Introduction
Et stort problem med at gennemføre nyttige terapier til behandling af sygdomme i nervesystemet er i at udvikle effektive metoder, der forhindrer yderligere degeneration og også letter genvinding af funktion. En innovativ strategi er at genetisk manipulation stamceller ex vivo, til produktion af neurobeskyttende faktorer, inden deres transplantation. Denne kombination af celle-baseret behandling, kombineret med en type genterapi tilvejebringer en effektiv metode til behandling af sygdom eller skade-inducerede neuronal død i nervesystemet.
Neurotrofiske faktorer er afgørende for væksten og overlevelsen af udviklende neuroner samt vedligeholdelse og plasticitet af modne neuroner. En række undersøgelser har vist betydelige roller neurotrofiske faktorer i at fremme indledende vækst og differentiering af neuroner i det centrale og perifere nervesystem (CNS og PNS), og de kan også stimulere regenerering in vitro og i enNimal modeller af neural skade 1. Hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) er højt udtrykt i CNS og spiller vigtige roller i reguleringen af neural udvikling, synaptisk plasticitet og reparation 2. Gliacellelinie-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) fremmer overlevelsen af mange typer af neuroner, herunder dopaminerge og motorneurons 3. Således en vigtig strategi for neural reparation er at tilvejebringe exogene kilder neurotrofiske faktorer til den tilskadekomne eller syge områder af nervesystemet.
Multipotente knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller (MSC'er) har stort potentiale for afgivelse af terapeutiske proteiner til behandling af den beskadigede eller syge nervesystem. Transplantation af MSC'er har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed i bestræbelserne på at udvikle patientens kompatible cellebaserede behandlingsformer, da de har en række fordele, herunder, 1) relativt lette isolation og vedligeholdelse, 2) multipotentielle kapacitet, 3) små etiske betænkeligheder, 4) Evne til at overleve og migrere efter transplantation og 5) muligheder for autolog transplantation 4,5. Lovende resultater er blevet rapporteret ved anvendelse af naive og genetisk manipulerede MSC'er i dyremodeller for en række forskellige neurodegenerative tilstande, herunder rygmarvsskade 6,7, slagtilfælde 8,9, myelin mangel 10 og retinal degeneration 11-13. Kobling celletransplantation med levering af neurotrofiske faktorer fra genetisk manipulerede stamceller er en hidtil ukendt og vigtig neural reparation strategi.
Et væsentligt skridt i udviklingen af cellebaserede terapeutisk faktor doseringssystemer er at fastsætte den normale sundhedstilstand manipulerede celler. Som sådan er hovedformålet med denne undersøgelse var at evaluere de generelle vækst parametre gensplejsede voksne stamceller. En vigtig metode til hurtigt at vurdere flere celleparametre er at ansætte cellulær billede-baserede high-through screening (HTS), der ofte omtales som højt indhold screening (HCS) procedurer 14. Denne teknologi gør det muligt for indsamling og analyse af automatiseret billede og denne fremgangsmåde er særlig velegnet til stamcelleforskning applikationer. I dette projekt udviklede vi en profilering platform, der giver mulighed for hurtig karakterisering og optimering af celle substrat præferencer og cellulære funktioner med gensplejsede voksne stamceller ansætte en HCS-system.
Protocol
1. Forbehandling til plader med 96 brønde
- Oprette et kort af 96-brønds plade skitserer de forskellige substrater og celletyper, der skal undersøges (figur 1).
- Opnå stamopløsninger af forskellige substrater [poly-L-lysin, fibronectin, collagen type I, laminin og entactin-collagen IV-laminin (ECL)], en 96-brønds plade med flere brønde og forberede en arbejdsstation i et sterilt cellekultur hætte.
- Forbered individuelle substrater ved at fortynde lager i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) til en endelig koncentration på 5 ug / ml (denne koncentration var tidligere bestemt baseret på et substrat koncentrationsafhængig assay for vækst og proliferation af celler). Bland ved hjælp af en vortex før udhældning i et sterilt reservoir.
- Tilsæt 100 pi substratopløsning i hver brønd efter 96-brønds kort (figur 1) (a 12- eller 8-kanals mikropipette er bekvemt for micropipetting i en 96-brønds plade). Forsegl låget til 96-brønds plade ved anvendelse af en strimmel af parafilm og opbevares natten over ved 4 ° C.
