Medicine

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

המרה של אור לדחפים חשמליים מתרחשת ברשתית החיצונית ומושגת בעיקר על ידי קולטני אור מוט וחרוט ואפיתל הפיגמנט ברשתית תאים (RPE). הרשתית לספק תמיכה קריטית לקולטניים אור ומוות או תפקוד לקוי של תאי הרשתית הוא אופייני של ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD), הגורם העיקרי לאיבוד ראייה קבוע באנשים בגיל 55 ומעלה. אמנם אין תרופה לAMD זוהתה, השתלה של הרשתית בריאה בעיניים חולות עשויה להיות טיפול יעיל, ומספר גדול של תאי הרשתית יכול להיות שנוצר בקלות מתאי גזע pluripotent. כמה שאלות מעניינות בנוגע לבטיחות והיעילות של משלוח תא הרשתית עדיין יכולות להיבחן במודלים של בעלי חיים, ופרוטוקולים מקובלים היטב המשמשים להזרקת הרשתית פותחו. הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש על ידי מספר קבוצות במחקרים שונים וכרוכה ביצירת חור בעין עם מחט חדה ראשונה. אז מזרק עם bluמחט NT עמוסה תאים מוכנסת דרך החור ועברה דרך הזגוגית עד שנוגע בעדינות ברשתית. שימוש בשיטת ההזרקה הזה, שהוא פשוט יחסית ודורש ציוד מינימאלי, אנחנו להשיג אינטגרציה של תאי הרשתית המופק מתאי גזע עקבית ויעילה בין הרשתית המארח המונעת כמות משמעותית של ניוון קולטי אור במודלים של בעלי חיים. אמנם לא חלק מהפרוטוקול בפועל, אנחנו גם מתארים כיצד לקבוע את היקף הטראומה הנגרמת על ידי ההזרקה, וכיצד לוודא שהתאים הוזרקו לתוך חלל subretinal באמצעות בשיטות ההדמיה vivo. לבסוף, השימוש בפרוטוקול זה אינו מוגבל לתאי הרשתית; זה יכול לשמש כדי להזריק כל מתחם או תא לחלל subretinal.

Protocol

הערה: טופלו כל בעלי החיים בהתאם לקווים המנחים האתיים שנקבעו על ידי מכון מחקר Scripps.

1. הכנת חומרים להזרקה (~ 20 דקות)

פתרון טרום חם תא דיסוציאציה (רצוי אחד שהוא מובטל באמצעות דילול, לא עם סרום), PBS סטרילי, ותקשורת ותרבות (טבלה 1).
לעקר את המזרק עם מחט בוטה על ידי הפירוק ורותח החלקים במים במשך 15 דקות.

2. הכנת תאי RPE להזרקה (~ 30 דקות עד 1 שעה)

לנתק את תאי RPE באמצעות פתרון תא דיסוציאציה מראש התחמם במשך 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
לגרד את התאים בעדינות כדי לשחרר את כל שעדיין מחוברים.
לדלל את התאים עם נפח גדול של תקשורת והתרבות (למלא את צינור 15 מיליליטר) כדי להשבית את פתרון הניתוק ולספור אותם.
צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
Resuspend התאים ב 200,000 תאים / μl (כדי לספק 100,000 תאים בנפח 0.5 μl) בPBS מראש חימם סטרילי ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
לחלופין, להוסיף סמן ניאון חולף תא חי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות.
טען את המזרק עם מחט קהה עם 0.5 μl של תאים. להזריק את התאים בהקדם האפשרי.

3. הזרקה תת-רשתית (~ 5 דקות לכל הזרקה)

הערה: אם אפשר ללמוד, הטכניקה עם חולדות לבקן מבוגרות מאז כלי ימבוס הם הרבה יותר קלים לדמיין. הזרק פתרון ירוק מהיר כאשר למידה (לפני שתנסה להזריק תאים) כדי להקל על הדמיה של הזריקה בקלות רבה יותר.

להרדים את המכרסמים. השתמש בזריקות intraperitoneal של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -10 מ"ג / מיליליטר xylazine (20 μl / גוף g 10 wשמונה) על שאיפת isofluorane מכיוון שקשה לתמרן המכרסמים ולהזריק לתוך העין עם החוטם במשאף.
1. ודא כי בעל החיים הוא בהרדמה עמוקה על ידי צובט אחת מכפותיו. אם זה נרתע, לחכות עוד כמה דקות ונסה שוב לפני תחילת הזרקת subretinal.
מקם את המכרסם על הצד שלה, כך שהעין שיהיה להזריק פונה לתקרה.
תחת מיקרוסקופ לנתח בעדינות למתוח את העור כל כך את העין קופצת מעט למעלה מהשקע (proptosis הזמני) והופכת לנגישים יותר במחזיק את הראש שלה עם שתי אצבעות מעל האוזן ועל ידי הלסת שלה ובעדינות למתוח את העור במקביל לעפעפיים כך שהעין קופצת מעט למעלה מהשקע (ראה איור 1 ג). לא לתפוס את המכרסם קרוב מדי לגרון.
עם מחט חד פעמי חד של 30 G-מעוקר מראש, לעשות חור מייד מתחת לימבוס (אם כלי פגעו, דימום יהיה בדואר משמעותי וזה יהיה קשה למצוא את החור בהמשך) ובזווית כדי להימנע מלגעת בעדשה עם המחט (1D איור). הימנע מלגעת בעדשה עם המחט החדה (או בוטה) או היווצרות קטרקט מיידית תתרחש.
הערה: זריקות לעבוד טוב יותר עם שני אנשים. בדרך זו אדם אחד יכול לעבור את המזרק עם המחט הבוטה לאדם שבצע את הזריקה לאחר שיצר את החור הראשון עם מחט חד פעמי החד לשמור על מיקוד על שם החור הוא.
לחזור בו את המחט החדה פעמית מהעין, תוך שמירה על האחיזה בראש. זוכר בדיוק איפה החור הוא.
לאחר שתי הרכבה המזרק הטעון מראש עם מחט בוטה על micromanipulator או מחזיק אותו ביד, הכנס את הקצה של המזרק עם המחט הבוטה דרך החור, טיפול שוב לא לגעת בעדשה ובעדינות לדחוף אותו דרך העין מאוד בעדינות עד שההתנגדות מרגישה (1D איור).
Keeping כל התנועות למינימום, להזריק בזהירות את תאי RPE לאט אל תוך חלל subretinal.
הערה: ניתוק הרשתית / רשתית יהיה המושרה; זה בלתי נמנע. עם זאת, הזרקת חומר ניקוי ממזערת את הניתוק ומשפרת באופן משמעותי את הסיכוי לחיבור מחדש (איור 1E). כל תנועות מוגזמות עלולות להזיז את המחט חזרה לתוך הרשתית, ותנועות לצדדים עלולות לגרום נזק לרשתית. השימוש במשאבת הזרקה הוא אופציונלית, אך מאפשר למסירה מדויקת מאוד.
לחזור בו מהמזרק באיטיות. החל לחות טיפות עיניים כדי לשמור על עין התייבשות.
תמשיך לעקוב אחר בעלי החיים עד שחוזר כיבה sternal. אל תשאיר חיה ללא השגחה או לחזור לכלוב עם בעלי חיים ערניים אחרים עד שחוזר כיבה sternal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו יכולים לספק השעיה של תאי RPE לחלל subretinal של מכרסמים במהירות ובאופן עקבי באמצעות הטכניקה שתוארה בכתב היד הזה. אמנם לא נדרש, טראומות ניתן למזער באופן משמעותי באמצעות ההתקנה מוצגת עם micromanipulator באיור 1 א & B. החזק את המכרסם, כפי שמוצג באיור 1C לproptosis זמני. השלבים זהים אם הופיעו עם micromanipulator או ביד; אלה מתוארים בסרט המצויר באיור 1D. כאשר היא מבוצעת בצורה נקיה הקרינה מתאי הרשתית שכותרתו ניתן לאתר באמצעות cSLO והיפרדות הרשתית הנגרמת ניתן לראות באמצעות מערכת אוקטובר (איור 2). באיור 3 cSLO שימש כדי ללכוד מספר רב של תמונות באזור ההזרקה כולו (תמונות מהאיור 2 ואיור 3 נתפסו מייד לאחר הזרקת subretinal). שים לב לניתוק שהוא מ 'ost עמוק (אך לא קשה) בתמונות המרכז (3-5).

איור 1. פלטפורמת הזרקת subretinal ותיאור קריקטורה של טכניקת ההזרקה. חורים () שנקדחו לתוך צלחת מתכת להדביק מיקרוסקופ לנתח. (B) micromanipulator על מעמד מגנטי ניתן להעביר בתוך ומחוץ לעמדה במהלך הזריקות. (C) החזק את המכרסם, כפי שמוצג לproptosis הזמני. ( כאשר ניתן לראות D) של המבנים העיקריים של העין (D;. שלב 3.4) חור הוא עשה בעין עם מחט חד פעמי חד רק מתחת לימבוס ועדשה (D;. שלב 3.6) מחט קהה מוכנסת לתוך החור ודרך הרשתית מנוגדת עד עדינות נוגע הרשתית (D; שלב 3.8). הזרקה של התאים גורמת מיל זמניINAL ניתוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
תמונות 2. קרקעית איור נלקחות ישירות לאחר הזרקת subretinal. (א) הקרינה הירוקה נצפתה בפנל הימני (כיסוי של תמונות IR וFAF) נפלט מiPS-הרשתית התאים שכותרתו עם סמן פלואורסצנטי חולף. היפרדות רשתית של הרשתית העצבית (B) והרשתית נצפתה ליד ההזרקה אתר לאחר הזרקת subretinal (מסומנת בחץ). כוכבית ב (א) תוויות עצב הראייה. (נתון זה הוא להיות מחדש במתכונתו המקורית מet al Krohne. ²¹⁾ בר סולם = 200 מיקרומטר אנא לחץ here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. בהדמית vivo באמצעות אוקטובר באזור ההזרקה ישירות לאחר ההזרקה. שימוש במכשיר אוקטובר אנחנו יכולים ללכוד מספר רב של תמונות באזור ההזרקה לקבוע הן את היעילות של ההזרקה וההיקף של הניתוק. בניתוק מינימאלי דוגמא זו (שנראה כנפיחות במיוחד בתמונות 3-5) הוא ציין. ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית לביצוע זריקות subretinal של תאי הרשתית בהשעיה בחולדות ועכברים. הפרוטוקול הוא קל ללימוד וניסיון רב יותר עם הטכניקה תהיה לתרגם בפחות טראומות (איור 3, ומייצג את אחת מהזריקות טובות יותר), במיוחד אם micromanipulator משמש (איור 1 א). כל טראומה יכולה להיות במעקב in vivo עם מערכת cSLO ואוקטובר (איור 2) אם הוא זמין. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ופחות רועשות הן רצויים, מצב של פלטפורמות ההדמיה אמנות זמין, יחד עם פרוטוקולים מצוינים לביצוע אוקטובר במודלים עכבריים מחלה ^39-41.

הסיבוכים השכיחים ביותר הקשורים לטכניקה זו נובעים ממיקום לא נכון של בעלי החיים במהלך הניתוח, גרימת היפרדות רשתית מוגזמת, גורמים לשטפי דם choroidal, וreflux של תאי RPE מהמחט. אם מיקוםבצורה בלתי הולמת, יהיה קשה ליצור החור הראשון, ועוד יותר קשה למצוא אותו לאחר. הסטה של העין יכולה לטשטש את החור, מה שהופך את החדירה עם המחט הקהה בלתי אפשרית. למרות שניתן לעשות עוד חור עם מחט חדה, זה יוצר יותר טראומה. הפרדות רשתית בולטות יכולות לגרום לאובדן ראייה חמור. פלוגות לגרום לשינויים מורפולוגיים אופייניים בתאי עצב וגליה רשתית; שילובים של דבק תגובתי ושיפוץ רשתית אלה יכולים לקדם את תאי קולטי אור המוות ^42. לבסוף, אם יותר מדי לחץ מוחל עם המזרק עם הקצה הקהה, יכול להיגרם דימום choroidal. אם לחץ הרבה יותר מדי מיושם, פריצת הדרך של הרשתית והקרום של ברוך יכול להתרחש וכמה iPS-הרשתית ניתן לצפות בדמתה העין, למרות שהמקרים אלה הם נדירים. Reflux של תאי הרשתית שהוחדרו לתוך הרשתית והזגוגית מתרחש בתדירות גבוהה יותר, וקשה להימנע. זה יכול להיות ממוזער על ידי חוזר בי syringe עם המחט הבוטה מאוד לאט לאחר ההזרקה (בהקשר זה micromanipulator הוא שימושי להפליא).

טכניקות אחרות המשמשות בתחום הן מתוחכמות יותר, אבל גם באופן משמעותי יותר מאתגר (לסקירה ראה Ramsden et al. ^30). אפשר להזריק תאים בתרחיף לחלל subretinal על ידי החדרת מחט חדה בכיוון ההפוך דרך לובן העין, דמית העין, והרשתית. טכניקה זו דורשת יותר באופן משמעותי בפועל ומומחיות; עד שולט, רוב תאי RPE יהיה להזריק לתוך דמית העין או ברשתית ולא להשתלב במרחב subretinal. (כמו כן, בשל גישה מוגבלת של העין, גישה זו אינה מתאימה לשימוש בבני אדם.) כמו כן ניתן להשתיל monolayers שלם של הרשתית מקוטבת ^43. זה נעשה גם על ידי שנפרש יריעה של תאי הרשתית מתחת לרשתית דרך הפתח, או על ידי גידול התאים במצע נקבובי מלאכותי וinserting שני תאים ותותבים לתוך חלל subretinal. היתרונות של טכניקות אלה הם ברורים כמו תאי RPE לא צריכים "repolarize" על השתלה, והיווצרות הפוטנציאל של תחומים פיגמנט של תאי הרשתית שלהימלט לתוך הרשתית ניתן להימנע ^16,44 במידה רבה. עם זאת, טכניקות הניתוחיות אלה מטבעם אפילו יותר מסובך. יתר על כן, בבני אדם, הרשתית והתותבת תצטרך להיות מוכנסת מתחת למקולה דרך פתח שיש צרוב עם לייזר. זה יגרום לניוון רשתית סביב האזור הצרוב.

היתרון בשימוש בפרוטוקול שתואר כאן הוא שזה יכול להתבצע אמינות, הוא הקל ביותר ללמוד, והוא יכול לשמש כדי לספק תרכובות או תאים אחרים מלבד הרשתית. יתר על כן, עם שינויים קלים (באמצעות מחט החדה ולא המחט הקהה, כדי לספק את התאים), אותה טכניקה זו יכולה לשמש כדי לספק תאים או סמים intravitreally. אנחנוchieve תוצאות עקביות עם טכניקה זו, ולמדתי כדי למזער את הטראומה הקשורים לטכניקה דרך חוויה ודרך in vivo ניטור הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1