Introduction
Un grosso problema con l'attuazione di terapie per il trattamento di disturbi del sistema nervoso è in sviluppo di metodi efficaci che impediscono un'ulteriore degenerazione e anche a favorire il recupero della funzione. Una strategia innovativa è geneticamente le cellule staminali ingegnere ex vivo, per la produzione di fattori neuroprotettivi, prima della loro trapianto. Questa combinazione di terapia cellulare, accoppiato con un tipo di terapia genica, fornisce un metodo efficace per il trattamento della malattia o morte neuronale indotta da lesioni del sistema nervoso.
Fattori neurotrofici sono essenziali per la crescita e la sopravvivenza dei neuroni in via di sviluppo, così come la manutenzione e la plasticità dei neuroni maturi. Numerosi studi hanno dimostrato un ruolo significativo di fattori neurotrofici nel promuovere la crescita iniziale e la differenziazione dei neuroni nel sistema nervoso centrale e periferico (CNS e PNS) e possono anche stimolare la rigenerazione in vitro ed inmodelli Nimal di danno neuronale 1. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) è altamente espresso nel SNC e svolge un ruolo importante nel regolare lo sviluppo neurale, la plasticità sinaptica e riparazione 2. Line-derivato cellule gliali fattore neurotrofico (GDNF) promuove la sopravvivenza di molti tipi di neuroni dopaminergici e compreso motoneuroni 3. Così, una strategia importante per la riparazione neurale è di fornire fonti esogene di fattori neurotrofici alle regioni lese o malate del sistema nervoso.
Cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo multipotenti (MSC) tengono un grande potenziale per la consegna di proteine terapeutiche per curare il sistema nervoso danneggiato o malato. Il trapianto di cellule staminali mesenchimali ha attirato notevole attenzione negli sforzi per sviluppare terapie cellulari compatibili paziente dal momento che hanno una serie di vantaggi tra cui, 1) relativa facilità di isolamento e di manutenzione, 2) capacità multipotenziale, 3) piccole preoccupazioni etiche, 4) Capacità di sopravvivere e migrare dopo il trapianto e 5) possibilità di trapianto autologo di 4,5. Risultati promettenti sono stati riportati con l'uso di cellule staminali mesenchimali ingenui e geneticamente in modelli animali per un certo numero di diverse malattie neurodegenerative, tra cui lesioni del midollo spinale 6,7, 8,9 ictus, deficit di mielina 10, e la degenerazione della retina 11-13. Accoppiamento trapianto di cellule con la consegna di fattori neurotrofici da cellule staminali geneticamente modificate è un nuovo e importante strategia di riparazione neurale.
Un passo essenziale per lo sviluppo di sistemi di lancio di fattore terapeutico a base di cellule è quello di determinare la normale salute delle cellule ingegnerizzate. Come tale, lo scopo principale di questo studio era quello di valutare i parametri di crescita generali di cellule staminali adulte geneticamente. Un approccio importante per valutare rapidamente i parametri di celle è di impiegare basata sull'immagine cellulari high-through screening (HTS), spesso indicato come alto contenuto di screening (HCS) procedure 14. Questa tecnologia permette l'acquisizione automatica e analisi, e questo approccio è particolarmente adatto per applicazioni di ricerca sulle cellule staminali. In questo progetto abbiamo sviluppato una piattaforma di profiling che consente per la caratterizzazione rapida e l'ottimizzazione delle preferenze substrato cellulare e funzioni cellulari con cellule staminali adulte geneticamente impiegando un sistema HCS.
Protocol
1. Preparazione del supporto per le piastre con 96 pozzetti
- Creare una mappa della piastra a 96 pozzetti illustra i diversi substrati e tipi di cellule da esaminare (Figura 1).
- Ottenere le soluzioni madre di diversi substrati [poli-L-lisina, fibronectina, collagene di tipo I, laminina, e Entactina-collagene IV-laminina (ECL)], una piastra a 96 pozzetti pozzetti e preparare una stazione di lavoro in una coltura cellulare sterile Cappuccio.