2. Celleudpladning og Time-lapse Imaging
BEMÆRK: Mouse MSC'er isoleredes fra knoglemarv af voksne C57BL / 6-mus og opretholdt som en adhærent cellelinje. MSC'er blev inficeret ved anvendelse af lentivirusvektorer at konstruere dem til at udskille hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF; human cDNA) og glial celle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF; human cDNA) under anvendelse lentiviral vector kodning BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) og grønt fluorescerende protein (GFP, LV-GFP; CMV-GFP).
BEMÆRK: Vækstmedium for muse mesenchymale stamceller (MSC'er) er Iscoves Modificeret Dulbeccos medium indeholdende 10% hybridoma kvalificeret føtalt bovint serum, 10% equine serum, 2 mM L-glutamin, og 10.000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin . De fem forskellige typer af mus MSC'er (MSC'er, GFP-MSC'er, BDNF-GFP-MSC'er, GDNF-GFP-MSC'er og BDNF / GDNF-GFP-MSC'er) blev udpladet ved ca. 30% konfluens i T75 celledyrkningskolber.
- Celleudpladning
- Den følgende dag, fjerne Substratopløsninger ved aspiration og skylles hver brønd med ca. 200 pi sterilt PBS, to gange. Tilføj celledyrkningsmedier (200 pi / brønd) til hver brønd efter den sidste PBS skylning. Placer plade med 96 brønde i en cellekultur inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO 2 for ækvilibrering.
- Mens 96-brønds plade ækvilibrering i inkubatoren, høste celler (MSC'er i T75 kolber bør være ca. 70% konfluente på tidspunktet for høst / plating) ved at samle vækstmedierne (benævnt konditionerede medier) fra T75-kolbe og lagring i en 15 ml konisk rør under sterile betingelser (dette konditionerede medier anvendes i trin 2.1.4 nedenfor).
- Tilsæt 8 ml sterilt PBS til kolben, og omrystes forsigtigt og derefter pipette off PBS, og der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin og 0,01%EDTA-opløsning for at frigøre cellerne fra kulturen overflade T75 kolbe. Overvåg celle løsrivelse ved at se kolben under anvendelse af et inverteret mikroskop udstyret med fasekontrast optik.
- Når cellerne er fritliggende, straks tilsættes 8 ml af konditionerede medier (indsamlet i trin 2.1.2) til kolben. Saml cellesuspensionen og overføres til en 15 ml konisk centrifugerør og centrifugeres i 4 minutter ved 450 xg for at pelletere cellerne.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 pi frisk og opvarmet (37 ° C) cellekulturmedier.
- Bestem antallet af celler i cellesuspensionen ved at udføre en trypanblåt levedygtige celletal anvendelse af et hæmocytometer. Plate cellerne ved en tæthed på ca. 300 celler / brønd i de passende brønde i 96-brønds plade.
- Gentag disse trin for hver population af celler.
- Time-lapse Imaging
- Når alle MSC'er er blevet belagt, sted96-brønds plade i en inkubator i 2 timer for at tillade MSC'er at vedhæfte til substratet.
- Start HCS-systemet og vente 2 timer for systemet at ækvilibrere. Indstil miljømæssige controller til 37 ° C og forbinde en blandet gas cylinder indeholdende 5% CO2 i luft til HCS-systemet miljøkammeret levere en konstant luftkilde.
- Fjern 96-brønds plade fra inkubatoren efter 2 timers ækvilibrering og placere direkte i cellevækst kammer HCS-systemet. Tillad 30 min Ligevægt redegøre for al varme-relateret udvidelse af pladen og start indsamling og analyse billedsoftware at konfigurere plade.
- Vælg 20X objektiv til billeddannelse. Vælg to brønde pr betingelse [dvs GFP-MSC'er på Fibronectin mv (6 substrater x 5 MSC undertyper for i alt 30 forhold x 2 gentagelser = 60 brønde i alt)] for at oprette time-lapse billeddannelse. Vælg to steder til billeddannelse medi hver brønd.
- Vælg den rigtige lys bølgelængder til billeddannelse.
BEMÆRK: To forskellige bølgelængder (fase kontrast og GFP-fluorescens) blev udvalgt til time-lapse billeddannelse. - Fokus på godt bunden ved hjælp af laser autofokus og tage testbilleder for flere websteder og flere brønde til at finde en optimeret fokalplan.
