Utföra subretinal injektioner i Gnagare att leverera pigmentepitelet celler i suspension

Abstract

Omvandlingen av ljus till elektriska impulser sker i den yttre näthinnan och sker till stor del av tappar och stavar fotoreceptorer och retinal pigment epitel (RPE) celler. RPE ger kritiskt stöd för fotoreceptorer och död eller dysfunktion av RPE-celler är karakteristisk för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den vanligaste orsaken till bestående synnedsättning hos personer 55 år och äldre. Medan ingen bot för AMD har identifierats, kan implantation av friska RPE i sjuka ögon visa sig vara en effektiv behandling, och ett stort antal RPE-celler kan lätt genereras från pluripotenta stamceller. Flera intressanta frågor om säkerhet och effekt av RPE cell leverans kan fortfarande undersökas i djurmodeller, och väl erkända protokoll som används för att injicera RPE har utvecklats. Tekniken som beskrivs här har använts av flera grupper i olika studier och involverar att först skapa ett hål i ögat med en vass nål. Sedan en spruta med en blunt nål laddad med celler förs in genom hålet och passerade genom glaskroppen tills den vidrör RPE. Med hjälp av denna injektionsmetod, som är relativt enkel och kräver minimal utrustning, uppnår vi konsekvent och effektiv integration av stamcells härrörande RPE celler i mellan värd RPE som förhindrar betydande mängd ljusmätare degeneration i djurmodeller. Även om inte en del av själva protokoll, beskriver vi också hur man bestämmer omfattningen av det trauma som inducerats genom injektion, och hur man kan verifiera att de celler injicerades i subretinalområdet med hjälp av in vivo-avbildningsmetoder. Slutligen är användningen av detta protokoll inte begränsad till RPE-celler; den kan användas för att injicera varje förening eller cellen i subretinalområdet.

Protocol

OBS: Alla djuren behandlas i enlighet med de etiska riktlinjer som fastställts av Scripps Research Institute.

1. Beredning av material för Injection (~ 20 min)

1. Pre-varm cell dissociation lösning (helst en som är inaktiv genom utspädning, inte med serum), steril PBS, och odlingsmedier (tabell 1).
2. Sterilisera sprutan med en trubbig nål genom att demontera det och koka delarna i vatten under 15 minuter.

2. Framställning av RPE-cellerna för injektion (~ 30 min till 1 timme)

1. Lossa de RPE celler med hjälp förvärmda cell dissociation lösning för 5-8 minuter vid 37 ° C.
2. Skrapa cellerna försiktigt för att släppa någon som fortfarande är fästa.
3. Späd cellerna med en stor volym av odlingsmedia (fylla upp en 15 ml rör) för att inaktivera dissociationslösningen och räkna dem.
4. Centrifugera vid 800 xg under 5 minuter för att pelletera cellerna.
5. Resuspendera cellerna vid 200.000 celler / il (för att leverera 100.000 celler i en 0,5 l volym) i steril förvärms PBS och överföra dem till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
6. Du kan också lägga en levande cell gående fluorescerande markör och inkubera vid 37 ° C under 30-45 min.
7. Fyll sprutan med en trubbig nål med 0,5 | il av celler. Injicera cellerna så snart som möjligt.

3. Under retinal Injection (~ 5 min per Injection)

OBS: Om det är möjligt, lära sig tekniken med vuxna albinoråttor, eftersom limbus fartyg är mycket lättare att visualisera. Injicera Fast Green lösning när lärande (innan du försöker injicera celler) för att lättare lätta visualisering av injektionsstället.