- Preparare singoli substrati diluendo magazzino sterile tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione finale di 5 mg / ml (questa concentrazione è stata precedentemente determinata sulla base di un test concentrazione-dipendente substrato per la crescita e la proliferazione delle cellule). Mescolare con un vortice prima di versare in un serbatoio sterile.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di substrato in ogni pozzetto secondo la mappa 96 pozzetti (Figura 1) (una micropipetta 12 o 8 canali è conveniente per micropipetting in una piastra a 96 pozzetti). Sigillare il coperchio alla piastra a 96 pozzetti utilizzando una striscia di Parafilm e memorizzare una notte a 4 ° C.
2. Cella placcatura e Time-lapse imaging
NOTA: Mouse cellule staminali mesenchimali sono state isolate dal midollo osseo di adulti C57BL / 6 topi e mantenuto come una linea di cellule aderenti. MSC sono stati infettati con vettori lentivirali per progettare loro di secernere cervello-derived neurotrophic factor (BDNF; cDNA umani) e gliali cellule fattore neurotrofico derivato (GDNF; cDNA umano) utilizzando di vettori lentivirali codifica BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), e la proteina verde fluorescente (GFP, LV-GFP, CMV-GFP).
NOTA: Mezzi di coltura per cellule staminali del mouse mesenchimali (MSC) è modificato medio Dulbecco di Iscove contenente il 10% siero fetale ibridoma qualificato bovina, siero equino del 10%, 2 mM L-glutammina, e 10.000 U / ml di penicillina, 10 mg / streptomicina ml . I cinque diversi tipi di cellule staminali mesenchimali di topo (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC e BDNF / GDNF-GFP-MSC) sono state placcate a circa 30% di confluenza in T75 fiasche di coltura cellulare.
- Cella placcatura
- Il giorno seguente, rimuovere le soluzioni del substrato mediante aspirazione e lavare ogni pozzetto con circa 200 ml di PBS sterile, due volte. Aggiungi mezzi di coltura cellulare (200 ml / pozzetto) per ciascun bene dopo la PBS risciacquo finale. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 per equilibrazione.
- Mentre la piastra a 96 pozzetti è equilibrante in incubatrice, raccogliere le cellule (cellule staminali mesenchimali in palloni T75 dovrebbe essere circa il 70% confluenti al momento della raccolta / placcatura) raccogliendo i mezzi di crescita (di cui i media come condizionata) dal pallone T75 e memorizzazione in un tubo da 15 ml in condizioni sterili (questo mezzi condizionati verrà utilizzato nel passaggio 2.1.4).
- Aggiungere 8 ml di PBS sterile al pallone e mescolare delicatamente e poi pipetta al largo della PBS e aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina e 0,01%Soluzione EDTA staccare le cellule dalla superficie del pallone di coltura T75. Monitorare distacco cellulare visualizzando il pallone con un microscopio invertito equipaggiato con ottica a contrasto di fase.
- Quando le cellule sono distaccato, aggiungere immediatamente 8 ml di mezzi condizionati (raccolte nella fase 2.1.2) al pallone. Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirli in un 15 ml conica provetta da centrifuga e centrifugare per 4 min a 450 xg per far sedimentare le cellule.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 ml di fresca e riscaldata (37 ° C), mezzi di coltura cellulare.
- Determinare il numero di cellule in sospensione cellulare eseguendo un trypan blue conteggio delle cellule vitali utilizzando un emocitometro. Piastra le cellule ad una densità di circa 300 cellule / pozzetto nei pozzetti, all'interno della piastra a 96 pozzetti.
- Ripetere questi passaggi per ogni popolazione di cellule.
- Time-lapse imaging
- Una volta che tutte le cellule staminali mesenchimali sono stati placcati, luogola piastra a 96 pozzetti in un incubatore per 2 ore per consentire le MSC da allegare al substrato.
