Medicine

视网膜下进行注射的鼠害提供视网膜色素上皮细胞悬浮

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

光转换成电脉冲发生在外层视网膜和在很大程度上是由杆和视锥感光细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）细胞中来实现的。 RPE提供感光细胞和死亡或视网膜色素上皮细胞的功能障碍是年龄相关性黄斑变性（AMD），永久性视力丧失的人55岁及以上的主要原因特性关键支持。而没有治疗AMD的已被确定的，健康的RPE在患病眼中植入可能被证明是一种有效的治疗，以及大量的RPE细胞可以从多能干细胞可以容易地产生。几个关于RPE细胞递送的安全性和有效性有趣的问题仍然可以检查在动物模型中，与用于注入的RPE广为接受的协议已被开发出来。此处所描述的技术中的各种研究已经使用由多个组，并且包括首先创建在眼的孔用锋利的针头。然后用注射器BLUnt的针装有细胞通过孔插入并通过玻璃体，直到它轻轻地接触到视网膜色素上皮。采用这种注射方法，该方法相对简单，并且需要最小的设备，我们实现干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞的一致和有效的整合在宿主的RPE防止在动物模型显著量光感受器变性的之间。而实际的协议不一部分，我们还描述了如何确定诱发的注射，以及如何验证的细胞注射入使用体内成像方式视网膜下腔的创伤的程度。最后，使用该协议的应用不限于视网膜色素上皮细胞;它可以用于任何化合物或细胞进入视网膜下的空间注入。

Protocol

注：所有动物均按照由斯克里普斯研究所成立了道德准则处理。

1.准备材料，为注射（约20分钟）

预暖细胞解离溶液（优选一个是通过稀释灭活，不与血清），无菌PBS，并培养介质（ 表1）。
通过拆卸和它煮沸份在水中15分钟消毒用钝针头注射器。

2.制备的视网膜色素上皮细胞的注射（〜30分钟至1小时）

分离用5-8分钟预温的细胞解离溶液的视网膜色素上皮细胞在37℃。
刮细胞轻轻地释放任何仍附加。
稀释细胞具有大体积的培养基（补满15毫升管）以失活的离解溶液和计数。
离心在800×g离心5分钟以沉淀细胞。
重悬的细胞以200,000个细胞/微升（提供100,000个细胞在0.5微升体积）在无菌的预温热的PBS，并将它们转移到一个1.5ml微量管中。
任选地，添加活细胞瞬态荧光标记物，并培育在37℃下30-45分钟。
装入注射器的钝针用0.5微升细胞。尽快注入细胞。

3.子视网膜注射（〜每次注射5分钟）

注意：如果可能的话，学习技术有成年白鼠自角膜缘船只更容易形象化。当学习更容易促进注射部位的可视化（试图注入细胞前）注入坚牢绿溶液。

麻醉的啮齿动物。使用100mg / ml的氯胺酮和10mg / ml的甲苯噻嗪（20微升/ 10克的机身瓦特腹膜内注射8）以上异氟烷吸入由于难以操纵的啮齿动物，并注入到眼睛中与在吸入器的炉鼻。
1. 确保动物深受捏它的爪子1麻醉。如果退缩，等待几个分钟，开始视网膜下注射前再试一次。
啮齿动物的位置倒向一侧，这样，将被注入的眼睛对着天花板。
在解剖显微镜下轻轻舒展皮肤，使眼部弹出小幅上涨了插座（临时突眼），并通过举办它的头用两个手指正上方的耳朵，它的下巴，轻轻地舒展平行于眼睑皮肤变得更容易让眼睛弹出小幅上涨从插槽中（参见图1C）。不掌握啮齿动物太近喉咙。
用30升G一次性预消毒针头，立即使角膜缘下方的孔（如果船只被击中，流血会BË显著和它是以后难以找到该孔），并以一定的角度，以避免与所述针（ 图1D）接触透镜。避免接触与锐（或钝）针或立即白内障的形成将发生镜头。
注意：注射工作两个人好。这样一个人就可以通过注射器的针头钝他们所创建的第一个孔后，用锋利的一次性针保持专注于那里的孔进行注射的人。
从眼睛缩回一次性尖锐的针，同时保持在头部的把手。记得确切位置的孔。
无论是后安装的预装注射器上的显微钝针或者手握住它，将通过孔的钝针注射器的尖端，再小心不要接触到镜头，轻轻地通过眼睛推轻轻地，直到感觉阻力（ 图1D）。
ķeeping所有运动到最低限度，精心注入RPE细胞慢慢进入视网膜下腔。
注：RPE /视网膜脱离会引起;这是不可避免的。然而，清洁器喷射最小的分离，极大地提高了再附着（ 图1E）的机会。任何夸张的动作可能将针回视网膜和侧身的动作可以损伤视网膜。使用注射泵是可选的，但允许非常精确的递送。
收回注射器缓慢。敷眼滴保湿，保持眼部水分。
继续监测动物，直到它重新获得胸骨斜卧。不要让动物无人值守或返回到与其他动物的警戒笼子里，直到它重新获得胸骨斜卧。

