Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedret Redusert Representasjon Bisulfite Sekvense for Vurdering av DNA Metylering ved basepar Oppløsning

Published: February 24, 2015 doi: 10.3791/52246
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 1, 3, 4, 1
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 4Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Abstract

DNA metylering mønster kartleggingen er tungt studert i normale og syke vev. En rekke metoder er etablert for å avhøre de cytosin metylering mønstre i cellene. Redusert representasjon av hele genomet bisulfitt sekvensering ble utviklet for å detektere kvantitative basepar oppløsning cytosin metylering mønstre ved GC-rik genomiske loci. Dette oppnås ved å kombinere bruken av et restriksjonsenzym fulgt av bisulfitt-konvertering. Forbedret Redusert Representasjon Bisulfite Sekvense (ERRBS) øker biologisk relevant genomiske loci dekket og har vært brukt til å profilere cytosin metylering i DNA fra menneske, mus og andre organismer. ERRBS initierer med restriksjonsenzym-nedbrytning av DNA for å generere lavmolekylære fragmenter for bruk i fremstillingen av bibliotek. Disse fragmentene blir underkastet standard bibliotek konstruksjon for neste generasjon sekvensering. Bisulfite konvertering av unmethylated cytosines før den endelige amplificatipå trinnet kan for kvantitativ basen oppløsning av cytosin metylering nivåer i dekket genomisk loci. Protokollen kan være ferdig i løpet av fire dager. Til tross for lav kompleksitet i de tre første baser sekvensert, ERRBS bibliotekene gi høy kvalitet data når du bruker en utpekt sekvense kontroll kjørefelt. Kartlegging og bioinformatikk analyse utføres deretter og gir data som enkelt kan integreres med en rekke genom-wide plattformer. ERRBS kan utnytte små innspill materialmengder som gjør det mulig å behandle kliniske prøver og anvendbar i en rekke forskningssøknader. Videoen produsert demonstrerer kritiske trinn i ERRBS protokollen.

Introduction

DNA-metylering ved cytosin (5-metylcytosin) er et epigenetisk mark kritisk i pattedyrceller i en rekke biologiske prosesser, inkludert, men ikke begrenset til preging, X-kromosom inaktivering, utvikling og regulering av genekspresjon 1-8. Studiet av DNA metylering mønstre i maligne og andre lidelser har bestemt sykdoms bestemte mønstre og bidratt til forståelsen av sykdoms patogenesen og potensielle biomarkør funn 9-17. Det er mange protokoller som avhøre den epigenome for DNA metylering status. Disse kan deles inn i affinitets-baserte, restriksjonsenzymbasert, og bisulfitt-konverterings-baserte assays som anvender mikromatrise eller sekvenseringsplattformene nedstrøms. Videre er det noen protokoller som bro disse generelle kategorier, inkludert, men ikke begrenset til, Kombinert Bisulfite Restriction Analyse 18 og Redusert Representasjon Bisulfite Sekvensering (RRBS 19). RRBS ble opprinnelig beskrevet av Meissner et al., 19,20. Protokollen innføres et trinn for å berike GC-rik genomiske regioner fulgt av bisulfitt-sekvensering, noe som resulterte i kvantitativt basepar oppløsning data som er kostnadseffektivt 21,22. GC-rike regioner blir målrettet av MspI (C ^ CGG) restriksjonsenzym, og cytosin metylering løses ved omdannelse av bisulfitt cytosines (deaminering av umodifiserte cytosines til uracil), etterfulgt av polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon. RRBS dekket mesteparten av genet promotorer og CpG øyer i en brøkdel av sekvensering som er nødvendig for et helt genom; imidlertid RRBS hatt begrenset dekning av CpG bredder og andre intergeniske regioner av biologisk relevans. Flere grupper har publisert oppdatert RRBS protokoller siden den opprinnelige rapporten som forbedre metodikken og resulterende dekning av disse genomiske regioner 23-25. Forbedret Redusert Representasjon Bisulfite Sequtene (ERRBS) inkluderer bibliotek forberedelse modifikasjoner og en alternativ justering av data tilnærming 26 når sammenlignet med RRBS. ERRBS resulterte i et høyere antall CPGs representert i data generert og økt dekning av alle genomiske regioner avhørt 26. Denne metoden har vært brukt til å løse DNA metylering mønstre i menneskelig pasient og andre dyr eksemplarer 26-30.

Den ERRBS protokoll beskrevet tilbud informasjon om alle trinnene som trengs for ferdigstillelse og data ble generert ved hjelp av representative menneskelig DNA (prøver ble innhentet fra tidligere rapportert, avidentifiserte pasientprøver 31, og en CD34 + benmargsprøve fra en normal menneskelig donor). Protokollen omfatter en automatisert størrelse utvelgelsesprosess, noe som reduserer behandlingstiden per prøve og tillater for økt nøyaktighet i biblioteket størrelse valg. Protokollen kombinerer en rekke etablerte molekylærbiologiske teknikker. Med høy molekylvekt-DNA blir spaltet wed en metylering-insensitive begrensning enzym (MspI) etterfulgt av end-reparasjon, A-tailing, og ligering av denaturert adaptere. Størrelse valg av GC-rike-fragmenter blir fulgt av bisulfitt-konvertering og PCR-amplifikasjon før sekvensering. Bisulfite konvertering har vært tidligere beskrevet 32 og detaljert gjennomgang av dataanalyse og programmer er utenfor rammen av denne utredningen, men anbefalinger og referanser er inkludert om lesernes bruk. Protokollen kan utføres over fire dager og er mottagelig for liten inngang (50 ng eller mindre) vesentlige beløp. Den protokoll som er beskrevet gir data med høy dekning per CpG side tilstrekkelig ikke bare for differensial metylering stedet og region bestemmelser, men også for epigenetisk polymorfisme deteksjon som beskrevet av Landan, et al., 33.