- Avviare il sistema HCS e attendere 2 ore per il sistema si riequilibri. Impostare il controller ambientale a 37 ° C e collegare una bombola di gas misto contenente 5% di CO 2 in aria al sistema camera ambientale HCS fornire una fonte di aria costante.
- Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore successivo al periodo di equilibrazione 2 hr e posizionare direttamente nella camera di crescita delle cellule del sistema HCS. Lasciare 30 minuti per il raggiungimento dell'equilibrio di compensare qualsiasi dilatazione termica della lastra e quindi avviare il software di acquisizione e analisi delle immagini per configurare le impostazioni della piastra.
- Selezionare l'obiettivo 20X per l'imaging. Selezionare due pozzi per condizione [cioè, GFP-MSC su fibronectina ecc (6 substrati x 5 sottotipi MSC per un totale di 30 condizioni x 2 repliche = 60 pozzi in totale)] per l'impostazione di time-lapse imaging. Scegli due siti per l'imaging conin ciascun pozzetto.
- Scegli le lunghezze d'onda della luce corretti per l'imaging.
NOTA: due diverse lunghezze d'onda (contrasto di fase e fluorescenza GFP) sono stati selezionati per l'imaging time-lapse. - Focus sul fondo e con l'autofocus laser e prendere immagini di prova per più siti e più pozzi di trovare un piano focale ottimizzato.
- Una volta che il fuoco è stato stabilito, iniziare l'acquisizione immagini ogni 5 minuti per 48 ore per tutti i 60 pozzi (120 siti).
- Feed cellule ogni 24 ore rimuovendo la piastra a 96 pozzetti dal sistema HCS. Rimuovere 75 ml di supporti da ciascun pozzetto e aggiungere 100 ml di terreno fresco in ciascun pozzetto (equilibrare questo mezzo fresco a 37 ° C e 5% CO 2).
- Alla fine dell'esperimento time-lapse, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal sistema HCS. In condizioni sterili, raccogliere i campioni dei media condizionati da ogni bene e trasferire questi campioni a un'altra piastra da 96 pozzetti.
NOTA: Questi campioni possono essere utilizzati per ulteriori analysè eseguendo ELISA per fattori neurotrofici. - Preparare la piastra a 96 pozzetti con MSC coltivate per test aggiuntivi come la proliferazione cellulare Ki67 test o ioduro di propidio vivo test colorazione / morti (vedi dettagli sotto).
- Eseguire l'analisi time-lapse imaging per la cella di monitoraggio della migrazione / cella come descritto nella sezione 5.
3. Ki67 proliferazione cellulare e ioduro di propidio Live / Assay Morto
- Ki67 Cell Proliferation Assay (Immunocytochemistry)
- Sciacquare le colture cellulari con 0,1 M di fosfato (PO 4) tampone per un minuto due volte. Fissare la coltura con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la PFA e lavare i pozzetti con PBS per sette minuti tre volte.
- Dopo il risciacquo finale, aggiungere 100 ml di soluzione bloccante (tampone fosfato salino, siero asino normale 5%, albumina sierica bovina 0,4% e 0,2% Triton X-100) a ciascun pozzetto unnd incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Preparare l'anticorpo primario, coniglio anti-Ki67, diluendo in soluzione bloccante con un rapporto di lavoro di 1: 200.
- Rimuovere la soluzione bloccante e applicare 100 microlitri della soluzione di anticorpo primario a ciascun pozzetto. Coprire la piastra a 96 pozzetti e incubare i campioni a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per 7 minuti, 3 volte.
- Preparare l'anticorpo secondario, asino anti-coniglio Cy3 nel bloccare soluzione con un rapporto di lavoro di 1: 500. Aggiungere DAPI colorazione nucleare alla soluzione di anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 100. Dopo la rimozione dell'ultimo risciacquo PBS, applicare 100 microlitri della soluzione di anticorpo / DAPI secondario in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente al buio per 90 min.