- Når der er etableret i fokus, begynder at tage billeder hver 5 min i 48 timer for alle 60 brønde (120 sites).
- Feed cellerne hver 24 timer ved at fjerne 96 brønde fra HCS-systemet. Fjern 75 pi medier fra hver brønd og tilsæt 100 ul frisk medium til hver brønd (ækvilibrere denne friske medier ved 37 ° C og 5% CO 2).
- Ved afslutningen af time-lapse eksperiment fjerne 96 brønde fra HCS-systemet. Under sterile betingelser, indsamle de konditionerede medier prøver fra hver brønd, og overføre disse prøver til en anden 96-brønds plade.
BEMÆRK: Disse prøver kan anvendes til yderligere analyser ved at udføre ELISA for neurotrofiske faktorer. - Forbered 96-brønds plade med dyrkede MSC'er for yderligere assays, såsom Ki67 celleproliferationsassay eller propidiumiodid levende / dead farvning assay (se nedenfor).
- Udfør time-lapse imaging analyse for celle migration / celle sporing som beskrevet i afsnit 5 nedenfor.
3. Ki67 celleproliferation og propidiumiodid Levende / Dead assay
- Ki67 celleproliferationsassay (Immuncytokemi)
- Skyl cellekulturerne med 0,1 M phosphat (PO 4) puffer i et minut to gange. Fastgør kultur med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern PFA og skyl brøndene med PBS i syv minutter tre gange.
- Efter den sidste skylning, tilsættes 100 pi blocker opløsning (phosphatbuffer saltvand, 5% normal donkey serum, 0,4% bovint albumin serum og 0,2% Triton X-100) til hver brønd ennd inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Forbered det primære antistof, kanin-anti-Ki67, ved fortynding i blokker opløsning ved en blandingsforhold på 1: 200.
- Fjern blocker opløsning og anvende 100 pi af det primære antistof til hver brønd. Dæk 96-brønds plade og inkuber prøverne ved 4 ° C natten over.
- Den følgende dag fjernes antistofopløsningen og skylles med PBS for 7 min, 3 gange.
- Forbered det sekundære antistof, æsel anti-kanin Cy3 i blokerende opløsning ved en blandingsforhold på 1: 500. Tilføj DAPI nuklear pletten til det sekundære antistof opløsning ved en fortynding på 1: 100. Efter fjernelse af den sidste PBS skylning anvendes 100 pi af det sekundære antistof / DAPI-opløsning til hver brønd. Der inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 90 min.
- Fjern det sekundære antistof / DAPI-opløsning og skylles hver brønd med PBS i 7 min, 3 gange. Dæk 96-brønds plade og opbevares ved 4 ° C indtil billeddannelse.
- PropiDIUM Iodid Levende / Dead assay
- Mål celledød ved propidiumiodid (PI) udelukkelse assay som beskrevet nedenfor.
- Forbered propidiumiodid pletten opløsning ved en koncentration på 1,5 um i kulturmedier.
- Tilsæt 100 pi 70% ethanol til en brønd af MSC'er i 2 min med henblik på at dræbe disse celler. Dette godt tjener som en positiv kontrol for PI pletten. Størstedelen af MSC'er bliver PI-farvede indikerer celledød. Fjern ethanolopløsning.
- Tilsæt 100 pi propidiumiodid farveopløsning til hver brønd og inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Skyl cellerne med 0,1 M phosphatpuffer i 1 min, 2 gange. Fikseres cellerne med 4% PFA i 0,1 M P0 4 buffer i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern PFA og skyl med PBS tre gange i 7 min.
- Inkuber med DAPI-opløsning (1:50) fortyndet i blokker opløsning i 1 time ved stuetemperatur. Skyl alle brønde medPBS i 7 min, 3 gange.
- Fjern DAPI opløsning og skylles hver brønd med PBS i 7 min, 3 gange. Dæk 96-brønds plade og opbevares ved 4 ° C indtil billeddannelse.
4. Automatiseret Imaging og multibølgelængde Scoring Analysis
- Læg en plade med 96 brønde (tidligere behandlet for Ki67 immunmærkning eller propidiumiodid-farvet) i HCS-systemet og tillade pladen at ækvilibrere i 20 min Åbn HCS erhvervelse og analysesystem billede software.