1. Söva gnagare. Använd intraperitoneala injektioner av 100 mg / ml ketamin och 10 mg / ml xylazin (20 pl / 10 g kroppsvikt wåtta) över isofluoran inandning, eftersom det är svårt att manövrera gnagaren och injicera i ögat med nosen i inhalatorn.
   1. Se till att djuret djupt sövda genom att klämma en av sina tassar. Om det flinches, vänta ytterligare några minuter och försök igen innan subretinal injektionen.
2. Placera gnagare först på sidan, så att ögat som kommer att injiceras är vänd mot taket.
3. Enligt en dissekera mikroskop försiktigt sträcka huden så ögat dyker något upp ur sockeln (tillfällig proptosis) och blir mer tillgänglig genom att hålla sitt huvud med två fingrar precis ovanför örat och genom sin käke och försiktigt sträcka huden parallellt med ögonlocken så att ögat dyker något upp ur sockeln (se figur 1C). Ta inte tag i gnagare för nära halsen.
4. Med en 30 giss disponibel försteriliserat nål, gör ett hål omedelbart under limbus (om fartygen drabbas, kommer blödningar be betydande och det vara svårt att hitta hålet senare) och i en vinkel för att undvika att röra linsen med nålen (Figur 1D). Undvik att röra linsen med vassa (eller trubbig) nål eller omedelbar kataraktbildning inträffar.
   OBS: Injektioner fungerar bättre med två personer. På detta sätt en person kan passera sprutan med trubbig nål till den person som utför injektionen efter att de har skapat det första hålet med den vassa engångsnål att behålla fokus på där hålet.
5. Dra in engångs vass nål från ögat under upprätthållande greppet på huvudet. Kom ihåg exakt där hålet.
6. Efter antingen montering av förinstallerade spruta med en trubbig nål på en mikromanipulator eller hålla det för hand, in spetsen på sprutan med trubbig nål genom hålet, noga igen att inte röra linsen och tryck försiktigt genom ögat mycket försiktigt tills känslan motstånd (Figur 1D).
7. Keeping alla rörelser till ett minimum, försiktigt injicera RPE-cellerna långsamt i subretinalområdet.
   OBS: RPE / näthinnan lossnar kommer att induceras; detta är oundvikligt. Men minimerar en renare injektion lösgör och kraftigt förbättrar chanserna för återfastsättning (Figur 1E). Eventuella överdrivna rörelser kan flytta nålen tillbaka in i näthinnan, och sidorörelser kan skada näthinnan. Användningen av en insprutningspump är valfri men tillåter en mycket exakt leverans.
8. Dra tillbaka sprutan långsamt. Applicera ögonfuktande droppar att hålla ögat hydratiserade.
9. Fortsätta att övervaka djuret tills det återfår sternala VILA. Lämna inte djur utan tillsyn eller återgå till en bur med andra djur alert tills den återfår sternala VILA.

Representative Results

Vi kan leverera en suspension av RPE-celler in i det subretinala utrymmet i gnagare snabbt och konsekvent användning av den teknik som beskrivs i detta manuskript. Även om det inte krävs, kan trauman kraftigt minimeras med hjälp av installations visas med en mikromanipulator i Figur 1A & B. Håll gnagare som visas i figur 1C för tillfällig proptosis. Stegen är desamma om de utförs med mikromanipulator eller för hand; Dessa visas i den tecknade i figur 1D. Om de utförs rent fluorescens från de märkta RPE-celler kan detekteras med användning av en cSLO och den inducerade näthinneavlossning kan ses med användning av ett oktober systemet (figur 2). I fig 3 en cSLO användes för att fånga flera bilder runt hela injektionsstället (bilderna från figur 2 och figur 3 fångades omedelbart efter subretinal injektion). Notera avskiljandet som är mOST djupgående (men inte svår) i centrumbilder (3-5).

Figur 1. subretinala injektion plattform och en tecknad bild av injektionsteknik. (A) Hål borrades in i en metallplatta för att anbringa dissekera mikroskop. (B) En mikromanipulator på ett magnetiskt stativ kan flyttas in och ut ur position under injektionerna. (C) Håll gnagare som visas för tillfällig proptosis. ( D) Visning av de viktigaste strukturerna i ögat (D;. Steg 3.4) Ett hål görs i ögat med en vass engångsnål precis under limbus och objektivet (D;. Steg 3.6) En trubbig nål förs in i hålet och genom den diametralt motsatta näthinnan tills försiktigt vidröra RPE (D; Steg 3.8). Injektion av cellerna inducerar en tillfällig retnalet lossnar. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Fundus bilder tas direkt efter subretinal injektion. (A) Den gröna fluorescens observerades i den högra panelen (överlagring av IR och FAF bilder) emitteras från iPS-RPE-celler märkta med en övergående fluorescerande markör. (B) Näthinneavlossning av den neurala näthinnan och RPE observeras nära injektions webbplats efter subretinal injektion (markerad med pil). Asterisk i (A) etiketter synnerven. (Denna siffra är nytt i sitt ursprungliga format från Krohne et al. ²¹⁾ Skala bar = 200 nm Klicka here för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. In vivo imaging använder oktober runt injektionsstället direkt efter injektionen. Använda ett ULT-enhet som vi kan fånga flera bilder runt injektionsstället för att bestämma både effektivitet injektionen och omfattning lossnar. I detta exempel minimal detachement (ses som svullnad framför allt i bilder 3-5) observeras. Skalstrecken = 200 ^ m