Protocol

Alle prosedyrer som utføres er godkjent av Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité og følge National Institute of Health retningslinjer.

1. kirurgisk teknikk

  1. Opprettholde aseptisk teknikk under denne prosedyren ved hjelp av sterile hansker, instrumenter og en steril kirurgiske feltet ifølge NIH retningslinjer 25. Sterilisere verktøy før du starter kirurgi ved autoklave dem (se tabell over spesifikke reagenser / Utstyr for komplett liste). Bruk et glass perle sterilisator å sterilisere verktøy under operasjonen.

2. Anestesi og klargjøring

  1. Bedøve musen i en anestesi boks med en blanding av 0,9 l / min oksygen og 2,5% isofluran ved hjelp av en veterinær isofluran fordampersystemet. Sørg for at musen ikke reagerer på endringer i kroppsstilling før du tar det ut av esken.
  2. Påfør oftalmisk salve til mouSE øyne for å beskytte dem fra å tørke ut.
  3. Slå gasstrømmen fra boksen til nesepartiet. Plassere musen holdent på dens venstre side på en oppvarmet puten dekket med en kirurgisk puten og absorberende papir benk med sin nese og munn inne i konusen. Kontinuerlig overvåke musens puste rytme og hastighet og justere isofluran nivåer etter behov (mellom 2,5 til 3% isofluran) for å opprettholde et tilstrekkelig nivå av anestesi, og bruke tå klype refleks for å bekrefte total sedasjon.

3. Kirurgisk Approach

  1. Rett og fokusere stereoskop med den kirurgiske feltet. Juster nesen membran og tape det ned slik at det er plassert langs kanten av synsfeltet.
  2. Med musen liggende på venstre side, tape kanten av høyre øret til nesepartiet, utsette området bak øret der snittet vil bli gjort. Sørg for at den bakre aurikulær vene reiser horisontalt over øret. Vær oppmerksom på at riktig plassering av than dyr og taping av øret er avgjørende for å raskt finne ansikts nerve.
  3. Fukt pelsen på og bak øret med 70% etanol og barbere operasjonsstedet ved hjelp av et barberblad eller skalpell blad. Pre-fukte pelsen gjør barberingen enklere i denne anatomisk lokalisering.
  4. Rense huden med en jod-oppløsning, slik som Betadine kirurgisk kratt (7,5% povidon-jod), etterfulgt av 70% etanol. Gjenta denne renhold to ganger til grundig desinfisere området.
  5. Å bestemme hvor du skal gjøre snittet, spore posterior aurikulær blodåre fra øret caudally til området posterior til øret protuberance. Ved hjelp av våren saks, lage en 4 mm snitt 2 - 3 mm posteriort for protuberance.
  6. Dissekere gjennom underhudsfett og fascia hjelp stump disseksjon. Unngå direkte skjæring med saksen fordi blodkar eller muskelvev kan lett bli skadet.
  7. Hvis blødningen skjer, legg press på operasjonsstedet med en steril bomullspinnei minst 30 sek. Hvis betydelig tap fluid inntreffer, injisere mus intraperitonealt med opp til 0,5 ml steril 0,9% saltløsning ved hjelp av en 25 eller 27 G nål.
  8. Bruk flere viktige landemerker, rygg tilbehør nerve, øregangen, og fremre digastric- (beskrevet nedenfor), for å finne ansikts nerve. Dissekere rundt disse landemerkene til grenene av ansikts nerve er visualisert. Nerve vil fremstå som en betydelig solid hvit struktur når det blir avslørt og et lag av fascia fester det til de underliggende strukturer.
    1. Finn rygg tilbehøret nerve, som reiser fra hale del av hodeskallen til innerverer trapezius muskel, når underhudsfett og konseptet har blitt dissekert. Ansikts nerve er dypt til rygg tilbehør nerve.
    2. Finn den brusk øregangen som ser perlehvite og kan sees rostralt til ansikts nerve.
    3. Finn muskelbuken av fremre digastric- som ligger oppå og caudal til ansikts nerve.
  9. Når de viktigste grenene av ansikts nerve er visualisert, spore dem dorsally å finne sin opprinnelse fra de stylomastoid foramen. Med fint tippet Dumont tang # 5/45 å holde operasjonsstedet åpen, fremme våren sakse tips følgende nerve bane, og deretter flytte pinsett dorsally å holde den nylig avansert området åpent.
  10. Visualisere stammen av ansikts nerve med zygomatic, kinn, og marginale underkjevens grener på dette punktet.
    MERK: Den midlertidige gren vil bli funnet nærmere foramen. De marginale underkjevens nerve grener i øvre og nedre deler nærmere kjeven, og dermed disse nerve grenene vil ikke være synlig på dette nivået.
    1. Hvis du utfører en nerve tran, stabilisere nerve forsiktig med fin spiss tang og klippe nerven med våren saks. Unngå å bruke for mye trekkraft til nerve med pinsett for å hindre avulsing nerve fra hjernestammen. Skyvstubber fra hverandre, eller klippe og fjerne en del av den distale nerve å sikre at ingen omkobling kan forekomme.
    2. Hvis du utfører en knusningsskade, bruker Dumont # 5/45 pinsett til å komprimere nerve i 30 sekunder ved hjelp av konstant press for å kutte alle axoner, deretter gjenta dette crush på en annen vinkel vinkelrett på den første forelskelsen nettstedet. Unngå å bruke variable mengder press i løpet av 30 sek knuse, ellers skaden vil være inkonsekvent mellom dyr.