- Vælg indstillingerne erhvervelse i 10X objektiv anvendelse kamera binning ved 1 og en gevinst indstilling af 2. Find Z-plan, i hvilket cellerne opholde ved at udnytte den automatiske eksponering og beregne forskydningen for hver bølgelængde af interesse. Til denne analyse, tage billeder til DAPI (W1), Cy3 (W2), og FITC (W3). Vælg den maksimale intensitet niveau, hvor de negative kontrolbrønde viser ingen signal for billedoptagelse. Bekræft denne indstilling er passende til positive brønde.
- Acquire plade. Tag billeder og gemme dem i erhvervelse billedet og analyse software database.
- Når billederne er blevet erhvervet, åben billede indsamling og analyse offline software og revision plade data fra billederne erhvervet ovenfor.
- Vælg Multi-bølgelængde scoring analyse. Konfigurer de minimale og maksimale intensiteter for hver bølgelængde.
BEMÆRK: DAPI detektion skal markere farvning omkring hver synlig kerne. Cy3 skal afsløre de positive celler med Ki67 immunreaktivitet (IR) og bør ikke detektere IR under de negative kontroller. For Cy3 Ki67 IR, den omtrentlige minimumsbredde var 7 pm, omtrentlig maksimal bredde var 30 pm, intensiteten over den lokale baggrund var 150 gråtoner, og den mindste farvede område var 50 um 2. - Kør analyse for alle positioner. Eksportere data for at se i regneark.
5. Cell Tracking
- Åbn billede acquisition og analyseprogram og klik på "Review Plate data [DB] ...", vælge plade af interesse.
- Se dataene som "Time vs Well".
- Vælg et af de steder fra afsnittet "Sites" ved at venstreklikke på det ønskede valg. Vælg "Transmitteret ..." under "Bølgelængder:". Højreklik på målet godt i 96 brønde skabelon og klik på "Indlæs billeder".
- Spor cellerne ved at klikke på "Apps" og derefter "Track objekter".
- Brug "Dynamic Data Exchange (DDE)" for at vælge det format til at eksportere data, fx Microsoft Excel.
- Vælg tracking data til eksport, fx forløbet tid, objekt nummer, distance, tidsinterval, hastighed, absolut vinkel, afstand til oprindelse, delta x og delta y.
- Tag hver celle af interesse med "Ctrl-tasten + venstre klik" på target-cellerne.
- Spor celler. Hvis det er nødvendigt, stop / ændre forkert sporing af celler med "ESC", og derefter justere indstillingerne.
- Efter celle sporing er færdig, skal du gemme data med "Log data".
Representative Results
MSC vækstparametre blev undersøgt ved dyrkning af forskellige populationer af MSC'er på forskellige substrater. De fem forskellige populationer af MSC undertyper (MSC'er, GFP-MSC'er BDNF-GFP-MSC'er GDNF-GFP-MSC og BDNF / GDNF-GFP-MSC) blev udpladet i 96-brønds vævskulturplader præ-coatet med forskellige substrater som illustreret i figur 1. Efter fire dages dyrkning blev pladerne fikseret og immunolabeled og / eller farvet med de passende reagenser og derefter undersøgt ved hjælp af HCS-systemet og analyser udført med erhvervelse af billede og analyse software program.
Figur 1:. 96-brønds plade skabelon for eksperimentelle design 96 brønde blev overtrukket med forskellige substrater og brønde blev podet med konstruerede stamceller som vist i skabelonen. Som et eksempel, kun wellls i rækker BF blev anvendt i dette eksperiment. Rækker A, G og H blev efterladt tom. Forkortelser - MSC: mesenchymstamceller; GFP-MSC'er: grønt fluorescerende protein-udtrykkende MSC'er; BDNF-GFP-MSC'er: hjerne neurotrofisk faktor-GFP-udtrykkende MSC'er; GDNF-GFP-MSC'er; Glial cell-neurotrofisk faktor-GFP-udtrykkende MSC'er; BDNF / GDNF-GFP-MSC'er; BDNF og GDNF- GFP-udtrykkende MSC'er; ECL: entactin-Collagen IV-laminin).