- Rimuovere l'anticorpo soluzione secondaria / DAPI e sciacquare ogni bene con PBS per 7 minuti, 3 volte. Coprire la piastra a 96 pozzetti e conservare a 4 ° C fino imaging.
- Propidium ioduro Live / Assay Morto
- Misurare la morte cellulare mediante ioduro di propidio (PI) test di esclusione come descritto di seguito.
- Preparare la soluzione di colorazione con ioduro di propidio ad una concentrazione di 1,5 mM in coltura.
- Aggiungere 100 ml di etanolo al 70% ad un pozzetto della MSC per 2 minuti con l'intenzione di uccidere le cellule. Questo pozzo serve come controllo positivo per la macchia PI. La maggior parte del MSC sarà PI-tinto indicando morte cellulare. Rimuovere la soluzione di etanolo.
- Aggiungere 100 pl di soluzione di ioduro di propidio macchia a ciascun pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Risciacquare le cellule con tampone fosfato 0,1 M per 1 minuto, 2 volte. Fissare le cellule con 4% PFA in 0.1 M P0 4 buffer per 20 min a temperatura ambiente. Rimuovere la PFA e risciacquare con PBS per tre volte per 7 min.
- Incubare con la soluzione DAPI (1:50) diluito in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare tutti i pozzetti conPBS per 7 minuti, 3 volte.
- Rimuovere la soluzione DAPI e sciacquare ogni bene con PBS per 7 minuti, 3 volte. Coprire la piastra a 96 pozzetti e conservare a 4 ° C fino imaging.
Analisi 4. Automated Imaging e Multiwavelength Scoring
- Caricare una piastra a 96 pozzetti (precedentemente trattati per Ki67 immunomarcatura o ioduro di propidio tinto) nel sistema HCS e lasciare la piastra per equilibrare per 20 minuti Aprire il software di acquisizione delle immagini di sistema e l'analisi HCS.
- Scegliere le impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 10X con fotocamera binning a 1 e un'impostazione di guadagno pari a 2. Trovare la Z-piano in cui le cellule risiedono utilizzando la funzione Auto Exposure e calcolare l'offset per ogni lunghezza d'onda di interesse. Per questa analisi, catturare immagini per DAPI (W1), Cy3 (W2), e FITC (W3). Scegliere il livello massimo di intensità con cui i pozzetti di controllo negativo mostrano alcun segnale per l'acquisizione delle immagini. Confermare questa impostazione è appropriata per la pospozzi itive.
- Acquisire piatto. Catturare immagini e memorizzarli nella acquisizione delle immagini e il database del software di analisi.
- Una volta che le immagini sono state acquisite, un'immagine aperta acquisizione e l'analisi di software offline e piastra revisione dei dati dalle immagini acquisite in precedenza.
- Selezionare l'analisi punteggio Multi-lunghezza d'onda. Configurare l'intensità minima e massima per ogni lunghezza d'onda.
NOTA: rilevazione DAPI dovrebbe segnare la colorazione intorno ad ogni nucleo visibile. Cy3 dovrebbe rilevare le cellule positive con Ki67 immunoreattività (IR) e non dovrebbe rilevare IR nelle controlli negativi. Per Cy3 Ki67 IR, la larghezza minima approssimativa era 7 micron, approssimata larghezza massima è stata di 30 micron, l'intensità sopra lo sfondo locale era 150 livelli di grigio, e l'area minima macchiata era 50 um 2. - Eseguire l'analisi per tutte le posizioni. Esportare i dati da visualizzare nel foglio di calcolo.
Monitoraggio 5. cellulare
- Apri immagine acquisition e programma di analisi e cliccare su "Review targhetta [DB] ...", selezionando il piatto di interesse.
- Visualizza i dati come "Time vs Well".
