Medicine

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

La conversion de la lumière en impulsions électriques se produit dans la rétine externe et est réalisée en grande partie par bâtonnets et des cônes photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des cellules. RPE fournir un soutien essentiel pour les photorécepteurs et la mort ou le dysfonctionnement des cellules RPE est caractéristique liée à l'âge dégénérescence maculaire (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente chez les personnes de 55 ans et plus. Alors pas de remède pour AMD a été identifié, l'implantation d'un EPR sain dans les yeux malades peut se avérer un traitement efficace, et un grand nombre de cellules RPE peut être facilement généré à partir de cellules souches pluripotentes. Plusieurs questions intéressantes quant à l'innocuité et l'efficacité de la prestation des cellules RPE peuvent encore être examinés dans des modèles animaux, et des protocoles bien acceptées utilisées pour injecter RPE ont été développés. La technique décrite ici a été utilisé par plusieurs groupes dans diverses études et consiste à créer d'abord un trou dans l'œil avec une aiguille. Ensuite, une seringue avec une bluaiguille nt chargé avec des cellules est inséré à travers le trou et passe à travers le corps vitré jusqu'à ce qu'il touche le RPE. En utilisant cette méthode d'injection, ce qui est relativement simple et nécessite un minimum d'équipement, nous obtenons une intégration cohérente et efficace des cellules RPE dérivés de cellules souches dans le RPE entre hôte qui empêche la quantité importante de dégénérescence des photorécepteurs chez des modèles animaux. Bien que ne faisant pas partie du protocole proprement dit, on décrit également comment déterminer l'ampleur du traumatisme induit par l'injection, et la façon de vérifier que les cellules ont été injectées dans l'espace sous-rétinien en utilisant des modalités d'imagerie in vivo. Enfin, l'utilisation de ce protocole ne est pas limitée aux cellules RPE; il peut être utilisé pour injecter ne importe quel composé ou d'une cellule dans l'espace sous-rétinien.

Protocol

REMARQUE: Tous les animaux ont été traités conformément aux directives éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation des matériaux pour l'injection (~ 20 min)

Solution de dissociation cellulaire pré-chaud (de préférence une qui est inactivé par dilution avec du sérum non), du PBS stérile et le milieu de culture (Tableau 1).
Stériliser la seringue avec une aiguille émoussée de démonter les pièces d'ébullition et dans l'eau pendant 15 min.

2. Préparation des cellules RPE pour injection (~ 30 min à 1 h)

Détacher les cellules RPE utilisant une solution préchauffée dissociation cellulaire pour 5-8 min à 37 ° C.
Grattez les cellules doucement pour libérer celles qui sont encore attachés.
Diluer les cellules avec un grand volume de milieu de culture (remplir un tube de 15 ml) pour inactiver la solution de dissociation et les compter.
Centrifuger à 800 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
Remettre en suspension les cellules à 200 000 cellules / ul (à livrer 100 000 cellules dans un volume de 0,5 pi) dans stérile préchauffée PBS et les transférer dans un tube de 1,5 ml.
Facultativement, ajouter un marqueur fluorescent transitoire de cellules vivantes et incuber à 37 ° C pendant 30 à 45 min.
Chargez la seringue avec une aiguille émoussée avec 0,5 pi de cellules. Injecter les cellules dès que possible.

3. Sous-rétinienne injection (~ 5 min par injection)

NOTE: Si possible, apprendre la technique avec des rats albinos adultes depuis les navires limbe sont beaucoup plus faciles à visualiser. Injecter la solution vert rapide lors de l'apprentissage (avant d'essayer d'injecter des cellules) pour faciliter plus facilement la visualisation du site d'injection.

Anesthésier le rongeur. Utilisez injection intrapéritonéale de 100 mg / ml kétamine et 10 mg / ml de xylazine (20 pi / 10 g de corps whuit) sur isofluorane inhalation car il est difficile de manoeuvrer le rongeur et l'injecter dans l'oeil avec le museau de l'inhalateur.
1. Assurez-vous que l'animal est profondément anesthésié en pinçant une de ses pattes. Se il sursaute, attendre encore plusieurs minutes et essayez à nouveau avant de commencer l'injection sous-rétinien.
Placez le rongeur sur le côté afin que l'œil qui sera injecté est confronté le plafond.
Sous un microscope de dissection étirer doucement la peau afin que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (de proptosis temporaire) et devient plus accessible en tenant la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et de sa mâchoire et étirer doucement la peau parallèlement aux paupières de sorte que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (voir figure 1C). Ne pas saisir le rongeur trop près de la gorge.
Avec une aiguille de pré-stérilisé jetable forte 30 G, faire un trou juste au-dessous du limbe (si les navires sont touchés, saignement be significative et il sera difficile de trouver le trou plus tard) et à un angle pour éviter de toucher l'objectif avec l'aiguille (figure 1D). Évitez de toucher l'objectif avec le aiguille pointue (ou émoussée) ou la formation immédiate de la cataracte se produira.
NOTE: Les injections fonctionnent mieux avec deux personnes. De cette façon, une personne peut passer la seringue avec l'aiguille émoussée à la personne effectuant l'injection après avoir créé le premier trou avec l'aiguille jetable forte de maintenir l'accent sur la où le trou est.
Rétracter l'aiguille jetable forte de l'œil tout en maintenant la poignée sur la tête. Ne oubliez pas exactement où le trou est.
Après soit le montage de la seringue pré-chargé avec une aiguille émoussée sur un micromanipulateur ou le tenant par la main, insérez la pointe de la seringue avec l'aiguille émoussée à travers le trou, en prenant également soin de ne pas toucher la lentille et doucement pousser à travers l'œil très doucement jusqu'à ce qu'une résistance se sentir (figure 1D).
Keeping tous les mouvements au minimum, injecter attentivement les cellules RPE lentement dans l'espace sous-rétinien.
REMARQUE: décollement de l'EPR / de la rétine sera induite; ce est inévitable. Cependant, une injection propre minimise le détachement et améliore considérablement les chances de rattachement (figure 1E). Les mouvements exagérés peuvent reculer l'aiguille dans la rétine, et les mouvements latéraux peuvent endommager la rétine. L'utilisation d'une pompe d'injection est facultative, mais permet une livraison très précise.
Rétracter la seringue lentement. Appliquer hydratant de gouttes pour les yeux de garder l'oeil hydraté.
Continuer à surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal. Ne pas laisser animal sans surveillance, ou retourner à une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal.

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Representative Results

Nous pouvons livrer une suspension de cellules RPE dans l'espace sous-rétinien de rongeurs rapidement et régulièrement en utilisant la technique décrite dans ce manuscrit. Bien que pas nécessaire, les traumatismes peuvent être considérablement réduits au minimum en utilisant la configuration illustrée avec un micromanipulateur à la figure 1A & B. Maintenir le rongeur comme représenté sur la figure 1C pour une exophtalmie temporaire. Les étapes sont les mêmes se il est effectué avec le micromanipulateur ou à la main; ceux-ci sont représentés dans le dessin animé à la figure 1D. Quand elle est réalisée proprement fluorescence provenant des cellules RPE marquées peuvent être détectées en utilisant un CSLO et le décollement de la rétine induite peut être vu avec un système OCT (figure 2). Sur la figure 3 un CSLO a été utilisé pour capturer plusieurs images autour de l'ensemble d'injection (les images de la figure 2 et la figure 3 ont été capturés immédiatement après l'injection sous-rétinienne). Notez que le détachement est most profond (mais pas grave) dans les images centrales (5.3).

Figure 1. La plate-forme d'injection sous-rétinienne et d'une bande dessinée illustrant la technique d'injection. (A) Des trous ont été percés dans une plaque de métal à apposer le microscope de dissection. (B) Un micromanipulateur sur un support magnétique peut être déplacé dans et hors de position pendant les injections. (C) Tenir le rongeur comme le montre par proptosis temporaire. ( D) Représentation des structures clés de l'œil (D;. étape 3.4) Un trou est fait dans les yeux avec une aiguille jetable forte juste sous le limbe et la lentille (D;. étape 3.6) Une aiguille émoussée est inséré dans le trou et à travers la rétine diamétralement opposée jusqu'à toucher doucement la RPE (D; Etape 3.8). L'injection des cellules induit une ret temporaireInal détachement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Fundus images prises directement après l'injection sous-rétinien. (A) La fluorescence verte observée dans le panneau de droite (de superposition des images IR et FAF) est émis par iPS-RPE cellules marquées avec un marqueur fluorescent transitoire. (B) décollement de la rétine de la rétine neurale et RPE est observée près de l'injection site après injection sous-rétinienne (marqué par la flèche). Asterisk (A) Étiquettes le nerf optique. (Ce chiffre est republié dans son format original de Krohne et al. ²¹⁾ Barre d'échelle = 200 um Se il vous plaît cliquez havant pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. L'imagerie in vivo en utilisant octobre autour du site d'injection immédiatement après l'injection. L'utilisation d'un dispositif octobre on peut capturer plusieurs images autour du point d'injection afin de déterminer à la fois l'efficacité de l'injection et de l'étendue du détachement. Dans cet exemple, le détachement minime (vu que le gonflement en particulier dans les images 3-5) est observée. Barres d'échelle = 200 um

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Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement simple pour réaliser des injections sous-rétiniens de cellules RPE en suspension dans les rats et les souris. Le protocole est facile à apprendre et plus d'expérience avec la technique se traduiront par moins de traumatismes (figure 3, ce qui représente l'un des meilleurs injections), surtout si un micromanipulateur est utilisé (figure 1A). Tout traumatisme peut être contrôlée in vivo avec un système d'ALSC et octobre (Figure 2) si disponible. Si la résolution plus élevée et moins bruyants images sont souhaitées, état des plates-formes d'imagerie de l'art sont disponibles, ainsi que d'excellents protocoles pour effectuer octobre dans les modèles murins de la maladie ^39-41.

Les complications les plus communs associés à cette technique découlent de mauvais positionnement de l'animal pendant la chirurgie, induisant décollement de la rétine excessive, causant des hémorragies de la choroïde, et le reflux des cellules RPE de l'aiguille. Si positionnéinappropriée, il sera difficile de créer le premier trou, et encore plus difficile à trouver après. Déplacement de l'oeil pourrait obscurcir le trou, rendant la pénétration avec l'aiguille émoussée impossible. Bien qu'il soit possible de faire un autre trou avec une aiguille, ce qui crée plus de traumatisme. Décollement de la rétine prononcées peuvent entraîner une perte visuelle sévère. Détachements induisent des changements morphologiques caractéristiques dans les neurones de la rétine et de la glie; ces combinaisons de gliose réactive et le remodelage de la rétine peuvent favoriser la mort des cellules photoréceptrices ^42. Enfin, si trop de pression est appliquée avec la seringue avec la pointe émoussée, hémorragie choroïdienne peut être induite. Si trop de pression est appliquée, percée de l'EPR et de la membrane de Bruch peut se produire et certains iPS-RPE peut être observée dans la choroïde, bien que ces cas sont rares. Le reflux de cellules RPE injecté dans la rétine et le vitré se produit plus fréquemment, et est difficile à éviter. Ceci peut être minimisé en rétractant la Syringe avec l'aiguille émoussée très lentement après l'injection (à cet égard la micromanipulateur est incroyablement utile).

Autres techniques utilisées dans le domaine sont plus sophistiqués, mais sont aussi beaucoup plus difficile (pour revue, voir Ramsden et al. ^30). Il est possible d'injecter des cellules en suspension dans l'espace sous-rétinien en insérant une aiguille pointue dans la direction opposée à travers la sclérotique, la choroïde et RPE. Cette technique nécessite beaucoup plus de pratique et d'expertise; jusqu'à ce maîtrisé, la plupart des cellules de l'EPR seront injectés dans la choroïde ou de la rétine et de ne jamais se intégrer dans l'espace sous-rétinien. (En outre, en raison de l'accès limité de l'œil, cette approche ne est pas adaptée pour une utilisation chez des patients humains.) Il est également possible d'implanter des monocouches intactes de RPE polarisée ^43. Cela se fait soit en déroulant une feuille de cellules RPE en dessous de la rétine à travers une fente, ou par croissance des cellules sur un substrat poreux artificiel et inserting fois les cellules et prothétiques dans l'espace sous-rétinien. Les avantages de ces techniques sont évidentes que les cellules RPE ne ont pas besoin de "repolariser" lors de l'implantation, et la formation potentielle de sphères pigmentées de cellules RPE qui se échappent dans la rétine peuvent être largement évités ^16,44. Cependant, ces techniques chirurgicales sont intrinsèquement encore plus compliqué. De plus, chez l'homme, l'EPR et prothétique devra être insérée sous la macula à travers une fente qui doit être cautérisé avec un laser. Cela se traduira par une dégénérescence de la rétine dans la région cautérisée.

L'avantage d'utiliser le protocole décrit ici est qu'il peut être effectuée de fiabilité, est la plus facile à apprendre, et peut être utilisé pour fournir d'autres composés ou cellules RPE ailleurs. En outre, avec de légères modifications (en utilisant l'aiguille forte plutôt que l'aiguille émoussée de livrer les cellules), cette même technique peut être utilisée pour fournir des cellules ou des médicaments par voie intravitréenne. Nous unChieve des résultats cohérents avec cette technique, et ont appris à minimiser le traumatisme associé à la technique par l'expérience et par la surveillance in vivo d'imagerie.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1