Anti-Ki67 immunolabeling efterfulgt af DAPI-modfarvning, blev anvendt til at vurdere, om de forskellige substrater påvirket proliferation af de forskellige populationer af manipulerede MSC'er (figur 2A). Ekspression af Ki67 antigen sker fortrinsvis under sene G 1, S, G2 og M-faser af cellecyklus og er ikke detekteret i celler i hvilende fase (G 0), og er derfor anvendelig som et cellulært markør for proliferation 15 . 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) er et almindeligt anvendt nuklar og kromosom kontrastfarve, der udsender blå fluorescens ved binding til AT områder af DNA 16. Det totale antal af celler i et felt, kan bestemmes ved at tælle antallet af DAPI farvede kerner. Som illustreret i figur 2B, selv om der var forskel i procentdelen af prolifererende MSC'er alle substrater understøttes alligevel betydelig celleproliferation for hver af MSC undertyper.
Figur 2: Ki67 celleproliferationsassay. (A) lagt sammen, dobbelt-fluorescerende billede af Ki67 immunolabeling (rød) og DAPI (blå) kernefarvning. Mange af MSC'er immunolabeled med Ki67 antistof (rød). Scale bar = 50 um. (B) søjlegraf, der illustrerer de procentdele af Ki67 immunolabeled MSC undertyper dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronectin, collagentype I, laminin, eller entactin-collagen IV-laminin (ECL) substrater i 5 dage in vitro (DIV). N = et eksperiment. Hver søjle repræsenterer gennemsnit poolede data fra 8 afbildede steder fra 2 brønde til hver betingelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Propidiumiodid (PI) farvning blev anvendt til at vurdere, om forskellige substrater påvirket celleoverlevelse (figur 3). Propidiumiodid er et almindeligt anvendt rød-fluorescerende nukleare og kromosom kontrastfarve. Propidiumiodid er membran impermeabel og generelt udelukket fra levedygtige celler, og således er nyttigt til påvisning af døde celler i en population. Andelen af døde celler inden for en given tilstand kan bestemmes, når den kombineres med en generel nuklear mærke som DAPI at identificere alle celler i et område. Procentdelen af PI-positive celler var lav på alle undersøgte substrater (Figur 3). Som en positiv kontrol for PI reagens blev nogle brønde indeholdende MSC'er inkuberes i 70% ethanol, en tilstand kendt for at dræbe de fleste celler, hvilket resulterer i en høj procentdel af PI-mærkede celler, som illustreret i figur 3B og 3C (ethanol behandlet positiv kontrol).
Figur 3: propidiumiodid celledød assay. (A) lagt sammen, dobbelt fluorescerende billede for propidiumiodid (rød) og DAPI (blå) farvning. Selv kernerne i alle de levedygtige celler blev farvet med DAPI (blå), blev der ikke propidiumiodidfarvning påvist i MSC'er. (B) Næsten alle MSC'er blev farvet med propidiumiodid efter udsættelse for 70% ethanol. Skalapanelerne i A og B = 100 um. (C) søjlegraf, der illustrerer de procentdele af propidiumiodid (PI) farves MSC subtypes dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronectin, collagen type I, laminin, eller entactin-collagen IV-laminin (ECL) substrater i 5 dage in vitro (DIV). Ethanol Control: Denne betingelse tjente som en positiv kontrol for PI farvningsreagens. De fleste celler udsat for PI pletten efter ethanol behandling er døde og dermed positivt farvet for PI reagens. N = et eksperiment. Hver søjle repræsenterer gennemsnit poolede data fra 8 afbildede steder fra 2 brønde til hver betingelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
For at undersøge den mulige indflydelse af forskellige substrater på adfærd manipuleret MSC blev cellemigrationen analyseres ved time-lapse digitale mikroskopi og det transmitterede lys / miljø-systemet kammer på HCS-systemet (se Supplemental Video 1). Flere steder / brønd blev time-lapse afbildetog anvendes til at beregne celle migration satser for de forskellige subpopulationer af MSC vokser på forskellige substrater ved hjælp af indsamling og analyse billede program. Generelt, som vist i figur 4C, alle undertyper af MSC'er viste den hurtigste vandringshastighed på den ekstracellulære matrix-coatede overflader (fibronectin, collagen, laminin og ECL) og den langsomste på ikke-coatede polystyrenoverflader.