4. Åpning og gjenoppretting

  1. Reposisjonere fett og muskler i løpet av de underliggende strukturer.
  2. Tilnærmet kantene av snittet og lukke såret ved hjelp av en 7,5 mm såret klippet. Sting eller lim er også akseptabelt for sårheling. Postsurgical analgetika kan gis på dette tidspunktet.
  3. Fjern tapen fra musens øre. Slå av isofluran strømning og tillate at musen til å puste rent oksygen i 30 sekunder til 1 minutt. Pless musen i et tomt bur uten sengetøy for å gjenopprette fra anestesi.
  4. Når musen er gjenopprettet, undersøke sin oppførsel for bekreftende tegn på ansikts lammelse. Linjene blir paralysert og vinklet bakover mot kinnet, vil nesen fravikes, og øyet ikke vil blinke i respons til et drag av luft.
  5. Huset dyrene i fellesskap etter operasjonen hvis de er kvinner. Unngå bolig hannmus i fellesskap fordi de er mer aggressive og har en tendens til å tvangsflytte sin cagemate såret klipp, noe som fører til infeksjon. Gi postsurgical analgetika på denne tiden, hvis det er nødvendig.
  6. Overvåke mus en gang om dagen i flere dager etter operasjonen for å sikre at ingen infeksjon eller annen komplikasjon oppstår postoperativt. Fjern sår klipp 7-10 dager etter operasjonen hvis de ikke har falt ut på egenhånd.
  7. Påfør smørende øyesalve til de berørte øyet daglig for å hindre hornhinnen komplikasjoner, enten inntil øyet blunkerefleksen er redekket eller til aktiv dødshjelp.

Representative Results

Figur 1 gir en oversikt over ERRBS, fremhever viktige skritt, som er forklart i hele protokollen beskrevet. ERRBS biblioteker ble fremstilt ved anvendelse av 50 ng DNA-inngang.

Vurdere kvaliteten av bibliotekene forberedt. Bibliotek produksjon gir rutinemessig fraksjonsstørrelser på 150-250 bp og 250-400 bp (figur 3A-C). Det forventes små forskjeller i bibliotekstørrelsesfordeling mellom prøver. Merk at i både lavere og høyere bibliotek fraksjoner er det meget intense DNA-størrelser, som tyder på anrikning av en bestemt sekvens. MspI fordøyelsen resultater i anriking av en familie av repeterende DNA-sekvenser til stede i det menneskelige genom på 190 bp, 250 bp og 310 bp i ERRBS bibliotekene. Disse tre repetisjoner representerer en karakteristisk signatur av en ERRBS bibliotek 20 (se figur 3A-C og 3G). Representative bibliotekene ble sekvensert på en neste-generasjons sekvensr ved hjelp av enkelt-end leser. Når du legger ved anbefalt bibliotek konsentrasjon på en Illumina HiSeq 2500 sequencer, er klase tettheter av 500,000-700,000 per mm 2 forventet. Ved denne gruppering densitet, 81,6% ± 3,14% (n = 81) av klyngene pass filter (figur 4A). På grunn av lav kompleksitet slutten av bibliotek inserts (MspI anerkjennelse site: C ^ CGG), intensitetsverdier og kvalitetspoeng registrert under sekvensering er svært variabel i de tre første baser (Figur 4B-C), men hvis en uavhengig kontroll kjørefelt er inkludert (se diskusjon), vil 85% av baser har kvalitet score på 30 eller høyere (Q30-verdier; Figur 4D).

Justering av data og cytosin metylering besluttsomhet som beskrevet i protokollen gir basepar oppløsning data (Tabell 7). For det menneskelige genom, en 51-syklus enkelt lese sekvense kjøring av en ERRBS bibliotek i ett kjørefelt av en HiSeq 2500 i høy utgangsmodus vanligly genererer 153194882 ± 12918302 total leser at etter kvalitet filtrering og adapter trimming gir 152231183 ± 13189678 leser for innspill til analyse rørledning. Gjennomsnittlig kartlegging effektivitet for en ERRBS biblioteket er vanligvis 62.95% ± 5.92% med representasjon av 3.183.594 ± 713 547 CPGs med en minimumsdekning per CpG av 10x og en gjennomsnittlig dekning per CpG av 84,94 ± 16,29 (n = 100).

Den ERRBS protokollen er mottagelig for multipleksing (se Supplemental fil 1: Protokoll tilpasning for multiplexed sekvensering). Data fra representative sekvense kjører er oppsummert i figur 5 data fra multiplekserte sekvense runs (51-syklus enkelt lese sekvense run;. N = 128 for to bibliotekene per kjørefelt, n = 11 for tre bibliotekene per kjørefelt, n = 11 for fire biblioteker per felt) ble sammenlignet med en full lane-sekvensering av en ERRBS biblioteket (51-syklus enkelt-les sekvense kjøringer; n = 100), så vel som nedsampling ett kjørefelt i simulerie 50%, 33% og 25% av lyder per kjørefelt (2, 3, og 4-prøven multipleksing per bane henholdsvis n = 3). Ettersom antallet leser per prøve avtar med multipleksing faktor, antall CPGs dekket på et minimum dekning av 10x og dekningen per CpG reduseres også (figur 5 og tabell 8). Mener omregningskursene for ikke-CpG nettsider som forventes er 99,85% ± 0,04% (n = 400). Konverteringsfrekvenser lavere enn 99% kan tyde på mindre enn optimal bisulfite konvertering som kan resultere i høy forekomst av falske metylering nivåer.

Data fra en ERRBS bibliotek forberedt fra en representant humant genomisk DNA ble analysert i R 2.15.2 45 bruker methylKit pakke 26 (se Supplemental kodefil en for kommando detaljer). Dataene kan visualiseres i vanlig brukte genomlesere (figur 6a). Den cytosin metylering data blir like avledet fra begge tråder (figur 6B), og strekker seg i helespekter av potensielle cytosin metylering nivåer (Figur 6C). Analyse av tekniske replikater fra en representant menneskelige DNA prøve gir høy samstemmighet mellom data resultater (Figur 6D) og dekker CPGs i et bredt spekter av genomisk loci (Figur 6E og F og som tidligere beskrevet 26). Mens teknisk kopier vil gi høy R 2 verdier (større enn 97%), vil det biologiske kopier gi R 2-verdier i området 0,92 til 0,96 26 og sammenligner forskjellige humane celletyper vil gi R-2-verdier lavere enn 0,86 (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1: Flytskjema av ERRBS protokolltrinn. Diagrammet representerer trinn, som kan gjennomføres i en tradisjonell arbeidsdag. * Indikerer en potensiell pause punkt (umiddelbart følge ing ligering rydde opp og før valg av størrelse, protokoll trinn 5) ved hvilke prøvene kan fryses ved -20 ° C før man går videre med varigheten av protokollen.