Discussion

I den här artikeln beskriver vi en relativt enkel metod för att utföra subretinal injektioner av RPE celler i suspension i råttor och möss. Protokollet är lätt att lära och mer erfarenhet med tekniken kommer att översätta i färre trauman (Figur 3, vilket är en av de bättre injektioner), särskilt om en mikromanipulator används (Figur 1A). Varje trauma kan övervakas in vivo med en cSLO och oktober systemet (figur 2) om den är tillgänglig. Om högre upplösning och mindre bullriga bilder önskas, toppmoderna avbildnings plattformarna finns, tillsammans med utmärkta protokoll för att utföra ULT musmodeller sjukdoms ^39-41.

De vanligaste komplikationerna som förknippas med denna teknik uppstår på grund av felaktig placering av djuret under operationen, förmå driven näthinneavlossning, vilket orsakar koroidala blödningar, och återflöde av RPE-celler från nålen. Om de placerasolämpligt, blir det svårt att skapa det första hålet, och ännu svårare att hitta den efter. Växling av ögat kunde skymma hålet, vilket gör penetration med trubbig nål omöjligt. Även om det är möjligt att göra ett annat hål med en skarp nål, skapar detta mer trauma. Uttalade retinala avdelningar kan leda till allvarliga synnedsättning. Avdelningar framkalla karakteristiska morfologiska förändringar i näthinnans nervceller och glia; dessa kombinationer av reaktiv gliosis och retinal ombyggnad kan främja fotoreceptorcelldöd ^42. Slutligen, om för mycket tryck appliceras med sprutan med trubbig spets, koroidal blödning kan induceras. Om alldeles för mycket tryck appliceras, kan observeras genombrott av RPE och Bruchs membran kan uppstå och några iPS-RPE i åderhinnan, även om dessa fall är sällsynta. Återflöde av injicerade RPE-celler in i näthinnan och glaskroppen inträffar oftare och är svårt att undvika. Detta kan minimeras genom att dra tillbaka syrinGE med den trubbiga nålen mycket långsamt efter injektionen (i detta avseende mikromanipulator är otroligt användbart).

Andra tekniker som används inom området är mer sofistikerade, men är också betydligt mer utmanande (för översikt se Ramsden et al. ^30). Det är möjligt att injicera celler i suspension i det subretinala utrymmet genom att sätta in en vass nål i motsatt riktning genom senhinnan, koroidea, och RPE. Denna teknik kräver betydligt mer övning och expertis; tills behärskar, de flesta av de RPE-celler kommer att injiceras i åderhinnan eller näthinnan och aldrig integreras i subretinalområdet. (Också, på grund av begränsad tillgång av ögat, är detta tillvägagångssätt olämpligt för användning i mänskliga patienter.) Det är också möjligt att implantera intakta monolager av polariserad RPE ^43. Detta görs antingen genom avrullning av ett ark av RPE-celler under näthinnan genom en slits, eller genom att odla cellerna på ett artificiellt poröst substrat och inserting både cellerna och protes i subretinal utrymmet. Fördelarna med dessa tekniker är uppenbara eftersom RPE-celler inte behöver "repolarize" vid implantation, och den potentiella bildningen av pigmentesfärer RPE celler som kommer ut i näthinnan kan till stor del undvikas ^16,44. Dessa kirurgiska tekniker är emellertid i sig ännu mer komplicerat. Vidare, i människor, kommer RPE och protes måste föras in under makulan genom en slits som skall kauteriseras med en laser. Detta kommer att resultera i retinal degeneration runt flamberats regionen.

Fördelen med att använda det protokoll som beskrivs här är att det kan utföras tillförlitlighet, är det enklaste att lära sig, och kan användas för att leverera andra föreningar eller celler förutom RPE. Vidare, med smärre ändringar (med hjälp av vassa nålen snarare än den trubbiga nålen för att leverera cellerna), denna samma teknik kan användas för att leverera celler eller droger intravitrealt. Vi enchieve konsekventa resultat med denna teknik, och har lärt sig att minimera trauma i samband med tekniken genom erfarenhet och genom in vivo imaging övervakning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1