية الحصول على الصور الآلي والتحليل وهذا النهج هو بشكل خاص مناسبة تماما لتطبيقات أبحاث الخلايا الجذعية. في هذا المشروع قمنا بتطوير منصة التنميط الذي يسمح لتوصيف السريع والأمثل للتفضيلات الركيزة الخلايا والوظائف الخلوية مع الخلايا الجذعية البالغة وراثيا التي تستخدم نظام HCS.

Protocol

1. إعداد الركيزة لوحات 96-جيدا

  1. إنشاء خريطة للوحة 96-جيدا يحدد ركائز مختلفة وأنواع الخلايا للفحص (الشكل 1).
  2. الحصول على حلول الأوراق المالية من ركائز مختلفة [بولي-L-ليسين، فبرونيكتين، نوع الكولاجين I، laminin، وentactin الكولاجين IV-laminin (ECL)]، لوحة multiwell 96-جيدا وتستعد محطة عمل في زراعة الخلايا العقيمة غطاء محرك السيارة.
  3. إعداد ركائز الفردية عن طريق تمييع الأسهم في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل (تم تحديد هذا التركيز في السابق على أساس الركيزة التي تعتمد على تركيز فحص للنمو وتكاثر الخلايا). مزيج باستخدام الدوامة قبل صب في خزان معقم.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من حل الركيزة في كل بئر وفقا ل96-جيدا خريطة (الشكل 1) (أ ممص مكروى 12- أو 8 قنوات مريحة للmicropipetting في لوحة 96-جيدا). ختم غطاء لوحة 96-جيدا باستخدام شريط من بارافيلم وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

2. خلية الطلاء والوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: الفأر اللجان الدائمة تم عزل من نخاع العظام الكبار C57BL / 6 الفئران والحفاظ عليها باعتبارها خط خلية ملتصقة. أصيب اللجان الدائمة باستخدام ناقلات lentiviral لهندسة لهم لإفراز المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية (عامل التغذية العصبية. [كدنا البشري) وعامل التغذية العصبية المشتقة من الخلايا الدبقية (GDNF. [كدنا البشري) باستخدام ناقلات lentiviral في ترميز عامل التغذية العصبية (LV-عامل التغذية العصبية، CMV-عامل التغذية العصبية-IRES -GFP)، GDNF (LV-GDNF، CMV-GDNF-IRES-GFP)، والأخضر بروتين فلوري (GFP، LV-GFP، CMV-GFP).
ملاحظة: وسائل الإعلام الثقافة للخلايا الجذعية الماوس الوسيطة (اللجان الدائمة) يتم تعديل متوسطة Dulbecco وIscove التي تحتوي على 10٪ مصل-هجين مؤهل الجنين البقري، و 10٪ مصل الخيول، 2 مم L-الجلوتامين، و 10،000 U / البنسلين مل، 10 ملغ / الستربتومايسين مل . على خمسة أنواع مختلفة من اللجان الدائمة الماوس (اللجان الدائمة، GFP-اللجان الدائمة، عامل التغذية العصبية-GFP-اللجان الدائمة، GDNF-GFP-Mاللجان الدائمة وعامل التغذية العصبية / كانت مطلية GDNF-GFP-اللجان الدائمة) في حوالي 30٪ التقاء في T75 قوارير ثقافة الخلية.