Figur 2
Figur 2: Størrelse utvalg protokollen. (A) Skjermbilde av innstillingene som brukes i ERRBS Pippin Prep-protokollen (se protokoll avsnitt 5.1.2 - 5.1.6): (1) Velg Kassett type. (2) Velg standard som skal brukes. (3) Velg samling modus for hvert kjørefelt. (4) Angi samling bp klasser. (5) Lagre protokollen (B) stadier av den manuelle gel utvinning brukes i protokollen punkt 5.2:. (1) visualisert gel stiger. (2) Merket Størrelser for størrelse valg med et barberblad. (3) Bilde av skåret prøver (lavere brøkdel: 150-250 bp og høyere andel: 250-400 bp)."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Kvalitetskontroll resultater for representative ERRBS biblioteker forberedt fra menneskelige DNA-prøver ved hjelp av en Bioanalyzer maskin. (A) Gel-lignende bilde som viser en vanlig stige (1), nedre bibliotek fraksjon (135-240 bp fraksjon fra Pippin Prep); 2) og høyere bibliotek fraksjon (240-410 bp fraksjon fra Pippin Prep); . 3) (B) Bioanalyzer elektroferogrammet av forventet lavere bibliotek fraksjon (C) Bioanalyzer elektroferogrammet av den forventede høyere bibliotek fraksjon D -.. F) Representative data fra en dårlig kvalitet bibliotek prep. Gel-lignende bilde (D) av standard stige (1), nedre bibliotek fraksjon (2) og den høyere bibliotek fraksjon (3). Bandet på 150 bp merket med en arrow indikerer store mengder adapter. Elektroferogrammet av den nedre (E) og høyere bibliotek fraksjoner (F) med de overskytende adapter topper ved 150 bp (merket med piler). (G) Bioanalyzer elektroferogrammet av en samlet ERRBS bibliotek for sekvensering. Rød kurve representerer en høy kvalitet sammenslått bibliotek med lik representasjon av høyere og lavere fraksjoner. Blå strek representerer en samlet bibliotek ikke tilstrekkelig for sekvensering på grunn av mangel på lik representasjon av de høyere og lavere fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Sekvensering diagrammer for en representant ERRBS 51-syklus enkelt lese sekvense kjøre på en HiSeq 2500 sequencer i høy produksjonmodus. (A) Cluster tettheter (K / mm 2 = 1000 klynger per millimeter squared, blå). Og klase tettheter passerer filter (grønn) i to baner med ERRBS biblioteker (B) Typiske intensiteter sett i de første 30 sykluser i et kjørefelt med en ERRBS bibliotek. Legg merke til CGG signatur fra MspI fordøyelsen i intensiteter av de tre første syklusene. (C) Prosent av baser med en kvalitet score på 30 eller høyere (%> Q30) for hver syklus i ett ERRBS kjørefelt. (D) Kvalitet poengsum fordeling for alle sykluser i ett ERRBS kjørefelt. Blå = mindre enn Q30, Grønn = større enn eller lik Q30. I denne kjørefelt, 84,7% av baser hadde kvalitet score på 30 eller høyere.

Figur 5
Figur 5: Sekvensering utgangs resultater. Boksplott av eksperimentelle data fra multiplex og enkelt prøve per kjørefelt sekvense ru ns (vises som grønne bokser) og data avledet av simulert downsampling fra sekvense kjøringer av tre ERRBS bibliotekene (vises som blå bokser; samplet fem ganger for hver sekvense løp) fra 51-syklus enkelt lese sekvense kjører The multipleksing faktor tilsvarer. antall ERRBS biblioteker sekvensert per kjørefelt. 1 = hel kjørefelt eller 100% av leser og representerer data fra en enkelt ERRBS bibliotek per kjørefelt; 2 = 50% av kjørefelt og representerer data fra to ERRBS bibliotekene per kjørefelt; 3 = 33% av et kjørefelt, og representerer data fra tre ERRBS bibliotekene per kjørefelt; og, 4 = 25% av et kjørefelt, og representerer data fra fire ERRBS bibliotekene per kjørefelt. (A) De leste teller, eller antall sekvenser analysert, per multipleksing faktor. (B) Antallet CpG er omfattet av sekvense data per multipleksing faktor. (C) Gjennomsnittlig dekning per CpG per multiplexing faktor._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Representative data fra en ERRBS bibliotek fremstilt fra humant genomisk DNA (A) University of California, Santa Cruz (UCSC) genom leseren 43 bilde av representative data fra en ERRBS sekvense kjørefelt.. Y-aksen representerer målestokk 0-100% metylering ved hver cytosin dekket med et minimum av 10 ganger. Toppen tilpassede spor representerer fremover strand og lavere egendefinerte spor representerer det motsatte strand. Vist er chr12:.. 6,489,523-6,802,422 (hg19) inklusive refseq gener og CpG øyer i denne genomisk region (B) Distribusjons histogrammer av CpG dekning langs forover og bakover tråder i et representativt menneskelig CD34 + benmargsprøve (C) Distribution histogramav CpG metylering nivåer langs begge trådene i et representativt menneskelig CD34 + benmargsprøve. (D) Korrelasjon tomt på CpG metylering nivåer fra en representant teknisk replika av en menneskelig DNA-prøve. (E) Pie skjema som illustrerer proporsjonene CPGs dekket i ERRBS som kommenterte til CpG øyer (lys grønn), CpG bredden (grå) og andre regioner (hvite) i et representativt utvalg forberedt fra humant genomisk DNA. (F) Pie skjema som illustrerer proporsjonene CPGs dekket i ERRBS som kommenterte til genet arrangører (rød ), eksoner (grønn), introner (blå) og intergeniske regioner (lilla). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> 10 x T4 DNA-ligase reaksjonsbuffer
Reagens Volum Kommentar
10 pl
Deoksynukleotidtrifosfat (dNTP) Løsning Mix 4 pl blanding av 10 mM av hvert nukleotid
T4 DNA-polymerase 5 mL 3000 enheter / ml
DNA Polymerase jeg Large (Klenow) Fragment 1 mL 5000 enheter / ml
T4-polynukleotidkinase 5 mL 10 000 enheter / ml
DNase-fritt vann 45 mL