Figur 4:. Cell tracking og migration MSC'er spores med køb image og analysesoftware. Overlagt billeder af transmitteret lys og fluorescens billeder fra (A) i starten af time-lapse billeddannelse og (B) på 29 timer senere i slutningen af time-lapse imaging session (se Supplemental Video 1). Cellemigration spor er angivet med den farvede liNes. Scale bar:. 50 um (C) søjlegraf, der illustrerer den gennemsnitlige migrationsrater (udtrykt som um / time) for MSC undertyper dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronectin, collagen type I, laminin, eller entactin-collagen IV-laminin (ECL) substrater for 2 dage in vitro (DIV). N = et eksperiment. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet af mindst 10 afbildede celler fra 2 brønde til hver betingelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tilsammen disse resultater giver foreløbige beviser, at disse delpopulationer af gensplejsede MSC'er vise lignende egenskaber vækst. Disse resultater giver overbevisende dokumentation for, at den lentivirale medierede genetiske modifikationer af disse MSC'erne inducerede ingen dramatiske påviselige skadelige virkninger på de vækstparametre undersøgte ved hjælp af denne screening platform.
Supplerende Video 1. Time-lapse digitale video af MSC sporing ved hjælp af indsamling og analyse billede program. Migrationen sti er to MSC [angivet som 1 (grøn sporing linje) og 2 (blå sporing linje)] er illustreret. Video fanget i en 29 timers periode. Billeder blev fanget hver 5 min. Fluorescens billeder af GFP-udtrykkende MSC'er blev anvendt til time-lapse billeddannelse i forberedelsen videoen. Kalibrering bar = 50 um. Denne type analyse er nyttig til undersøgelse celle adfærd, herunder celle migration og celledeling.
Discussion
Voksne mesenkymale stamceller (MSC'er) er et attraktivt celletype til udvikling af en eksperimentel strategi, der kombinerer et cellulært og genafgivelse baseret terapi. MSC'er er multipotente i stand til at differentiere til celler af mesodermal afstamning, og vise betydelig plasticitet, differentiere / transdifferentiating i neuronale og gliale afstamninger med passende induktion paradigmer 17,18. Endvidere har MSC'er blevet transplanteret og i prækliniske undersøgelser vist sig effektiv for en række lidelser, herunder neurodegenerative tilstande 19. Den terapeutiske effekt af MSC'er er velkendt på grund af deres gavnlige anti-proliferative, anti-inflammatoriske og anti-apoptotiske aktiviteter 20. MSC'er er også kendt for at producere og udskille forskellige neurotrofiske og vækstfaktorer, som sandsynligvis bidrager til de neurobeskyttende egenskaber, der er forbundet med naive MSC'er efter transplantation på steder med skade eller sygdom 21. Importantly kan MSC'er genetisk modificeret med henblik på vedvarende levering af neurotrofiske faktorer for kombinerede cellulær og gen-terapi-baserede applikationer og er blevet anvendt i en række dyremodeller for skade eller sygdom til CNS 11,19,22.