  1. خلية التصفيحات
    1. في اليوم التالي، وإزالة الحلول الركيزة التي كتبها طموح وشطف كل بئر مع ما يقرب من 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة، مرتين. إضافة وسائل الإعلام ثقافة الخلية (200 ميكرولتر / جيد) إلى كل بئر بعد PBS شطف النهائي. وضع لوحة 96-جيدا في حاضنة ثقافة الخلية وضعت في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للموازنة.
    2. في حين أن لوحة 96-جيدا وتحقيق التوازن في الحاضنة، حصاد الخلايا (يجب اللجان الدائمة في قوارير T75 أن يكون حوالي 70٪ متكدسة في وقت الحصاد / الطلاء) من خلال جمع وسائط النمو (ويشار إلى وسائل الإعلام مشروط ع) من القارورة T75 و تخزينها في 15 مل أنبوب مخروطي تحت ظروف معقمة (سوف تستخدم هذه الوسائط مكيفة في الخطوة 2.1.4 أدناه).
    3. إضافة 8 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى القارورة ودوامة بلطف ثم ماصة قبالة PBS وإضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين و 0.01٪حل EDTA لفصل الخلايا من سطح ثقافة القارورة T75. مراقبة مفرزة الخلية عن طريق عرض قارورة باستخدام مجهر مقلوب مجهزة البصريات النقيض من المرحلة.
    4. عندما فصل الخلايا، إضافة على الفور 8 مل من وسائل الإعلام مكيفة (جمعها في الخطوة 2.1.2) إلى القارورة. جمع تعليق خلية ونقل إلى 15 مل مخروطي أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 450 x ج لخلايا بيليه.
    5. إزالة طاف و resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من الطازجة وحرارة (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
    6. تحديد عدد الخلايا في تعليق خلية عن طريق إجراء الأزرق عدد خلايا قابلة للحياة التريبان باستخدام عدادة الكريات. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة ما يقرب من 300 خلية / جيدا في الآبار الملائمة لوحة 96-جيدا.
    7. كرر هذه الخطوات لكل السكان من الخلايا.
  2. التصوير الوقت الفاصل
    1. مرة واحدة وقد تم مطلي جميع اللجان الدائمة، ومكانلوحة 96-جيدا في حاضنة لمدة 2 ساعة للسماح للاللجان الدائمة لنعلق على الركيزة.
    2. بدء نظام HCS والانتظار لمدة 2 ساعة للنظام للتوازن. تعيين وحدة تحكم البيئي إلى 37 درجة مئوية، وتوصيل اسطوانة الغاز المختلطة التي تحتوي على 5٪ CO 2 في الهواء لنظام HCS الغرفة البيئية توريد مصدر الهواء المستمر.
    3. إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة بعد فترة موازنة 2 ساعة ومكان مباشرة إلى غرفة نمو الخلايا للنظام HCS. سماح 30 دقيقة للموازنة لحساب أي توسع المرتبطة بارتفاع درجات الحرارة من لوحة ومن ثم بدء الحصول على الصور وتحليل البرامج لتكوين إعدادات لوحة.
    4. حدد الهدف 20X للتصوير. حدد بئرين في حالة [أي GFP-اللجان الدائمة على [فيبرونكتين الخ (6 × 5 ركائز فرعية MSC ليصبح المجموع 30 الظروف × 2 = مكررات 60 بئرا في المجموع)] لإعداد الوقت الفاصل بين التصوير. اختيار موقعين للتصوير معفي كل بئر.
    5. اختيار موجات الضوء الصحيحة للتصوير.
      وقد تم اختيار اثنين من أطوال موجية مختلفة (على النقيض المرحلة ومضان GFP) للتصوير مرور الزمن: ملاحظة.
    6. التركيز على الجزء السفلي جيدا باستخدام الليزر ضبط تلقائي للصورة والتقاط صور اختبار لمواقع متعددة والآبار متعددة للعثور على الطائرة التنسيق الأمثل.
    7. مرة واحدة وقد تم إنشاء التركيز، وبدء التقاط الصور في كل 5 دقائق لمدة 48 ساعة لجميع الآبار 60 (120 موقعا).
    8. تغذية الخلايا كل 24 ساعة عن طريق إزالة لوحة 96-جيدا من نظام HCS. إزالة 75 ميكرولتر من وسائل الإعلام من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الطازجة إلى كل بئر (تتوازن هذه الوسائط الطازج عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2).
    9. في نهاية التجربة مرور الزمن، وإزالة لوحة 96-جيدا من نظام HCS. تحت ظروف معقمة، وجمع العينات وسائل الإعلام مكيفة من كل بئر ونقل هذه العينات لوحة 96-جيدا آخر.
      ملاحظة: هذه العينات يمكن استخدامها للحصول على مزيد ANALYSهو عن طريق أداء ELISA لعوامل عصبية.
    10. إعداد لوحة 96-جيدا مع اللجان الدائمة مثقف لفحوصات إضافية مثل فحص تكاثر الخلايا Ki67 أو يوديد propidium الحي / الميت فحص تلطيخ (انظر التفاصيل أدناه).
    11. لتحليل الوقت الفاصل بين التصوير لخلية تتبع هجرة / خلية كما هو موضح في القسم 5 أدناه.