Tabell 1:. Ende reparasjon reaksjonsreagenser reagensnavn og mengder anvendt i endereparasjonsreaksjon (protokoll trinn 2.1).

Reagens Volum Kommentar
10x reaksjonsbuffer 5 mL for eksempel NEBuffer 2
1 mM 2'-deoksyadenosin-5'-trifosfat (dATP) 10 pl
Klenow-fragmentet (3 '→ 5' ekso-) 3 pl 5000 enheter / ml

Tabell 2:. A-tailing reaksjonsreagenser reagensnavn og mengder anvendt i A-tailing reaksjon (protokoll trinn 3.1).

Reagens Volum Kommentar
15 mikrometer glødet adaptere i DNase-fritt vann 3 pl PE adapter 1,0 og PE adapter 2.0; se tabell 4 for sekvenser og referanse
10 x T4 DNA-ligase reaksjonsbuffer 581; l
T4 DNA-ligase 1 mL 2.000.000 enheter / ml
DNase-fritt vann 31 mL

Tabell 3: Adapter ligation reaksjonsreagenser reagensnavn og mengdene som brukes i adapteren ringsreaksjonen (protokoll trinn 4.2)..

Tabell 4
Tabell 4:. Oligoer som brukes i ERRBS protokoll Liste over oligoer som brukes i hele ERRBS protokollen i ligeringsreaksjonen (protokoll trinn 4), og PCR-amplifikasjon trinn (protokoll trinn 7).

Reagens Volum Kommentar
10x Faststart High Fidelity Reaction Buffer with 18 mM magnesiumklorid 20 mL
10 mM dNTP Solution Mix 5 mL
25 mikrometer PCR PE primer 1.0 4 pl Se Tabell 4
25 mikrometer PCR PE primer 2.0 4 pl Se Tabell 4
Faststart High Fidelity Enzyme 2 pl 5 enheter / ul Faststart Taq DNA Polymerase
DNase-fritt vann 125 mikroliter

Tabell 5: PCR-reaksjon reagenser reagensnavn og mengder anvendt i PCR amplifikasjonsreaksjonen (protokoll trinn 7.1)..

Protokoll trinn Reagens / protokoll detalj Input DNA mengde
5-10 ng 25 ng 50 ng
1 MspI enzym 1 mL 2 pl 2 pl
MspI digest reaksjon volum 50 100 100
4 Adaptere i Ringsreaksjonen 1 mL 2 pl 3 pl
Ringsreaksjonsvolum 20 mL 25 pl 50 pl
5 Størrelse valg protokollen Manuell gel bare Pippin Prep eller manuell gel Pippin Prep eller manuell gel
7 PCR-primer konsentrasjon 25 mikrometer 25 mikrometer 10 mm for 14 sykluser; 25 mikrometer for 18 sykluser Antall PCR-sykluser 18 18 14-18

Tabell 6:. Protocol trinn modifikasjoner på innsatsmaterialmengdene som spenner 5-50 ng Flere trinn i hele protokollen krever modifikasjon av reagensstasjoner mengder som brukes til å generere høy kvalitet biblioteker fra ulike mengder av startmaterialer. Endringer i nøkkel reagenvolumer mengder er inkludert her. Juster buffer og vannmengder i reaksjoner deretter.

Chr Base Strand Dekning freqC freqT
chr1 10564 R 366 85.52 14.48
chr1 10571 F 423 91.25 8.75
chr1 10542 F 432 91.2 8.8
chr1 10563 F 429 94,64 5,36
chr1 10572 R 366 96.99 3.01
chr1 10590 R 370 88.11 11.89
chr1 10526 R 350 92 8
chr1 10543 R 368 92,93 7.07
chr1 10525 F 433 91,92 8.08
chr1 10497 F 435 88,74 11.26
<p class = "jove_content"> Tabell 7: Representative ERRBS data. Etter justering av data og cytosin metylering besluttsomhet, basepar data er innhentet For hver CpG dekket, vil justeringen protokoll som beskrevet bestemme genomisk koordinere (kolonner: chr = kromosom, Base og Strand)., Den dekningsgrad på den spesifikke locus (Dekning ), og frekvensen av gjenkjenning cytosin versus tymidin som prosent (freqC og freqT henholdsvis).

Antall ERRBS bibliotekene per kjørefelt Gjennomsnittlig antall unikt justert leser Gjennomsnittlig antall CPGs dekket Bety dekning per CpG
1 152231184 ± 13189678 3183594 ± 713 547 85 ± 16
2 77680837 ± 7657058 2674823± 153 494 49 ± 9
3 49938156 ± 2436865 2552186 ± - 76624 39 ± 2
4 34457208 ± 4441686 1814461 ± 144 339 28 ± 4

Tabell 8:. Representative parametere fra sekvense enkle og multiplekserte ERRBS biblioteker Vist er data per kjørefelt fra 51-syklus enkelt lese sekvense løyper: gjennomsnitt og standardavvik unikt justert leser, antall CPGs dekket og dekning per CpG nettstedet hentet fra sekvense enkelt ERRBS bibliotekene per kjørefelt (n = 100), to ERRBS biblioteker per kjørefelt (n = 128), tre ERRBS biblioteker per kjørefelt (n = 11), og fire ERRBS biblioteker per kjørefelt (n = 11).