Ved at udvikle en kombineret cellulært og genterapi funderet, er det vigtigt, at sundheden af cellerne omhyggeligt vurderes forud for deres omfattende brug for in vitro, og især in vivo applikationer. Som et bevis for koncept, vi undersøgte flere populationer af konstruerede og kontrol MSC linjer for at studere konsekvenserne af de genetiske ændringer på celle sundhed og fitness hjælp af et højt indhold screening (HCS) tilgang. Generelt HCS henviser til cellulær billedbaseret high throughput screening 14. Denne screening tilgang tillader en kvantitativ vurdering af cellulære fænotyper på flere niveauer af fysisk (celle til subcellulær) og tidsmæssige (millisekunder til dage) resolution tværs af forskellige eksperimentelle betingelser. Ved hjælp af denne metode, vi adgang til eventuelle forskelle i substrat præference på følgende parametre: celleproliferation, udtryk for grønt fluorescerende protein (GFP), celledød og cellemotilitet / migration. Eksperimenter blev designet i 96-brønds celledyrkningsplade format. Inden for en enkelt plade vi rutinemæssigt undersøgt mulige substrat-relaterede forskelle med hensyn til hver parameter for de forskellige MSC populationer af lentivirale-transducerede celler og sammenlignet de manipulerede MSC'er med det oprindelige, ikke-transducerede MSC. Dette gav et middel til direkte at sammenligne resultaterne for de forskellige MSC undertyper med et batteri af in vitro-assays, såsom celleproliferation ved hjælp Ki67 immunolabeling, live / døde cellernes levedygtighed under anvendelse propidiumiodidfarvning, og celle adfærd ved at udføre time-lapse digitale billeder . I forlængelse af denne HCS kan man også udføre ELISA'er på konditionerede medier prøver fra individuel walen for kvantitativt at bestemme udskillelsen af neurotrofiske faktorer. Konditioneret medie fra forskellige MSC-undertyper kan også anvendes i in vitro-bioassays for at bestemme den biologiske aktivitet af udskilte faktorer 11,23. Denne type HCS platform kan også anvendes til in vitro målinger af neuritudvækst fra primære neuronale kulturer og neurale stamcellelinjer 24. Samlet set vores resultater viste, at delpopulationerne af de genetisk modificerede MSC'er viste lignende adfærd i forhold til de ikke-modificerede MSC'er. Indflydelsen af forskelligartede kultur substrater på cellevækst og cellevandring ikke var dramatisk anderledes mellem MSC undertyper, samt kultur substrater. Som sådan har den ekstracellulære matrix testede substrater ikke synes at spille en kritisk rolle ved modulering af disse aspekter af celle adfærd for disse forskellige Engineered MSC'er.
Denne undersøgelse viser anvendelsen af et HCS-system til analyse different aspekter af celle adfærd. Imidlertid er det ikke ualmindeligt at støde begrænsninger forbundet med billedanalyse. Den lejlighed, mens analysere fluorescensbilleder, det var lidt svært at bestemme den korrekte grænseværdi over hvilken immunolabeled eller farvede celler vil blive talt som positivt mærket / plettet. Således at minimere subjektive bias, fastsættelsen af tærskelværdier var afhængig af en sammenligning med kontroller (negative kontroller for fluorescens billeddannelse blev udført parallelt under al behandling ved udeladelsen af de primære eller sekundære antistoffer). En anden begrænsning opstod under analysen af cellemigrering hjælp tids- bortfalder digital billedbehandling. I nogle tilfælde imaging software ikke var i stand til at skelne mellem tilfældige Brownske bevægelser af en celle versus en celle faktisk migrere kun en meget kort afstand. Yderligere begrænsninger var tydelige i situationer, hvor analyse software ikke var i stand til at skelne tilstedeværelsen af multiple celler i meget tæt nærhed til en anden. For at overvinde denne begrænsning krævede udvælgelse manuel celle under analysen snarere end en fuldt automatiseret analyse. Cell udpladningsdensitet kan også resultere i skævvridning datacelle vandring mellem populationer af celler, der udviser større præference at vokse i klumper versus celler, der vokser i isolation fra hinanden. Disse typer af forskelle i del sandsynligt en refleksion af celle-substrat versus celle-celle præferencer.
Brug af et HCS-system til at erhverve billeder og udfører dataanalyse giver en effektiv og hurtig måde til at vurdere flere celleparametre. Desuden blev time-lapse digitale videoer i 30 forskellige betingelser (6 substrater og 5 forskellige MSC undertyper) rutinemæssigt erhvervet i en periode fra timer til dage (48 timer), mens du bruger den miljømæssige kammer. Disse data blev efterfølgende anvendt til at beregne og bestemme forskelle i celle migration satser på tværs af forskellige cellelinjer på forskellige ECMmolekyler.
I denne rapport har vi sat fokus på gennemførelsen af et højt indhold screening platform til at vurdere celle sundhed og funktion. Denne type analyse er nyttigt for at udvikle rationelle strategier til at designe celletyper samt polymersubstrater at lette rettet cellevækst og neural regeneration. Dette er et vigtigt skridt hen imod anvendelsen af stamceller-baserede levering af terapeutiske faktorer forud for omfattende in vivo prækliniske undersøgelser under anvendelse af celle transplantation strategier.
Disclosures
Offentliggørelse gebyrer for denne video artikel er støttet af Molecular Devices, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1x) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
References
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
- Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
- Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
- Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
- Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
- Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
- Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
- Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
- Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
- Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
- Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
- Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
- Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
- Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
- Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
- Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
- Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).