3. Ki67 تكاثر الخلايا ويوديد propidium لايف / الفحص الميت

  1. Ki67 خلية انتشار الفحص (كيمياء سيتولوجية مناعية)
    1. شطف مزارع الخلايا مع 0.1 M الفوسفات (PO 4) العازلة لمدة دقيقة واحدة مرتين. إصلاح الثقافة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة PFA وشطف الآبار مع برنامج تلفزيوني لمدة سبع دقائق ثلاث مرات.
    2. بعد شطف النهائي، إضافة 100 ميكرولتر من محلول مانع (الفوسفات عازلة المالحة، 5٪ مصل حمار عادي، 0.4٪ الأبقار مصل الزلال، و 0.2٪ تريتون X-100) إلى كل بئر لالثانية يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إعداد الأجسام المضادة الأولية، أرنب مكافحة Ki67، عن طريق تمييع في حل مانع في نسبة العاملين من 1: 200.
    3. إزالة الحل مانع وتطبيق 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. تغطية لوحة 96-جيدا واحتضان العينات عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    4. في اليوم التالي، وإزالة حل الأجسام المضادة وشطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق، 3 مرات.
    5. إعداد الأجسام المضادة الثانوية، حمار المضادة للأرنب و Cy3 في عرقلة الحل في نسبة العاملين من 1: 500. إضافة دابي وصمة عار النووية في حل الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 100. بعد إزالة PBS شطف الماضي، وتطبيق 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة / دابي الثانوية إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 90 دقيقة.
    6. إزالة الأجسام المضادة / حل دابي الثانوي وشطف كل جيدا مع برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق، 3 مرات. تغطية لوحة 96-جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  2. Propidium التأيد لايف / الفحص الميت
    1. قياس موت الخلايا التي يوديد propidium (PI) الإقصاء الفحص كما هو موضح أدناه.
    2. إعداد الحل وصمة عار يوديد propidium بتركيز 1.5 ميكرومتر في وسائل الإعلام الثقافة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪ إلى ما واحدة من اللجان الدائمة لمدة 2 دقيقة مع نية قتل تلك الخلايا. ويقدم كذلك مراقبة إيجابية لوصمة عار PI. فإن الغالبية العظمى من اللجان الدائمة أن يكون مبينا موت الخلايا ملطخة بي. إزالة حل الإيثانول.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من يوديد propidium حل وصمة عار على كل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. شطف الخلايا مع العازلة الفوسفات 0.1 M لمدة 1 دقيقة، 2 مرات. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA في 0.1 M P0 4 عازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة PFA وشطف مع PBS ثلاث مرات لمدة 7 دقائق.
    6. احتضان مع دابي الحل (1:50) المخفف في محلول مانع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف جميع الآبار معبرنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق، 3 مرات.
    7. إزالة حل دابي وشطف كل جيدا مع برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق، 3 مرات. تغطية لوحة 96-جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التصوير.

4. تحليل الآلي التصوير وMultiwavelength التهديف

  1. تحميل لوحة 96-جيدا (سابقا المجهزة للKi67 immunolabeling أو propidium ملطخة يوديد) في النظام HCS والسماح لوحة للتوازن لمدة 20 دقيقة افتح HCS الحصول على الصور نظام وتحليل البرمجيات.
  2. اختر إعدادات الاستحواذ على الهدف 10X باستخدام كاميرا binning في 1 و إعداد كسب 2. العثور على Z-الطائرة التي الخلايا يقيمون من خلال الاستفادة من وظيفة التعرض للسيارات وحساب الإزاحة لكل طول موجي من الفائدة. لهذا التحليل، التقاط الصور للدابي (W1)، و Cy3 (W2)، وFITC (W3). اختيار الحد الأقصى لمستوى كثافة التي تظهر آبار المراقبة السلبية أي إشارة للالحصول على الصور. تأكيد هذا الإعداد المناسب لنقاط البيعآبار مكنته.
  3. الحصول على طبق من ذهب. التقاط الصور وتخزينها في الحصول على الصور وقاعدة بيانات برامج التحليل و.
  4. مرة واحدة وقد تم الحصول على الصور، صورة مفتوحة اقتناء وتحليل البرامج حاليا ومراجعة لوحة البيانات من الصور المكتسبة أعلاه.
  5. حدد تحليل التهديف متعدد الطول الموجي. تكوين الحد الأدنى والحد الأقصى للكثافة لكل طول موجي.
    ملاحظة: الكشف عن دابي يجب وضع علامة على تلطيخ حول كل نواة مرئية. CY3 يجب الكشف عن الخلايا إيجابية مع Ki67 مناعية (IR)، وينبغي أن لا يكشف IR تحت المراقبة السلبية. لو Cy3 Ki67 الأشعة تحت الحمراء، وكان الحد الأدنى لعرض تقريبي 7 ميكرون، وأقصى عرض تقريبي 30 ميكرون، وكانت كثافة فوق خلفية المحلية 150 مستويات الرمادي، وكان الحد الأدنى للمنطقة ملطخة 50 ميكرون 2.
  6. تحليل الترشح لكافة المناصب. تصدير البيانات لعرض في جدول البيانات.