- Scegli uno dei siti dalla sezione "Siti" cliccando a sinistra sulla selezione desiderata. Selezionare "trasmesso ..." sotto il "lunghezze d'onda:". Fare clic destro sul target ben nel modello a 96 pozzetti e fare clic su "Carica immagini".
- Traccia le cellule facendo clic su "Apps" e quindi "Traccia oggetti".
- Utilizzare "Dynamic Data Exchange (DDE)" per scegliere il formato di esportazione dei dati, ad esempio, Microsoft Excel.
- Scegli i dati di tracciamento delle esportazioni, ad esempio, il tempo trascorso, il numero di oggetti, la distanza, l'intervallo di tempo, velocità, angolo di assoluto, distanza origine, delta x e y delta.
- Tag ogni cella di interesse con "Ctrl + click sinistro" sulle cellule bersaglio.
- Cellule pista. Se necessario, interrompere / modificare tracciamento improprio delle cellule con il tasto "Esc" e quindi regolare le impostazioni.
- Dopo il monitoraggio delle cellule è completa, salvare i dati con "Data Log".
Representative Results
Parametri di crescita MSC sono stati esaminati coltivando le diverse popolazioni di MSC su substrati diversi. Le cinque diverse popolazioni di sottotipi MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, e BDNF / GDNF-GFP-MSC) sono stati placcati in piastre da 96 pozzetti colture di tessuti pre-rivestiti con il diverso substrati come illustrato in figura 1. Dopo quattro giorni di coltura, le piastre sono state fissate e immunolabeled e / o colorati con i reagenti appropriati e poi esaminati usando il sistema HCS e analisi condotte con l'acquisizione delle immagini e il programma software di analisi.
Figura 1:. Template piastra a 96 pozzetti per il disegno sperimentale piastre a 96 pozzetti sono stati rivestiti con vari substrati e pozzi sono stati seminati con cellule staminali ingegnerizzate come mostrato nel modello. Ad esempio, solo wells nelle righe BF sono stati usati in questo esperimento. Righe A, G e H sono stati lasciati vuoti. Abbreviazioni - MSC: cellule staminali mesenchimali; GFP-MSC: MSC-proteina fluorescente verde che esprime; BDNF-GFP-MSC: cervello derivato MSC-factor-GFP che esprimono neurotrofici; GDNF-GFP-MSC; Glial derivato dalle cellule MSC-factor-GFP che esprimono neurotrofici; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF e GDNF--GFP che esprimono MSC; ECL: Entactina-collagene IV-laminina).
Anti-Ki67 immunomarcatura, seguito da DAPI di contrasto, è stato utilizzato per valutare se i diversi substrati influenzato la proliferazione delle diverse popolazioni di MSC ingegnerizzate (Figura 2a). Espressione dell'antigene Ki67 avviene preferenzialmente durante fasi tardive G 1, S, G 2 e M del ciclo cellulare, e non viene rilevato in cellule nella fase di riposo (G 0), e quindi è utile come marcatore di proliferazione cellulare 15 . 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è un nu comunemente usatocontrasto chiaro e cromosoma che emette fluorescenza blu su legame con AT regioni del DNA 16. Il numero totale di cellule in un campo può essere determinata contando il numero di nuclei DAPI colorati. Come illustrato nella Figura 2B, anche se c'era variazione delle percentuali di MSC proliferanti, tutti i substrati comunque supportate notevole proliferazione cellulare per ciascuno dei sottotipi MSC.