Discussion

Protokollen present gir basepar oppløsning data av cytosin metylering på biologisk relevante genomiske regioner. Den protokoll som er skrevet er optimalisert for 50 ng av utgangsmateriale, men den kan tilpasses til å håndtere en rekke inngangsmaterialet (5 ng eller flere) 26. Dette vil kreve justering av noen av protokollen trinn som vist i tabell 6. De ERRBS biblioteker er mottagelig for parede endesekvensering og ytterligere genomisk dekning kan også bli oppnådd ved sekvensering leser mer enn 51 sykluser. Multiplekset sekvensering vil tilby en lavere kostnad protokoll per prøve, men dette vil resultere i redusert dekning per CpG nettstedet representert i dataene (figur 5 og tabell 8), og vil ikke gi tilstrekkelig dybde på dekning for å gjennomføre analyser som krever høy dekning per CpG området (for eksempel som beskrevet av Landan et al. 33). Til slutt, denne protokollen (eller sulfitt-baserte protokollen,l) kan ikke skille mellom metyl-cytosin og hydroksymetyl-cytosin 46,47. Men data generert kan integreres med andre protokollen resulterer 48,49 å avgrense de forskjellige modifikasjoner, og andre cytosin modifikasjoner nylig rapportert 50, bør de være av interesse.

Høy kvalitet-biblioteker vil fremstå som vist i figur 3A-C, og en gang ble samlet for sekvensering gir en kurve som vist på figur 3G (rød kurve) som representerer like molare bidrag fra begge bibliotek fraksjoner. Bibliotek preparat svikt kan resultere fra hvilket som helst trinn under prosedyren. Hvis nedbrutt DNA behandles det vil resultere i biblioteker som ikke er anriket på MspI fragmenter og dermed lav CpG dekning ved hjelp av sekvenseringsparametere er beskrevet i denne protokoll. Hvis et enzym er ikke-funksjonell eller utilsiktet ekskludert fra en av reaksjonene, vil protokollen ikke gi det forventede biblioteket. Hvis ligation reaDette skjer er ineffektivt, adaptere er ved en høyere konsentrasjon enn forventet, og / eller primere konsentrasjonen som brukes er en begrensende reagens for sluttforsterkertrinn, kan biblioteket svikt oppstår. Overflødige adaptere (sett på som en topper på ~ 150 bp i Bioanalyzer resultater, Figur 3D-F) i biblioteket vil også forstyrre sekvensering på grunn av kritikkløs clustering av både biblioteket og overskytende adaptere. Mens et slikt bibliotek kan sekvensere tilsynelatende normalt en vesentlig del av den leser vil være bare adaptersekvenser. Hvis skytende adaptere er observert i et bibliotek, er det best å gjenta biblioteket forberedelse hvis materialet er tilgjengelig ved hjelp av optimal innsatsmateriale på adapteren kvantums forholdstall. Til slutt, for å sikre effektiv PCR forsterkning av bibliotekene, blir de lavere og høyere bibliotek fraksjoner opprettholdes som separate prøver hele bisulfite konvertering og PCR berikelse trinn. Unnlatelse av å gjøre dette gir differensial effektiviteten av utvidelsen under PCR omsetning av høyere og lavere fraksjoner (som sett i figur 3G blå strek) og potensialet for ulik representasjon av den respektive genomiske loci dekket i hvert bibliotek fraksjon under sekvensering. Brukeren kan velge å inkludere en kvantitativ PCR steg umiddelbart etter bisulfit konvertering for videre titrering av optimale PCR-sykluser for å forsterke bibliotekene blir generert.

ERRBS bibliotek forberedelse protokollen har flere viktige skritt i som er anbefalt spesifikke reagenser. Ved slutten reparasjonstrinn, tillater bruk av en fire-nukleotid dNTP blanding for ende-reparasjon av produkter som ikke inneholder CG overheng, slik som de som resulterer fra MspI enzymatisk stjerne aktivitet og skåret DNA-fragmenter som er tilstede i den opprinnelige DNA-prøve. Dette resulterer i forbedret CpG representasjon i resultatene. Ved ligeringstrinnet er det viktig å bruke en høy konsentrasjon ligase (2000000 enheter / ml) og denaturert adaptere for å sikre at ligeringsreaksjonpå er effektiv og at bisulfit konverteringen ikke påvirke adapter sekvenser essensielle for nøyaktig justering av data. Ved PCR-trinnet, ved anvendelse av en polymerase er i stand til å forsterke bisulfitt-behandlede GC-rikt DNA-fragmenter som er nødvendig for høy spesifisitet. Til slutt, for å sikre eliminering av overskytende adaptere og primere, SPRI perle rensing (for eksempel: Agencourt AMPure XP) anbefales i stedet for kolonnebaserte analyser for ligering og PCR produkt isoleringer.

For å generere data av høy kvalitet, er det viktig å sikre effektiv bisulfitt konvertering. Kontrollen presenteres gir brukeren muligheten til å bestemme konvertering effektivitet før sekvensering. Som et alternativ, kan en ikke-human DNA som lambda-DNA brukes som en intern kontroll (spike-in). På grunn av forskjellene i arten, kan denne type av en kontroll være direkte inkludert i nedstrøms-sekvensering (for eksempel som anvendt ved Yu, et al. 34). Imidlertid, dersom piggen-i is utnyttet, kan det ikke brukes til å bestemme konvertering effektivitet før bibliotek sekvensering med mindre entydig forsterket og uavhengig sekvensert før bibliotek sekvensering. Omregningskursene bestemmes er basert på metylering status på ikke-CpG nettsteder. Dette kan ikke være egnet for bruk i sammenheng med høy cytosin metylering i ikke-CpG kontekst (f.eks embryonale stamceller) og parallelle prøver eller andre midler for å vurdere for konvertering effektivitet kan benyttes for dette formål.