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Representative Results

我们可以提供RPE细胞的悬浮液进入啮齿动物的视网膜下腔迅速，稳定地使用本手稿中描述的技术。虽然不是必需的，创伤可以大大使用具有图1A和B中的显微所示的设置最小化。持啮齿类如图1C临时突眼。的步骤是相同的，如果与微操作或由手执行;这些描绘在图1D卡通。当从标记为视网膜色素上皮细胞中进行干净荧光可以利用CSLO和诱导视网膜脱离可使用OCT系统（ 图2）可以看出被检测到。在图3中一个CSLO被用来（由图2和图3中的图像被立即捕获之后的视网膜下注射）捕获围绕整个注射部位的多个图像。注意支队是米OST在中心图像（3-5）深刻（但不严重）。

图1.视网膜下注射平台和喷射技术的卡通图示。（A）孔钻成的金属板贴上解剖显微镜。（B）上的磁架显微可以进出在注射位置移动。（C）持有的啮齿动物如临时突眼。（ D）的描写眼睛的键结构（D;步骤3.4）的孔制成在眼睛与正下方的角膜缘和透镜尖一次性针（D;步骤3.6）将钝针插入孔并通过针锋相对的视网膜，直到轻轻抚摸RPE（D;步骤3.8）。注射细胞诱导临时退役伊纳勒脱离。请点击此处查看该图的放大版本。

直接视网膜下注射后拍摄图2.眼底图像。（A）在右侧面板（红外和FAF图像的叠加）观察到的绿色荧光由iPS-RPE细胞标记短暂的荧光标记被发射。（B）神经视网膜视网膜脱离和RPE被注入近观察视网膜下注射（标有箭头）后的网站。星号（A）标签的视神经。（这个数字正在从Krohne公司等再版原始格式^。21）比例尺= 200微米请点击ħERE查看该图的放大版本。

图3. 在体内成像直接注射后使用OCT进行注射部位周围。使用的OCT设备，我们可以捕捉注射部位周围的多个图像，以确定分离的注入和程度两者的有效性。在本实施例中最小的脱离（视为图像3-5特别肿胀）被观察到。比例尺= 200微米

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Discussion

在这篇文章中，我们描述了在大鼠和小鼠进行RPE细胞的视网膜下注射悬浮一个比较简单的方法。该协议是简单易学和更多的经验与技术将在较少创伤平移（ 图3;这代表了更好注射1），特别是如果一个微操作时（ 图1A）。任何创伤可以在体内与CSLO和OCT系统（ 图2），如果可用来监测。如果更高的分辨率和更低噪声图像被需要，是本领域的成像平台的状态提供，以及用于在鼠疾病模型^39-41执行OCT优良协议。

与此技术相关的最常见的并发症的手术过程中产生的，从该动物的定位不当，诱导过度视网膜脱离，引起脉络膜出血，以及从针RPE细胞的回流。如果定位不适当，这将是困难的，以创建第一孔，并且更难之后找到它。移动眼睛可能掩盖孔，使得穿透与钝针是不可能的。虽然这是可能的，以使另一个孔用锋利的针头，这产生更多的创伤。发音视网膜脱离会导致严重的视力丧失。支队诱导视网膜神经元和神经胶质细胞的特征形态变化;反应性神经胶质增生和视网膜重塑这些的组合可以促进光感受器细胞死亡^42。最后，如果压力太大施加用钝尖的注射器，脉络膜出血可致。如果太多的压力被施加时，RPE和Bruch膜可发生与一些的iPS-RPE的突破所用的脉络膜观察到的，虽然这些实例是罕见的。注射RPE细胞到视网膜和玻璃体的回流更频繁地发生，并且是难以避免的。这可以通过缩回syrin被最小化GE与钝针非常缓慢注射后（在这方面的显微是非常有用的）。

在该领域中使用的其他技术是更复杂的，但也显著更具挑战性（综述见冉斯登等人^30）。有可能通过穿过巩膜，脉络膜，视网膜色素上皮和插入一个尖锐的针在相反的方向注入细胞悬液进入视网膜下的空间。这种技术需要显著更多的实践和专业知识;直到掌握，大多数视网膜色素上皮细胞的将注入脉络膜或视网膜和从未整合到视网膜下腔。（另外，由于眼睛的机会有限，这种方法不适合于在人类患者中使用。）另外，也可以植入极化RPE ⁴³的完整单层。这是通过展开RPE细胞的片材通过狭缝视网膜下方，或者通过人工多孔基材和insertin上生长的细胞中进行任克既细胞和假肢进入视网膜下的空间。这些技术的优点是显而易见的RPE细胞不需要“repolarize”在植入，以及潜在的RPE细胞色素球体形成逃脱到视网膜，可以在很大程度上避免^16,44。然而，这些手术技术是固有地更加复杂。此外，在人类中，RPE和假肢将需要黄斑下通过必须用激光进行烧灼的狭缝插入。这将导致烧灼区域周围的视网膜变性。

利用这里所概述的协议的优点是，它可以进行可靠性，是最简单的学习，并可以用来递送其它化合物或细胞外的RPE。此外，轻微的修改（用尖锐的针，而不是钝针递送细胞），这种相同的技术可以被用于递送的细胞或药物玻璃体内。我们一基耶韦一致的结果与该技术，并已经学会尽量减少与通过经验并通过体内成像监测所述技术相关的创伤。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1