Figura 2: Ki67 saggio di proliferazione cellulare. (A) Fusa, doppio-fluorescente immagine di Ki67 immunomarcatura (rosso) e DAPI (blu) colorazione nucleare. Molte delle cellule staminali mesenchimali sono state immunolabeled con l'anticorpo Ki67 (rosso). Bar Scala = 50 micron. (B) Grafico a barre che illustra le percentuali di Ki67 immunolabeled sottotipi MSC coltivate su polistirolo (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagenetipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 5 giorni in vitro (DIV). N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media dei dati raccolti da 8 siti impressi da 2 pozzi per ogni condizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Propidio ioduro (PI) colorazione è stato usato per valutare se differenti substrati influenzati sopravvivenza cellulare (Figura 3). Propidio ioduro è un contrasto nucleare e cromosoma rosso fluorescenti comunemente utilizzati. Propidio ioduro è membrana impermeant e generalmente esclusi dalla cellule vitali, e quindi è utile per rilevare le cellule morte in una popolazione. La percentuale di cellule morte entro una data condizione può essere determinata quando combinato con un'etichetta nucleare generale come DAPI per identificare tutte le celle all'interno di un campo. La percentuale di cellule PI-positivi era bassa su tutte le superfici esaminati (Figura 3). Come controllo positivo per il reagente PI, alcuni pozzetti contenenti cellule staminali mesenchimali sono stati incubati in 70% di etanolo, una condizione nota per uccidere maggior parte delle cellule, risultante in una elevata percentuale di cellule PI-etichettato come illustrato in Figura 3B e 3C (etanolo trattata positiva controllo).
Figura 3: ioduro propidio test morte cellulare. (A) Fusa, immagine doppia fluorescente per ioduro di propidio (rosso) e DAPI (blu) colorazione. Sebbene i nuclei di tutte le cellule vitali sono state colorate con DAPI (blu), nessuna colorazione ioduro di propidio è stato rilevato nel MSC. (B) Virtualmente tutti MSC sono state colorate con ioduro di propidio seguito all'esposizione al 70% di etanolo. Bar Scala in A e B = 100 micron. (C) Grafico a barre che illustra le percentuali di ioduro di propidio (PI) macchiato MSC sottotipos coltivate su polistirene (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagene di tipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 5 giorni in vitro (DIV). Etanolo Controllo: Questa condizione servito come controllo positivo per il reagente PI colorazione. La maggior parte delle cellule sottoposte a colorazione PI dopo il trattamento etanolo sono morti e quindi colorate positivamente per il reagente PI. N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media dei dati raccolti da 8 siti impressi da 2 pozzi per ogni condizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per studiare la possibile influenza di diversi substrati sul comportamento di MSC ingegnerizzate, la migrazione delle cellule è stato analizzato usando la microscopia digitale time-lapse e il sistema di trasmissione della luce / ambientale da camera sul sistema HCS (vedi Supplemental Video 1). Più siti / e sono stati time-lapse ripresoe utilizzato per calcolare i tassi di migrazione delle cellule per le diverse sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali che crescono sui diversi substrati utilizzando il programma software di acquisizione e analisi delle immagini. In generale, come mostrato nella Figura 4C, tutti i sottotipi di MSC mostrano il tasso di migrazione più rapida sulle superfici della matrice extracellulare rivestite (fibronectina, collagene, laminina e ECL) e il più lento su superfici non rivestite polistirene.
Figura 4:. Monitoraggio delle cellule e la migrazione MSC monitorati con l'acquisizione delle immagini e software di analisi. Immagini sovrapposto di luce e fluorescenza immagini trasmesse da (A) l'inizio del time-lapse imaging e (B) a 29 ore più tardi al termine della sessione di imaging time-lapse (vedi Supplemental Video 1). Tracce di migrazione cellulare sono indicati dal li coloratanes. Scala bar:. 50 graph micron (C) Bar illustrare i tassi medi di migrazione (espressa in micron / h) per i sottotipi MSC coltivate su polistirene (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagene di tipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 2 giorni in vitro (DIV). N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media di almeno 10 celle impressi da 2 pozzi per ogni condizione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Presi insieme, questi risultati forniscono la prova preliminare che tali sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali geneticamente visualizzare le proprietà di crescita simili. Questi risultati forniscono prove convincenti che la lentiviral mediata modificazioni genetiche di queste cellule staminali mesenchimali indotte non drammatici effetti deleteri rilevabili sui parametri di crescita indagati utilizzando questa piattaforma di screening.