تتبع 5. خلية

  1. افتح صورة acquisitioن وبرنامج تحليل وانقر على "بيانات لوحة تعليق [DB] ..."، واختيار لوحة من الفائدة.
  2. عرض البيانات باسم "تايم مقابل حسنا".
  3. اختيار واحد من المواقع من قسم "مواقع" عن طريق النقر اليسار على التحديد المطلوب. حدد "المنقولة ..." تحت عنوان "موجات". انقر بزر الماوس الأيمن على الهدف جيدا في قالب لوحة 96-جيدا وانقر على "تحميل الصور".
  4. تتبع الخلايا عن طريق النقر على "تطبيقات" ثم "كائنات المسار".
  5. استخدام "تبادل البيانات الديناميكي (DDE)" لاختيار شكل لتصدير البيانات، على سبيل المثال، مايكروسوفت إكسل.
  6. بإختيار البيانات تتبع التصدير، على سبيل المثال، الوقت المنقضي، عدد الكائن، وبعد المسافة، الفاصل الزمني، والسرعة، وزاوية المطلقة، المسافة إلى الأصل، دلتا دلتا x و ذ.
  7. علامة كل خلية في المصالح مع "مفتاح السيطرة + انقر على اليسار" على الخلايا المستهدفة.
  8. خلايا المسار. إذا لزم الأمر، ووقف / تغيير تتبع غير لائق من الخلايا التي تحتوي على "حساب الضمان" مفتاح ومن ثم ضبط الإعدادات.
  9. بعد تتبع خلية كاملة، وحفظ البيانات مع "بيانات السجل".

Representative Results

تم فحص المعلمات النمو MSC بواسطة زراعة في مجموعات مختلفة من اللجان الدائمة على ركائز مختلفة. تم مطلي الخمس مجموعات مختلفة من الأنواع الفرعية MSC (اللجان الدائمة، GFP-اللجان الدائمة، عامل التغذية العصبية-GFP-اللجان الدائمة، GDNF-GFP-اللجان الدائمة، وعامل التغذية العصبية / GDNF-GFP-اللجان الدائمة) في لوحات 96-جيدا زراعة الأنسجة المغلفة مسبقا مع مختلف ركائز كما هو موضح في الشكل (1). وبعد أربعة أيام من زراعة، وثبتت لوحات وimmunolabeled و / أو ملطخة مع الكواشف المناسبة ثم درست باستخدام نظام HCS والتحليلات التي أجريت مع الحصول على الصور وبرنامج برامج التحليل.

الشكل (1)
تم المصنف قالب لوحة 96-جيدا لتصميم تجريبي تم المغلفة لوحات 96-جيدا مع مختلف ركائز والآبار مع الخلايا الجذعية المهندسة كما هو مبين في القالب: الشكل 1. وكمثال على ذلك، أهلا وسهلا فقطواستخدمت ليرة سورية في صفوف BF في هذه التجربة. تركت صفوف A، G و H فارغة. الاختصارات - اللجان الدائمة: الخلايا الجذعية الوسيطة. GFP-اللجان الدائمة: اللجان الدائمة، معربا عن بروتين فلوري الخضراء؛ عامل التغذية العصبية-GFP-اللجان الدائمة: الدماغ تستمد اللجان الدائمة التعبير عن عامل GFP-عصبية. GDNF-GFP-اللجان الدائمة. تستمد الخلايا الدبقية اللجان الدائمة التعبير عن عامل GFP-عصبية. عامل التغذية العصبية / GDNF-GFP-اللجان الدائمة. عامل التغذية العصبية وGDNF- اللجان الدائمة، معربا عن GFP. ECL: Entactin الكولاجين IV-Laminin).