Det er et par ting til adressen som er unike for sekvensering av ERRBS biblioteker. De første tre baser av bibliotek fraksjoner sekvensert er nesten jevnt ikke-tilfeldig på grunn av MspI gjenkjennings kuttet område (C ^ CGG; se figur 4B, C). Dette resulterer i at potensialet for betydelige tap av data på grunn av lav kvalitet leser som følge av dårlig klynge lokalisering på tross av tilsynelatende høy klynge tetthet under sekvensering. For å overvinne denne barriere,inkluderer en høy kompleksitet bibliotek i en uavhengig kjørefelt (phix kontroll eller andre bibliotek type) som en dedikert kontroll kjørefelt. Høy kompleksitet biblioteker har ender som inneholder en balansert representasjon av A, C, T og G i de første fire baser sekvensert. Egnede kontrollfelt omfatter bibliotekene som RNA-seq, ChIP-seq, hele genomsekvensering, eller en kontroll som tilbys av sekvensemaskinprodusenten (f.eks phix Kontroll v3). Når betegnet som en kontrollsone for den respektive sekvense løp, kan det tjene som grunnlag for generering matrise som anvendes i løpet av de første fire baser av sekvens, for å detektere klase stillinger. Jo høyere kvalitet leser fanget vil heve den gjennomsnittlige dekning per CpG nettstedet ved 5,2 (n = 4). Alternativt kan dette tekniske problemer også bli overvunnet ved hjelp av en mørk sekvense tilnærming som tidligere beskrevet 23. Andre sekvense kriteriene følger standard prosedyrer per produsentens protokoller. Endelig dekning per CpG chosen for dataanalyse vil bli veiledet av brukeren, og delvis av de biologiske spørsmål av interesse. 10x dekning terskel gir en høy dekning analyse tilnærming, men denne terskelen kan senkes bør det være av interesse.

En full diskusjon av ERRBS dataanalyse er utenfor omfanget av denne artikkelen, men ulikt denaturert cytosines og regioner kan bestemmes ved hjelp av open source verktøy 31,51-53. Flere analyse hensyn og tilnærminger har blitt godt beskrevet 54,55, og leserne oppfordres til å søke i litteraturen for verktøy mest aktuelle for analysen planlagt.