Supplemental Video 1. Time-lapse video digitale di MSC monitoraggio utilizzando il programma software di acquisizione e analisi delle immagini. Il percorso di migrazione è per due MSC [indicati come 1 (linea di tracciamento verde) e 2 (Blu linea di inseguimento)] sono illustrati. Video catturato nel corso di un periodo di 29 ore. Le immagini sono state catturate ogni 5 min. Immagini di fluorescenza di MSC-GFP che esprimono è stato utilizzato per l'imaging time-lapse in preparazione del video. Bar Calibration = 50 micron. Questo tipo di analisi è utile per studiare comportamenti cellulari, compresa la migrazione cellulare e la divisione cellulare.
Discussion
Le cellule staminali mesenchimali adulte (MSC) sono un tipo di cellula interessante per lo sviluppo di una strategia sperimentale che combina una terapia a base di consegna cellulare e genica. MSC sono multipotenti, in grado di differenziarsi in cellule della linea mesodermal, e mostrano una notevole plasticità, differenziando / transdifferentiating in lignaggi neuronali e gliali con l'induzione appropriata paradigmi 17,18. Inoltre, MSC sono stati trapiantati e dimostrata efficace in studi preclinici per una serie di disturbi, tra cui le condizioni neurodegenerative 19. L'efficacia terapeutica delle cellule staminali mesenchimali è ben noto a causa della loro benefici anti-proliferativi, attività anti-infiammatori e anti-apoptotici 20. MSC sono anche noti per produrre e secernere diversi fattori neurotrofici e di crescita, che probabilmente contribuisce alle qualità neuroprotettivi associati MSC ingenui dopo il trapianto in siti di lesioni o malattie 21. Importantly, MSC possono essere geneticamente modificati per la consegna costante di fattori neurotrofici per applicazioni combinate a base di terapia genica, cellulare e e sono stati utilizzati in un certo numero di modelli animali di lesioni o malattie al sistema nervoso centrale 11,19,22.
Nello sviluppo di una strategia basata terapia cellulare e genica combinato, è importante che la salute delle cellule è attentamente valutato prima del loro ampio uso in vitro, e in particolare in applicazioni in vivo. Come prova di concetto, abbiamo studiato diverse popolazioni di linee progettate e controllo MSC per studiare le conseguenze delle modificazioni genetiche per la salute cellulare e fitness utilizzando un approccio di screening ad alto contenuto (HCS). In generale, HCS si riferisce a un'immagine basata su cellulare ad alta velocità di screening 14. Questo approccio di screening permette una valutazione quantitativa dei fenotipi cellulari a più livelli di spazio (cellulari per subcellulare) e temporali (millisecondi per giorni) resoluzione attraverso varie condizioni sperimentali. Utilizzando questo approccio abbiamo accedessimo possibili differenze di substrato preferenza sui seguenti parametri: proliferazione cellulare, espressione della proteina fluorescente verde (GFP), morte cellulare, e la motilità cellulare / migrazione. Gli esperimenti sono stati progettati in 96 pozzetti formato piastra di coltura cellulare. All'interno di un singolo piatto che abitualmente studiato le possibili differenze di substrato legati rispetto a ciascun parametro per le diverse popolazioni di cellule MSC lentivirali-trasdotte e confrontato le MSC ingegnerizzate con l'originale, MSC non trasdotte. Questo ha fornito un mezzo per confrontare direttamente i risultati dei diversi sottotipi MSC con una batteria di test in vitro, come la proliferazione cellulare utilizzando Ki67 immunomarcatura, dal vivo / morto test vitalità cellulare tramite ioduro di propidio colorazione, e il comportamento delle cellule effettuando digital imaging time-lapse . Come estensione di questo HCS si può anche effettuare test ELISA su campioni di media condizionati raccolti da individuo wells per determinare quantitativamente la secrezione di fattori neurotrofici. Supporti condizionata da diversi sottotipi MSC può essere utilizzato anche in biosaggi in vitro per determinare l'attività biologica di fattori secreti 11,23. Questo tipo di piattaforma HCS può essere utilizzato anche per misurazioni in vitro di crescita dei neuriti da colture neuronali primarie e linee cellulari staminali neurali 24. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che le sottopopolazioni delle MSC geneticamente modificati visualizzati comportamenti simili rispetto ai MSC non modificati. L'influenza di diversi substrati di coltura sulla crescita cellulare e la migrazione delle cellule non era notevolmente diversa tra i sottotipi MSC, così come substrati di coltura. Come tale, i substrati della matrice extracellulare testati non sembrano giocare un ruolo critico nel modulare questi aspetti del comportamento delle cellule per queste diverse MSC ingegnerizzati.
Questo studio dimostra l'uso di un sistema per l'analisi HCS differenAspetti t del comportamento delle cellule. Tuttavia, non è raro incontrare limitazioni associate analisi dell'immagine. Occasionalmente, analizzando le immagini di fluorescenza, era alquanto difficile determinare il valore di soglia corretto sopra del quale immunolabeled o cellule colorate saranno contati come positivamente etichettata / macchiato. Così, per minimizzare i bias personale, la determinazione dei valori di soglia è dipendente da una rispetto ai controlli (controlli negativi per l'imaging di fluorescenza sono state effettuate in parallelo durante tutte le elaborazioni per l'omissione degli anticorpi primari o secondari). Un altro limite è stato rilevato durante l'analisi della migrazione cellulare utilizzando time-lapse imaging digitale. In alcuni casi, il software di imaging non era in grado di distinguere tra movimento casuale browniano di una cella contro una cella realtà migrazione solo una breve distanza. Ulteriori limitazioni erano evidenti in situazioni in cui il software di analisi non è stato in grado di distinguere la presenza di multipLe cellule in stretta vicinanza l'uno-all'altro. Per superare questa limitazione necessaria selezione manuale delle cellule durante l'analisi piuttosto che un'analisi completamente automatizzato. Densità di placcatura cellulare può anche provocare inclinazione dati di migrazione cellulare tra le popolazioni di cellule che mostrano una maggiore preferenza a crescere in ciuffi contro cellule che crescono in isolamento da ogni altro. Questi tipi di differenze sono in parte probabilmente un riflesso di cellula-substrato rispetto preferenze cellula-cellula.
L'utilizzo di un sistema HCS per acquisire immagini e di eseguire l'analisi dei dati fornisce un mezzo efficace e rapido per valutare parametri di cella multiple. Inoltre, i video digitali time-lapse per 30 diverse condizioni (6 substrati e 5 diversi sottotipi MSC) sono stati regolarmente acquisiti per periodi variabili da ore a giorni (48 ore) durante l'uso della camera ambientale. Questi dati sono stati poi utilizzati per calcolare e determinare differenze nei tassi di migrazione delle cellule attraverso varie linee cellulari su diversi ECMmolecole.
In questa relazione abbiamo evidenziato la realizzazione di un alto contenuto di piattaforma di screening per valutare la salute e la funzione delle cellule. Questo tipo di analisi è utile per sviluppare strategie razionali per la progettazione di tipi di cellule, così come substrati polimerici per facilitare la crescita cellulare e la rigenerazione neuronale diretto. Questo è un passo essenziale verso l'applicazione della fornitura a base di cellule staminali, di fattori terapeutici prima estesa in studi preclinici in vivo che utilizzano strategie di trapianto di cellule.
Disclosures
Spese di pubblicazione di questo articolo il video sono stati sostenuti da Molecular Devices, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1x) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
References
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
- Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
- Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
- Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
- Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
- Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
- Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
- Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
- Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
- Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
- Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
- Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
- Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
- Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
- Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
- Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
- Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).