مكافحة Ki67 immunolabeling، تليها دابي counterstaining، وكان يستخدم لتقييم ما إذا كانت ركائز مختلفة أثرت تكاثر مجموعات مختلفة من اللجان الدائمة هندسيا (الشكل 2A). التعبير عن مستضد Ki67 يحدث تفضيلي خلال المراحل المتأخرة G 1، S، G 2 و M من دورة الخلية، ولم يتم الكشف في الخلايا في مرحلة الراحة (G 0)، وبالتالي هو مفيد كعلامة الخلوية لانتشار 15 . 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) هو نو يشيع استخدامهامباين واضح وكروموسوم التي تنبعث مضان الأزرق على ملزم لAT مناطق DNA 16. يمكن تحديد العدد الكلي للخلايا في حقل عن طريق حساب عدد من نوى دابي الملون. كما هو موضح في الشكل 2B، وإن كان هناك تفاوت في نسب اللجان الدائمة المتكاثرة، كل ذلك يدعم ركائز تكاثر الخلايا كبيرا لكل من الأنواع الفرعية MSC.

الشكل 2
الشكل 2: Ki67 فحص تكاثر الخلايا. (A) مدموجة، صورة مزدوجة فلوري من Ki67 immunolabeling (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ النووي. تم immunolabeled العديد من اللجان الدائمة مع الأجسام المضادة Ki67 (الحمراء). شريط النطاق = 50 ميكرومتر. (B) بار الرسم البياني يوضح النسب المئوية للKi67 immunolabeled فرعية MSC نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، والكولاجيناكتب I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 5 أيام في المختبر (DIV). N = تجربة واحدة. كل شريط يمثل متوسط ​​البيانات المجمعة من 8 مواقع تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد استخدم يوديد propidium (PI) تلطيخ لتقييم ما إذا ركائز مختلفة أثرت بقاء الخلية (الشكل 3). يوديد propidium هو أحمر فلوري النووية وكروموسوم مباين شائعة الاستخدام. يوديد propidium هو impermeant الغشاء ويستثنى عادة من خلايا قابلة للحياة، وبالتالي هو مفيد للكشف عن الخلايا الميتة في عدد السكان. يمكن تحديد نسبة الخلايا الميتة داخل شرط معين عند دمجها مع تسمية النووية عامة مثل دابي لتحديد جميع الخلايا داخل حقل. وكانت النسبة المئوية للخلايا-PI إيجابي منخفضة على كل ركائز فحص (الشكل 3). كما تحكم إيجابية للكاشف PI، وحضنت بضع آبار تحتوي على اللجان الدائمة في الايثانول 70٪، وهي حالة تعرف لقتل معظم الخلايا، مما أدى إلى نسبة عالية من الخلايا المسمى PI كما هو موضح في الشكل 3B و3C (الإيثانول تعامل الإيجابي السيطرة).

الشكل (3)
الشكل 3: يوديد Propidium فحص موت الخلايا. (A) المدمجة، مزدوجة صورة الفلورسنت ليوديد propidium (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ. على الرغم من أن كانت ملطخة نوى كل من خلايا قابلة للحياة مع دابي (الأزرق)، تم الكشف عن أي تلطيخ يوديد propidium في اللجان الدائمة. (B) تقريبا كانت ملطخة جميع اللجان الدائمة مع يوديد propidium بعد التعرض لالايثانول 70٪. الحانات النطاق في A و B = 100 ميكرون. (C) بار الرسم البياني يوضح النسب المئوية من يوديد propidium (PI) ملطخة MSC النوع الفرعيق نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، نوع الكولاجين I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 5 أيام في المختبر (DIV). تحكم الإيثانول: هذا الشرط بمثابة مراقبة إيجابية للكاشف PI تلطيخ. معظم الخلايا تعرض لPI وصمة عار بعد العلاج الإيثانول قد لقوا حتفهم، وبالتالي الملون بشكل إيجابي لكاشف PI. N = تجربة واحدة. كل شريط يمثل متوسط ​​البيانات المجمعة من 8 مواقع تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتحقيق في تأثير ممكن من ركائز مختلفة على سلوك اللجان الدائمة هندسيا، تم تحليل الهجرة الخلية باستخدام الوقت الفاصل بين المجهر الرقمي والضوء / نظام غرفة البيئي تنتقل على النظام HCS (انظر التكميلي فيديو 1). مواقع متعددة / جيد والوقت الفاصل بين تصويروتستخدم لحساب معدلات الهجرة الخلية لمجموعات سكانية فرعية مختلفة من اللجان الدائمة المتزايد على مختلف ركائز باستخدام برنامج حاسوبي الحصول على الصور وتحليلها. بشكل عام، كما هو مبين في الشكل 4C، وأظهرت جميع أنواع فرعية من اللجان الدائمة أسرع معدل الهجرة على أسطح الخلية المغلفة مصفوفة ([فيبرونكتين]، الكولاجين، Laminin وECL) وأبطأ على الأسطح غير المغلفة البوليسترين.

الشكل (4)
تتبع تتبع الخلية والهجرة اللجان الدائمة مع الحصول على الصور وبرامج التحليل: الشكل 4. الصور يغطى المنقولة ضوء ومضان الصور من (A) بداية الوقت الفاصل بين التصوير و(B) في 29 ساعة في وقت لاحق في نهاية الدورة الوقت الفاصل بين التصوير (انظر التكميلي فيديو 1). يشار إلى مسارات الهجرة الخلية التي كتبها لى الملونة الأخبار. شريط مقياس: 50 ميكرون (C) بار الرسم البياني يظهر بصورة متوسط ​​معدلات الهجرة (كنسبة ميكرون / ساعة) لأنواع فرعية MSC نمت على البوليسترين (PS)، وبولي-L-ليسين (PLL)، فبرونيكتين، نوع الكولاجين I، laminin، أو entactin الكولاجين IV-laminin (ECL) ركائز لمدة 2 أيام في المختبر (DIV). N = تجربة واحدة. يمثل كل شريط متوسط ​​لا يقل عن 10 خلايا تصويرها من 2 الآبار لكل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخذت معا، وهذه النتائج تقدم دليلا أوليا على أن هذه القطعان من اللجان الدائمة وراثيا عرض خصائص نمو مماثلة. وتوفر هذه النتائج أدلة دامغة على أن lentiviral بوساطة التعديلات الجينية لهذه اللجان الدائمة التي يسببها أي آثار ضارة للكشف دراماتيكية على معايير النمو التحقيق باستخدام هذه المنصة الفرز.

= "jove_content"> التكميلي الفيديو 1. الوقت الفاصل بين الفيديو الرقمي من تتبع MSC باستخدام برنامج حاسوبي الحصول على الصور وتحليلها. طريق الهجرة لاثنين من اللجان الدائمة [أشار ك 1 (الخط الأخضر تتبع) و 2 (الأزرق خط تتبع)] موضحة. القبض على الفيديو خلال فترة 29 ساعة. تم التقاط الصور في كل 5 دقائق. تم استخدام الصور مضان من اللجان الدائمة، معربا عن GFP للتصوير مرور الزمن في إعداد الفيديو. = شريط المعايرة 50 ميكرون. هذا النوع من التحليل هو مفيد للتحقيق في سلوكيات الخلية، بما في ذلك الهجرة الخلية وانقسام الخلية.

Discussion

الخلايا الجذعية الوسيطة الكبار (اللجان الدائمة) هي نوع من الخلايا جذابة لوضع استراتيجية تجريبية الجمع بين تسليم العلاج الخلوي والجيني مقرها. اللجان الدائمة هي متعدد القدرات، قادرة على التفريق الى خلايا من سلالته أرومية متوسطة، وعرض ليونة كبيرة، التفريق / transdifferentiating في الأنساب العصبية والدبقية مع الحث المناسب النماذج 17،18. وعلاوة على ذلك، تم زرع اللجان الدائمة وأثبتت فعاليتها في الدراسات قبل السريرية لعدد من الاضطرابات، بما في ذلك ظروف الاعصاب 19. الكفاءة العلاجية من اللجان الدائمة هو معروف بسبب مفيد لمكافحة التكاثري، والأنشطة المضادة للالتهابات ومضادة للأفكارك الخاصة 20. ومن المعروف أيضا اللجان الدائمة لإنتاج وإفراز العديد من عوامل عصبية والنمو، الأمر الذي يسهم المرجح أن الصفات اعصاب المرتبطة اللجان الدائمة ساذجة بعد زرع في مواقع الإصابة أو المرض 21. IMPOrtantly، اللجان الدائمة يمكن تعديلها وراثيا لتسليم المستمر للعوامل عصبية عن الجمع بين التطبيقات المستندة إلى العلاج الجيني الخلوية و، واستخدمت في عدد من النماذج الحيوانية من الإصابة أو المرض إلى الجهاز العصبي المركزي 11،19،22.

في تطوير إستراتيجية تعتمد العلاج الخلوي والجينات مجتمعة، من المهم أن صحة الخلايا وتقييمها بعناية قبل استخدامها المكثف للفي المختبر، وخاصة في التطبيقات الجسم الحي. كدليل على المفهوم، ونحن التحقيق السكان متعددة من الخطوط الهندسية والتحكم MSC من أجل دراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية على صحة الخلايا واللياقة البدنية باستخدام نهج عالية فحص المحتوى (HCS). بشكل عام، HCS يشير إلى الخلوي الصورة القائمة على إنتاجية عالية فحص 14. هذا النهج يسمح فحص والتقييم الكمي من الظواهر الخلوية في مستويات متعددة من المكانية (الخلية إلى التحت خلوية) والزمنية (ميلي ثانية إلى أيام) الدقةolution عبر ظروف تجريبية مختلفة. باستخدام هذا النهج الذي الوصول الخلافات المحتملة في تفضيل الركيزة على المعايير التالية: تكاثر الخلايا والتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، موت الخلية، والحركة خلية / الهجرة. تم تصميم التجارب في 96-جيدا شكل لوحة ثقافة الخلية. ضمن لوحة واحدة ونحن التحقيق بشكل روتيني الخلافات المتعلقة الركيزة الممكنة فيما يتعلق بكل المعلمة للسكان MSC مختلفة من الخلايا transduced lentiviral ومقارنة اللجان الدائمة هندسيا مع الأصل، اللجان الدائمة غير transduced. تقدم هذه وسيلة لمقارنة نتائج مباشرة لأنواع فرعية مختلفة MSC مع بطارية لفحوصات في المختبر مثل تكاثر الخلايا باستخدام Ki67 immunolabeling، ويعيش / ميت بقاء الخلية الفحص باستخدام يوديد propidium تلطيخ، وسلوك الخلية عن طريق أداء الوقت الفاصل بين التصوير الرقمي . وامتدادا لهذا HCS واحد يمكن ان تؤدى ELISAs على عينات سائل الإعلام مكيفة التي تم جمعها من فرد ثells لتحديد الكمية إفراز عوامل عصبية. وسائل الإعلام مكيفة من أنواع فرعية مختلفة MSC يمكن أن تستخدم أيضا في اختبارات بيولوجية في المختبر لتحديد النشاط البيولوجي من العوامل يفرز 11،23. هذا النوع من منصة HCS ويمكن أيضا أن تستخدم لفي المختبر قياسات ثمرة neurite من الثقافات العصبية الأولية والعصبية خطوط الخلايا الجذعية 24. وعموما، أظهرت نتائجنا أن مجموعات سكانية فرعية من اللجان الدائمة المعدلة وراثيا المعروضة سلوكيات مماثلة في المقارنة إلى اللجان الدائمة غير المعدلة. وكان تأثير ركائز ثقافة متنوعة على نمو الخلايا والهجرة الخلية لا يختلف بشكل كبير بين أنواع فرعية MSC، فضلا عن ركائز الثقافة. على هذا النحو، فإن ركائز المصفوفة خارج الخلية اختبار لا يبدو أن تلعب دورا حاسما في تعديل هذه الجوانب من سلوك الخلية لهذه اللجان الدائمة مهندسة مختلفة.

وتوضح هذه الدراسة استخدام نظام HCS لتحليل مختلفار جوانب السلوك الخلية. ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف لمواجهة القيود المرتبطة تحليل الصور. في بعض الأحيان، في حين أن تحليل الصور مضان، كان من الصعب بعض الشيء لتحديد قيمة العتبة الصحيحة أعلاه والتي immunolabeled أو أن تحسب الخلايا الملون وصفت بأنها إيجابا / الملون. وهكذا، للحد من التحيز الذاتي، كان تحديد القيم عتبة يعتمد على مقارنة مع الضوابط (تم تنفيذ ضوابط السلبية للتصوير مضان بالتوازي خلال تجهيز جميع من هذا الإغفال من الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية). تمت مصادفة الحد آخر خلال تحليل للهجرة الخلية باستخدام الفاصل الزمني التصوير الرقمي. في بعض الحالات، كان البرنامج التصوير غير قادرين على التفريق بين الحركة البراونية عشوائية من خلية مقابل خلية المهاجرة الواقع على بعد مسافة قصيرة جدا. كانت قيود إضافية واضحة في الحالات التي يكون فيها البرنامج تحليل غير قادرين على التمييز بين وجود multipخلايا جنيه على مقربة جدا إلى واحد آخر. للتغلب على هذا القيد المطلوبة تحديد الخلية اليدوية أثناء التحليل بدلا من تحليل مؤتمتة بالكامل. كثافة الطلاء خلية يمكن أن يؤدي أيضا إلى انحراف بيانات الهجرة الخلية بين السكان من الخلايا التي تبدي قدرا أكبر من الأفضلية لتنمو في كتل مقابل الخلايا التي تنمو بمعزل عن بعضها البعض. هذه الأنواع من الاختلافات في جزء من المحتمل انعكاس لخلية الركيزة مقابل تفضيلات خلية خلية.