Sammenlignet med andre publiserte metoder, ERRBS tilbyr en fire-dagers-protokollen som når utført som beskrevet Rentene høy forekomst av reproduserbarhet. Det har blitt validert i forhold til gullstandarden MassARRAY EpiTYPER 26, er kostnadseffektivt for høye dekningsdata, og kan tilpasses for forskjellige inngangsmaterialetmengder (gunstige for klinisk utvalgets behandling og andre celletyper med lav frekvens) og sekvense tilnærminger. Det tilbyr basepar oppløsning på biologisk relevant loci og kan brukes i integrerende analyser med andre teknikker profilering genom-wide transkripsjon faktor bindende, kromatin remodellering, epigenetiske merker og andre cytosin modifikasjoner av interesse. ERRBS data anvendelse i slike studier kan bidra til en omfattende molekyl tilnærming og tillate høy dimensjons analyser i studiet av biologiske modeller og human sykdom.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MspI New England Biolabs R0106M 100,000 units/ml
NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2
Phenol solution Sigma-Aldrich P4557 Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432
Glycogen Sigma-Aldrich G1767 19-22 mg/ml
NaOAc Sigma-Aldrich S7899 3 M, pH 5.2
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503 prepare a 1 M, pH 8.5 solution
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) Sigma-Aldrich T9285 Dilute to 1x buffer solution per manufacturer's recommendations
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202S 10x concentration
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L 10 mM each nucleotide
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L 3,000 units/ml
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210L 5,000 units/ml
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L 10,000 units/ml
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Used for DNA product purification in protocol step 2.3
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) Promega U1201 100 mM
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs M0212L 5,000 units/ml
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Used for DNA product purification in protocol step 3.3
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202M 2,000,000 units/ml
Methylation Adapter Oligo Kit Illumina ME-100-0010
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use.
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free Sage Science CDF2010 with internal standards
Certified Low Range Ultra Agarose Bio-Rad 161-3106
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
50 bp DNA Ladder NEB N3236S
100 bp DNA Ladder NEB N3231S
Gel Loading Dye, Orange (6x) NEB B7022S
Scalpel Blade No. 11 Fisher Scientific 3120030
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001 Used in protocol step 6.2
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo Research D5030 Alternative for step 6.2
Universal Methylated Human DNA Standard Zymo Research D5011 Used as bisulfite conversion control
FastStart High Fidelity PCR System Roche 03553426001
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854 A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
HiSeq 2500 Illumina
Pippin Prep Sage Science
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS Illumina GD-401-3001
TruSeq SBS Kit v3-HS Illumina FC-401-3002
TruSeq RNA Sample prep Illumina RS-122-2001 Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol.
Microcentrifuge
Vortex Mixer
Dry Block Heater
Thermal Cycler
Water Bath
Gel electrophoresis system
Electrophoresis power supply
Gel doc
UV or blue light transilluminator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, P. A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat Rev Genet. 13 (7), 484-492 (2012).
  2. Barlow, D. P. Genomic imprinting: a mammalian epigenetic discovery model. Annual Review Of Genetics. 45, 379-403 (2011).
  3. Thiagarajan, R. D., Morey, R., Laurent, L. C. The epigenome in pluripotency and differentiation. Epigenomics. 6 (1), 121-137 (2014).
  4. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447 (7143), 425-432 (2007).
  5. Hartnett, L., Egan, L. J. Inflammation, DNA methylation and colitis-associated cancer. Carcinogenesis. 33 (4), 723-731 (2012).
  6. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet. 14 (3), 204-220 (2013).
  7. Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  9. Feinberg, A. P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature. 447 (7143), 433-440 (2007).
  10. Bock, C. Epigenetic biomarker development. Epigenomics. 1 (1), 99-110 (2009).
  11. Laird, P. W. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer. 3 (4), 253-266 (2003).
  12. How Kit, A., Nielsen, H. M., Tost, J. DNA methylation based biomarkers: practical considerations and applications. Biochimie. 94 (11), 2314-2337 (2012).
  13. Mikeska, T., Bock, C., Do, H., Dobrovic, A. DNA methylation biomarkers in cancer: progress towards clinical implementation. Expert Review Of Molecular Diagnostics. 12 (5), 473-487 (2012).
  14. Gyparaki, M. T., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. Journal of Molecular Medicine. 91 (11), 1249-1256 (2013).
  15. Figueroa, M. E., et al. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 17 (1), 13-27 (2010).
  16. Heyn, H., Mendez-Gonzalez, J., Esteller, M. Epigenetic profiling joins personalized cancer medicine. Expert review of Molecular Diagnostics. 13 (5), 473-479 (2013).
  17. Kulis, M., Esteller, M. DNA methylation and cancer. Advances in Genetics. 70, 27-56 (2010).
  18. Xiong, Z., Laird, P. W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25 (12), 2532-2534 (1997).
  19. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  20. Gu, H., et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling. Nat Protoc. 6 (4), 468-481 (2011).
  21. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nat Biotechnol. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  22. Harris, R. A., et al. Comparison of sequencing-based methods to profile DNA methylation and identification of monoallelic epigenetic modifications. Nat Biotechnol. 28 (10), 1097-1105 (2010).
  23. Boyle, P., et al. Gel-free multiplexed reduced representation bisulfite sequencing for large-scale DNA methylation profiling. Genome Biol. 13 (10), R92 (2012).
  24. Chatterjee, A., Rodger, E. J., Stockwell, P. A., Weeks, R. J., Morison, I. M. Technical considerations for reduced representation bisulfite sequencing with multiplexed libraries. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 741542 (2012).
  25. Lee, Y. K., et al. Improved reduced representation bisulfite sequencing for epigenomic profiling of clinical samples. Biological Procedures Online. 16 (1), 1 (2014).
  26. Akalin, A., et al. Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia. PLoS Genet. 8 (6), e1002781 (2012).
  27. Hatzi, K., et al. A Hybrid Mechanism of Action for BCL6 in B Cells Defined by Formation of Functionally Distinct Complexes at Enhancers and Promoters. Cell Reports. 4 (3), 578-588 (2013).
  28. Will, B., et al. Satb1 regulates the self-renewal of hematopoietic stem cells by promoting quiescence and repressing differentiation commitment. Nature Immunology. 14 (5), 437-445 (2013).
  29. Lu, C., et al. Induction of sarcomas by mutant IDH2. Genes Dev. 27 (18), 1986-1998 (2013).
  30. Kumar, R., et al. AID stabilizes stem-cell phenotype by removing epigenetic memory of pluripotency genes. Nature. 500 (7460), 89-92 (2013).
  31. Li, S., et al. An optimized algorithm for detecting and annotating regional differential methylation. BMC Bioinformatics. 14, Suppl 5. S10 (2013).
  32. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Journal of Visualized Experiments. (56), 3170 (2011).
  33. Landan, G., et al. Epigenetic polymorphism and the stochastic formation of differentially methylated regions in normal and cancerous tissues. Nat Genet. 44 (11), 1207-1214 (2012).
  34. Yu, M., et al. Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (12), 2159-2170 (2012).
  35. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  36. Dorff, K. C., et al. GobyWeb: simplified management and analysis of gene expression and DNA methylation sequencing data. PLoS One. 8 (7), e69666 (2013).
  37. Roehr, J. T., Dodt, M., Ahmed, R., Dieterich, C. Flexbar − flexible barcode and adapter processing for next-generation sequencing platforms. MDPI Biology. 1 (3), 895-905 (2012).
  38. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, North America. 17 (1), 10-12 (2011).
  39. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  40. Needleman, S. B., Wunsch, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48 (3), 443-453 (1970).
  41. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  42. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  44. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  45. Team, R. C. R. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, http://www.R-project.org (2012).
  46. Nestor, C., Ruzov, A., Meehan, R., Dunican, D. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. BioTechniques. 48 (4), 317-319 (2010).
  47. Huang, Y., et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5 (1), e8888 (2010).
  48. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  49. Song, C. X., et al. Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell. 153 (3), 678-691 (2013).
  50. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  51. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biol. 13 (10), R87-1186 (2012).
  52. Stockwell, P. A., Chatterjee, A., Rodger, E. J., Morison, I. M. DMAP: Differential Methylation Analysis Package for RRBS and WGBS data. Bioinformatics. 30 (13), 1814-1822 (2014).
  53. Sun, D., et al. MOABS: model based analysis of bisulfite sequencing data. Genome Biol. 15 (2), R38 (2014).
  54. Bock, C. Analysing and interpreting DNA methylation data. Nat Rev Genet. 13 (10), 705-719 (2012).
  55. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).

Tags

Genetikk epigenetikk bisulfite sekvense DNA metylering genomisk DNA 5-metylcytosin høy gjennomstrømming
Forbedret Redusert Representasjon Bisulfite Sekvense for Vurdering av DNA Metylering ved basepar Oppløsning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan,… More

Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan, C. K., Kacmarczyk, T. J., Ishii, J., Betel, D., Alonso, A., Mason, C. E., Figueroa, M. E., Melnick, A. M. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution. J. Vis. Exp. (96), e52246, doi:10.3791/52246 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter