Utføre subretinal injeksjoner i Gnagere å levere retinal pigment epitelet Cells i Suspension

Abstract

Omdannelsen av lys til elektriske impulser inntreffer i den ytre retina, og utføres i stor grad av stang- og kjeglefotoreseptorene og retinalt pigmentepitel (RPE) celler. RPE gi kritisk støtte for fotoreseptorene og død eller dysfunksjon av RPE celler er karakteristisk for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), den ledende årsak til permanent synstap hos personer 55 år og eldre. Mens ingen kur for AMD har blitt identifisert, kan implantasjon av sunn RPE i syke øyne vise seg å være en effektiv behandling, og et stort antall RPE-celler kan lett genereres fra pluripotente stamceller. Flere interessante spørsmål angående sikkerhet og effekt av RPE celle levering kan fortsatt bli undersøkt i dyremodeller, og godt anerkjente protokoller som brukes til å injisere RPE har blitt utviklet. Den teknikk som er beskrevet her har blitt brukt av flere grupper i forskjellige studier og innebærer først å lage et hull i øyet med en skarp nål. Deretter en sprøyte med en blunt p lastet med cellene er satt inn gjennom hullet og føres gjennom glasslegemet inntil den så vidt berører RPE. Ved hjelp av denne metoden injeksjon, noe som er relativt enkel og krever minimalt utstyr, oppnår vi konsekvent og effektiv integrering av stamcelle-avledet RPE-celler i mellom verts RPE som hindrer betydelig mengde av fotoreseptoren degenerasjon i dyremodeller. Selv ikke en del av selve protokollen beskriver vi også hvordan å fastslå omfanget av traumer forårsaket av injeksjon, og hvordan du kontrollerer at cellene ble injisert i subretinal plass ved hjelp av in vivo bildediagnostikk. Til slutt er anvendelse av denne protokollen ikke begrenset til RPE-celler; Det kan anvendes for å injisere en hvilken som helst forbindelse eller celle inn i subretinal plass.

Protocol

MERK: Alle dyrene ble behandlet i tråd med de etiske retningslinjene fastsatt av Scripps Research Institute.

1. Klargjøring av materialer for Injection (~ 20 min)

1. Pre-varm celledissosiasjon løsning (fortrinnsvis en som er inaktivert ved fortynning, ikke med serum), steril PBS, og kulturmedium (Tabell 1).
2. Sterilisere sprøyten med en butt nål ved å demontere den og koking av delene i vann i 15 min.

2. Fremstilling av RPE-celler til injeksjon (~ 30 min til 1 time)

1. Løsne RPE-celler ved hjelp av forvarmet celledissosiasjon løsning for 5-8 minutter ved 37 ° C.
2. Skrap cellene forsiktig å frigi noen som fremdeles er festet.
3. Fortynn cellene med et stort volum av kulturmedium (fylle opp et 15 ml rør) for å inaktivere dissosiasjon løsning og telle dem.
4. Sentrifuger ved 800 xg i 5 minutter for å pelletere cellene.
5. Resuspender cellene ved 200.000 celler / mL (for å levere 100000 celler i en 0,5 ul volum) i steril forvarmet PBS og overføre dem til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
6. Eventuelt legge til et levende celle forbigående fluoriserende fargestoff og inkuberes ved 37 ° C i 30-45 min.
7. Laste sprøyten med en butt nål med 0,5 mL av celler. Injisere cellene så snart som mulig.

3. Under retinal Injection (~ 5 min per Injection)

MERK: Hvis det er mulig, lære teknikken med voksne albinorotter siden limbus fartøyene er mye lettere å visualisere. Injisere Fast Grønn løsning når man lærer (før du prøver å injisere celler) for å lettere lette visualisering av injeksjonsstedet.

1. Bedøve gnager. Bruk intraperitoneale injeksjoner av 100 mg / ml ketamin og 10 mg / ml xylazin (20 mL / 10 g kropps wåtte) over isofluorane inhalering siden det er vanskelig å manøvrere gnagere og injisere inn i øyet med snuten i inhalatoren.
   1. Sørge for at dyret er dypt bedøvet ved å knipe en av labbene. Hvis det flinches, vente flere minutter og prøv igjen før du begynner subretinal injeksjon.
2. Plasser gnager på sin side, slik at øyet som skal injiseres er vendt mot taket.
3. Under en disseksjonsmikroskop forsiktig strekke huden slik øyet spretter litt opp og ut av kontakten (midlertidig proptosis) og blir mer tilgjengelig ved å holde hodet med to fingre like over øret og ved sin kjeve og forsiktig strekke huden parallell til øyelokkene slik at øyet spretter litt opp og ut av kontakten (Se figur 1C). Ikke ta tak i gnager for nær halsen.
4. Med en 30 G skarp disponibel pre-sterilisert nål, lage et hull rett under limbus (dersom fartøyene blir truffet, vil blødning be betydelig og det være vanskelig å finne hullet senere) og i en vinkel for å unngå å berøre linsen med nålen (figur 1D). Unngå å ta på linsen med den skarpe (eller butt) nål eller umiddelbar katarakt vil skje.
   MERK: Injeksjoner fungere bedre med to personer. På denne måten en person kan passere sprøyten med butt nål til den som utfører injeksjon etter at de har skapt det første hullet med den skarpe engangsnål for å opprettholde fokus på hvor hullet er.
5. Trekk inn disponibel skarp nål fra øyet og samtidig opprettholde grepet på hodet. Huske nøyaktig hvor hullet er.
6. Etter enten montering av pre-lastet sprøyte med en butt nål på en micromanipulator eller holde det for hånd, sette spissen på sprøyten med butt nål gjennom hullet, ta vare igjen ikke berører linsen og skyv den forsiktig gjennom øyet veldig forsiktig til å føle motstand (figur 1D).
7. Keeping alle bevegelser til et minimum, nøye injisere RPE-celler langsomt inn i subretinal plass.
   MERK: RPE / retina avløsning vil bli indusert; Dette er uunngåelig. Men en renere injeksjon minimerer avløsning og forbedrer sjansene for reattachment (figur 1E). Eventuelle overdrevne bevegelser kan flytte nålen tilbake i netthinnen, og sidelengs bevegelser kan skade netthinnen. Bruken av en injeksjonspumpe er valgfritt, men gir mulighet for en meget nøyaktig levering.
8. Trekke sprøyten sakte. Påfør øye fuktighetsdråper for å holde øye hydrert.
9. Fortsette å overvåke dyret før det gjenvinner sternum recumbency. Ikke la dyr uten tilsyn eller gå tilbake til et bur med andre varsel dyr før det gjenvinner sternum recumbency.

Representative Results

Vi kan levere en suspensjon av RPE-celler inn i subretinal plass av gnagere raskt og jevnt ved hjelp av den teknikk som er beskrevet i dette manuskriptet. Selv om ikke nødvendig, kan traumer bli sterkt redusert ved bruk av oppsettet som vises med en micromanipulator i figur 1A & B. Hold gnager slik som vist i figur 1C for midlertidig proptosis. Trinnene er de samme hvis det utføres med mikromanipluatoren eller for hånd; disse er avbildet i tegneserien i figur 1D. Når utført rent fluorescens fra de merkede RPE-celler kan påvises ved hjelp av en cSLO og den induserte netthinneavløsning kan sees ved hjelp av en oktober system (figur 2). I figur 3 en cSLO ble brukt til å fange opp flere bilder rundt hele injeksjonsstedet (bildene fra Figur 2 og Figur 3 ble tatt umiddelbart etter subretinal injeksjon). Legg merke til avløsning som er most dyp (men ikke alvorlig) i sentrum bilder (3-5).

Figur 1. subretinal injeksjon plattform og en tegneserie skildring av injeksjonsteknikk. (A) hull ble boret inn i en metallplate for å feste disseksjonsmikroskop. (B) En mikromanipulator på en magnetisk stativ kan beveges inn og ut av stilling under injeksjonen. (C) Hold gnager slik som vist for midlertidig proptosis. ( D) Visning av de viktige strukturer i øyet (D;. Trinn 3.4) En hull i øyet med en skarp engangsnål like under limbus og linsen (D;. Trinn 3.6) En stump nål settes inn i hullet og gjennom diametralt motstående retina inntil forsiktig berøre RPE (D, trinn 3.8). Injeksjon av cellene induserer en midlertidig retInal avløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Fundus bilder tatt rett etter subretinal injeksjon. (A) Den grønne fluorescens observert i panelet til høyre (overlegg av IR og FAF bilder) slippes ut fra iPS-RPE celler merket med en forbigående fluoriserende fargestoff. (B) Netthinneavløsning av den nevrale netthinnen og RPE er observert nær injeksjons området etter subretinal injeksjon (markert med pil). Stjerne i (A) etiketter synsnerven. (Dette tallet blir republisert i sitt opprinnelige format fra Krohne et al. ²¹⁾ Scale bar = 200 mikrometer Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. In vivo avbildning ved hjelp oktober rundt injeksjonsstedet direkte etter injeksjonen. Ved hjelp av en oktober enhet kan vi ta flere bilder rundt injeksjonsstedet for å bestemme både effektiviteten av injeksjonen og omfang løsgjøring. I dette eksempelet minimal avløsning (sett på som hevelse spesielt i bildene 3-5) er observert. Skala barer = 200 mikrometer

Discussion

I denne artikkelen beskriver vi en relativt enkel fremgangsmåte for å utføre subretinal injeksjoner av RPE-celler i suspensjon i rotter og mus. Protokollen er lett å lære og mer erfaring med teknikken vil oversette i færre traumer (figur 3, og dette representerer en av de bedre injeksjoner), spesielt hvis en micromanipulator brukes (figur 1A). Noen traumer kan overvåkes in vivo med en cSLO og OCT-systemet (figur 2) hvis tilgjengelig. Hvis høyere oppløsning og mindre støyende bilder er ønsket, state of the art bilde plattformer er tilgjengelig, sammen med gode protokoller for å utføre oktober i murine sykdomsmodeller ^39-41.

De vanligste komplikasjoner forbundet med denne teknikken oppstår fra feilaktig posisjonering av dyret i løpet av operasjonen, indusere dreven netthinneavløsning, forårsaker koroidal blødninger, og refluks av RPE-celler fra nålen. Hvis plassertfeilaktig, vil det være vanskelig å skape det første hullet, og enda vanskeligere å finne den etter. Forskyvning av øyet kunne skjule hull, noe som gjør penetrasjon med butt nål umulig. Mens det er mulig å gjøre et annet hull med en skarp nål, skaper dette mer traumer. Uttales netthinneløsning kan føre til alvorlig synstap. Avdelinger indusere karakteristiske morfologiske endringer i netthinnens nerveceller og gliaceller; disse kombinasjonene av reaktiv gliose og retinal ombygging kan fremme fotoreseptoren celledød ^42. Til slutt, hvis for mye trykk påføres med sprøyte med butt spiss, koroidal blødning kan induseres. Hvis altfor stort trykk som påføres, kan gjennombrudd av RPE og Bruch membran kan forekomme, og noen IPS-RPE observeres i årehinnen, selv om slike tilfeller er sjeldne. Reflux av RPE-celler injisert inn i netthinnen og glasslegemet forekommer hyppig, og det er vanskelig å unngå. Dette kan minimaliseres ved å trekke tilbake syringe med butt nål meget langsomt etter injeksjon (i denne forbindelse mikromanipluatoren er utrolig nyttig).

Andre teknikker som benyttes i felten er mer sofistikerte, men er også betydelig mer utfordrende (for oversikt se Ramsden et al. ^30). Det er mulig å injisere cellene i suspensjonen i det subretinal plass ved å sette inn en skarp nål i den motsatte retning gjennom sklera, årehinnen og RPE. Denne teknikken krever betydelig mer praksis og kompetanse; inntil mestres, vil det meste av RPE-celler injiseres i årehinnen og netthinnen og aldri integreres i subretinal plass. (Også, på grunn av begrenset tilgang av øyet, er denne metoden uegnet for bruk i menneskelige pasienter.) Det er også mulig å implantere intakte monolag av polarisert RPE ^43. Dette gjøres enten ved avrulling av et ark av RPE-celler under netthinnen gjennom en spalte, eller ved å dyrke cellene på et kunstig porøst substrat og inserting både cellene og protesen inn i subretinal plass. Fordelene med disse teknikkene er opplagt som RPE cellene ikke trenger å "repolarize" ved implantasjon, og potensialet dannelse av pigmenterte områder av RPE celler som rømmer inn i netthinnen kan i stor grad unngås ^16,44. Men disse kirurgiske teknikker er iboende enda mer komplisert. Videre, hos mennesker, vil RPE og protesen må innsettes under makula gjennom en spalte som skal kauteriseres med en laser. Dette vil resultere i retinal degenerasjon rundt kauteriseres regionen.

Fordelen ved å bruke den protokoll som er beskrevet her er at det kan utføres pålitelighet, er den enkleste å lære, og kan brukes til å levere andre forbindelser eller celler foruten RPE. Videre, med mindre modifikasjoner (ved hjelp av en skarp nål, i stedet for den stumpe nål for å levere de celler), den samme teknikken kan brukes til å levere celler eller medikamenter intravitrealt. Vi enChieve konsistente resultater med denne teknikken, og har lært å redusere traume forbundet med den teknikk som gjennom erfaring og ved in vivo avbildning overvåking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1