باستخدام نظام HCS للحصول على الصور وإجراء تحليل البيانات يوفر وسيلة فعالة وسريعة لتقييم المعلمات خلية متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم أشرطة الفيديو الرقمية الوقت الفاصل لمدة 30 ظروف مختلفة (6 ركائز و 5 أنواع فرعية مختلفة MSC) اكتسبت بشكل روتيني لفترات تتراوح بين ساعات إلى أيام (48 ساعة) أثناء استخدام الغرفة البيئية. تم استخدام هذه البيانات في وقت لاحق لحساب وتحديد الفروق في معدلات الهجرة الخلية عبر خطوط الخلايا المختلفة على ECM مختلفةالجزيئات.

في هذا التقرير قمنا سلط الضوء على تنفيذ منصة عالية فحص المحتوى لتقييم صحة الخلية وظيفة. هذا النوع من التحليل هو مفيد لوضع استراتيجيات عقلانية لتصميم خلية أنواع، وكذلك ركائز البوليمر لتسهيل نمو الخلايا الموجهة وتجديد العصبي. وهذه خطوة أساسية نحو تطبيق الجذعية تسليم خلية القاعدة من العوامل العلاجية قبل واسعة النطاق في الدراسات قبل السريرية المجراة باستخدام استراتيجيات زرع الخلايا.

Disclosures

وتم دعم رسوم النشر لهذه المقالة الفيديو عن طريق الأجهزة الجزيئية، LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio One 655090 96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody Abcam (Cambridge, MA) Ab16667 1:200 dilution
Collagen type I Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) C7661 Collagen from rat tail
DAPI Invitrogen (Carlsbad, CA) D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3 Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  711-165-152 1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) Millipore/Chemicon (Temecula, CA) 08-110
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Logan, UT) SH30071.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
Ethanol Chemistry Store (Ames, IA) 12003510 100%, 200 proof
Fibronectin Fisher Scientific (Hampton, NH) CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
KH2PO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P285 For PO4 buffer
K2HPO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P288 For PO4 buffer
L-Glutamine Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) 25030-081
Laminine (mouse) Trevigen (Gaithersburg, MD) 3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS) Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  017-000-121
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific (Hampton, NH) O4042 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4417
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4707
Propidium iodide (PI) Invitrogen (Carlsbad, CA) P1304MP
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1x) Invitrogen (Carlsbad, CA) 25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium Invitrogen (Carlsbad, CA) 12440–046
Hybridoma-qualified FBS Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
ImageXpress Micro Molecular devices (Sunnyvale, CA) ImageXpress micro High content screening system
MetaXpress 4.0 Molecular devices (Sunnyvale, CA) MetaXpress 4.0 Image acquisition and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
  2. Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
  3. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
  4. Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
  5. Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
  6. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
  7. Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
  8. Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
  9. Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
  10. Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
  11. Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
  12. Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
  13. Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
  14. Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
  15. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
  16. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
  17. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
  18. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
  19. Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
  20. Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
  21. Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
  22. Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
  23. Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
  24. Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

Tags

الطب، العدد 95، الخلايا الجذعية الوسيطة، وارتفاع الفرز الإنتاجية، التعديل الوراثي، وتتبع الخلية، وعوامل عصبية، وارتفاع فحص المحتوى، HCS، العصبية
عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, A. D., Brodskiy, P. A.,… More

Sharma, A. D., Brodskiy, P. A., Petersen, E. M., Dagdeviren, M., Ye, E. A., Mallapragada, S. K., Sakaguchi, D. High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies. J. Vis. Exp. (95), e52242, doi:10.3791/52242 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter