Abstract
استخدام في النظام النموذجي الزرد لدراسة التنمية والتجديد، والمرض يتوسع نحو استخدام قلوب الكبار لتفارق الخلية وتنقية RNA، DNA، والبروتينات. كل من هذه التطبيقات مطالبة الانتعاش السريع لأعداد كبيرة من قلوب الزرد لتجنب الجينات التنظيمية والتمثيل الغذائي، والتغيرات الأخرى التي تبدأ بعد الموت. كما يطلب قلوب الزرد الكبار لدراسة بنية القلب لمجموعة متنوعة من المسوخ وللدراسة تجديد القلب. ومع ذلك، فإن تشريح القلب الزرد التقليدي بطيء وصعب ويتطلب الأدوات المتخصصة، مما يجعل نطاق واسع تشريح قلوب الزرد الكبار مملة. الطرق التقليدية أيضا المرفأ من مخاطر الإضرار القلب أثناء تشريح. هنا، نحن تصف طريقة لتشريح قلوب الزرد الكبار التي هي سريعة، استنساخه، ويحافظ على بنية القلب. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب هذا الأسلوب الأدوات المتخصصة، وغير مؤلم لالزرد،لا يمكن أن يؤديها على عينات جديدة أو ثابتة، ويمكن أن يؤديها على الزرد الشباب مثل شهر واحد من العمر. النهج وصف يوسع استخدام الزرد الكبار للأبحاث القلب والأوعية الدموية.
Protocol
ملاحظة: تأكد دائما أن موافقة لجنة IACUC أو الأخلاق هي في مكان قبل البدء في أي إجراء التجارب باستخدام الزرد.
1. إعداد الكواشف والإعداد
- إعداد الحلول التالية. العثور على وصفات لجميع هذه الحلول في كتيبات الزرد القياسية 10.
- 500 مل من البيض المياه
- 200 مل من 0.03٪ تريكين في البيض المياه
- 100 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
- RBC الاحتياطي تحلل (اختياري)
- عازلة الوجهة المفضلة (تثبيتي، Trizol، PBS، الخ) في أنبوب 1.5 مل microfuge على الجليد
ملاحظة: تثبيتي، وTrizol سامة إذا كانت تتلامس مع الجلد. ارتداء القفازات عند التعامل مع هذه المواد.
- إعداد الإعداد تشريح:
- ضع مصدر الضوء معقوفة على المجهر تشريح. وضع غطاء من 9 سم طبق بتري على المسرح المجهر تشريح، وتصب طبقة رقيقة من برنامج تلفزيوني 1X إلىأنه (يتم استخدام غطاء لأن الطبق نفسه هو عميق جدا لتشريح السهل).
- وضع طبق بتري نفسها (وليس غطاء) على كونترتوب بالقرب من نطاق تشريح وتصب حوالي 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X في ذلك. استخدام هذا لغسل القلب بعد تشريح. بدلا من ذلك، استخدم RBC الاحتياطي تحلل.
- مكان شفرة حلاقة، واثنين من أزواج من ملقط، microscissors (اختياري)، وماصة نقل بجانب المجهر. الحصول على وعاء من الجليد إذا ما تم اختيار القتل الرحيم التي كتبها التبريد السريع.
- صب 200 مل من 0.03٪ تريكين في البيض الماء في كوب 250 مل دورق إذا ما تم اختيار القتل الرحيم التي كتبها تريكين. إعداد حقيبة واقية صغيرة للتخلص من جثث الزرد.
2. إعداد الزرد
- وبالنسبة للأسماك ثابتة، وجلب الأسماك ثابتة، تشطف في برنامج تلفزيوني، إلى الإعداد المجهر.
- الموت ببطء الزرد الكبار كله التبريد السريع مع الثلج ل> 10 دقيقة.
- استخدام ملقط لإحداث ثقب في الجلد فوق الصفاق(بعيدا عن القلب) للمساعدة في اختراق مثبت، ومن ثم وضعها في بارافورمالدهيد 4٪ في فيكس العازلة 10 لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
- بدلا من ذلك، للأسماك الطازجة والأسماك المكان المراد الموت الرحيم في خزان صغير وتقديمهم إلى الإعداد المجهر. اعتمادا على بروتوكول الأسماك المنشأة الفردية والاستخدامات المصب لقلوب الأسماك تشريح، تخدير الأسماك مع تريكين أو الموت ببطء عن طريق التبريد السريع قبل قطع الرأس.
- استخدام الثلج، والتقاط الأسماك واحد مع السمك الصافي وضعها في الماء المثلج حتى توقف الأسماك تتحرك، ما يقرب من 5 دقائق.
- بدلا من ذلك، لاستخدام تريكين، والتقاط الأسماك واحد مع السمك الصافي ومكان في الدورق من الحل حتى تتوقف الحركات الخيشومية.
- بسرعة التقاط الأسماك الموت الرحيم من زعنفة الذيل ووضع على جانبها في الغطاء طبق بيتري التي كانت مليئة برنامج تلفزيوني 1X. استخدام ملقط لرفع زعنفة الصدرية بيد واحدة، في حين باستخدام razoص شفرة لقطع رأس السمكة مع جهة أخرى، الخلفي عادل إلى المرفق من الزعنفة الصدرية (الشكل 1A). تنفيذ هذه الخطوة سواء من خلال النظر من خلال المجهر أو مجرد تصور مباشرة الأسماك على المسرح المجهر.
ملاحظة: سوف الأسماك طازجة الموت الرحيم لا يزال ينزف بعد قطع الرأس.
الشكل 1. الزرد تشريح القلب الكبار يستخدم المعالم التشريحية الزرد. (A) لقطع رأس السمكة، ورفع الزعنفة الصدرية مع ملقط واستخدام شفرة حلاقة حادة نظيفة على طول خط منقط أحمر كما هو مبين. (B) لثابت رئيس الأسماك، ووضع طينة واحدة من ملقط في حين فم السمكة من طينة أخرى يكمن عبر العين، ومن ثم تحويل رئيس الأسماك بحيث السطح البطني هو ما يصل، وكلا أسنان من ملقط مستقرة ضد الجزء السفلي من طبق بيتري. (C) استخدم forc مجاناالعائد على السهم لقطع الحجز على الغطاء الخيشومي (السهم). (D) رفع هذا الشريان الأبهر الظهري مرئيا كهيكل الأبيض مع شريط وردي تدل الدم اللمعية (السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تشريح القلب
- تصور رئيس الأسماك تحت المجهر. مع واحد ملقط، ثابت رئيس الأسماك عن طريق وضع طينة واحدة من ملقط في فم السمكة، من خلال الدماغ، في حين أن طينة الآخر هو خارج الرأس، عبر العين (الشكل 1B). ضمان كلا من أسنان ملقط هي ثابتة أمام السفلي من طبق بتري. عقد رئيس الأسماك بهذه الطريقة، سطحه البطني يجب متجهة لأعلى.
- مع جهة أخرى، استخدم ملقط الثانية لقطع التعلق بطني منطقة الغطاء الخيشومي للجسم (السهم، الشكل 1C). رفع هذا قليلا مع ملقط، دستظهر orsal الشريان الأورطي تحت كهيكل الأبيض مع شريط أحمر من الدم في التجويف الأبهر (السهم، 1D الشكل). قطع الشريان الأبهر الظهري مع ملقط عن طريق معسر الشريان الأورطي وسحب صعودا. بدلا من ذلك، استخدم microscissors لقطع الشريان الأبهر الظهري.
- الآن، استخدم ملقط الثانية لفهم الزعنفة الصدرية من قاعدتها، بما في ذلك الغضروف الجسم عند قاعدة الزعنفة، ورفع هذا الخروج. كرر مع غيرها من الزعنفة الصدرية. أحيانا، والقلب يخرج مع الزعانف الصدرية، وذلك بفحص هذه القطع للتأكد من عدم ويرد القلب قبل التخلص منها.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يكون القلب مرئية، لا تزال سليمة ومتصلة إلى رئيس الأسماك المتبقية (على الرغم من أن في بعض الأحيان يتعلق الأمر قبالة مع الزعانف الصدرية). يمكن التعرف على القلب من قبل شكله، لونه وردي، وكونها محاطة التامور المصطبغة. لأنه يتم تنفيذ القتل الرحيم من الأسماك بسرعة، قد تكون قلوب الأسماك الطازجة الموت الرحيم لا يزال الضرب سلوفاكياwly. - ترك للرئيس الأسماك مع ملقط الأولى، بحيث أن كلا يديه تمسك ملقط ومجانية. استخدام كل ملقط لندف قلب بعيدا عن التامور. فهم القلب من قبل ما تبقى من الشريان الأبهر الظهري بينما يتم سحبها التامور المتبقية بعيدا.
ملاحظة: سواء الثابتة أو الطازجة، والقلب هو قوي لطيف سحب في حين أن الأنسجة الضامة المحيطة بها أكثر قابلة للتفتيت. ولذلك، أي نوع من الأنسجة المحيطة التامور يمكن تشريح بعيدا مع قلب المتبقية سليمة. - تجاهل الذبيحة الأسماك متبقية في حقيبة واقية.
4. إعداد القلب للتطبيقات المصب
- باستخدام ملقط، فهم قلب على حافة ظهري الشريان الأورطي / بصلة شريانية ومكان القلب في طبق جديد من برنامج تلفزيوني 1X. بدلا من ذلك، استخدم ماصة نقل. نقل القلب ذهابا وإيابا في برنامج تلفزيوني حول 10X ليغسل الكثير من الدم ممكن.
- وبالنسبة للتطبيقات التي من المهم لإزالة كافة possibخلايا الدم جنيه، ويغسل في 9 سم طبق بتري مع 15 مل RBC الاحتياطي تحلل بدلا من برنامج تلفزيوني، باستخدام نفس ذهابا وإيابا الحركة. إذا الحفاظ على هيكل القلب ليس مهما لتطبيق المصب (على سبيل المثال، مما يجعل RNA)، واستخدام الملقط أو microscissors لفتح تجويف القلب وتسهيل الشطف بعيدا من خلايا الدم.
- وبالنسبة للتطبيقات التي يتم المطلوب حجرات القلب منفصلة، استخدم ملقط أو microscissors لتشريح بصلة شريانية، الأذين، والبطين بعيدا عن بعضها البعض.
- نقل القلب، أو غرف منفصلة، إلى المخزن المؤقت الوجهة على الجليد.
ملاحظة: تشمل الوجهات الشائعة مخازن لتفارق الخلية، 4٪ امتصاص العرق، أو Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه الطريقة، قلب الزرد البالغين يمكن تشريح في أقل من 1 دقيقة، مقارنة مع أكثر من 5 دقيقة باستخدام الطرق التقليدية 8. قلوب تشريح باستخدام هذه الطريقة سليمة موثوق (الشكل 2A)، في حين أن الطرق التقليدية تتطلب 8 قطع عمياء في التامور وبالتالي تسبب عادة أضرار أو خسائر في الأذين أو بصلة شريانية (الشكل 2B). قلوب تشريح الحفاظ على السلامة الهيكلية وهي مناسبة لالأنسجة (الشكل 2C)، المجهر الإلكتروني (الشكل 2D)، وكذلك بالنسبة لتطبيقات حيث يتم فصلها القلب أو المسحوق. في أيدينا، من تشريح 50 القلوب على مدار التجارب لمدة أسبوع، تم الحصول على 50 قلوب سليمة هيكليا. علينا أيضا أن تدرس هذه التقنية لزميل له في المختبر الذين ليس لديهم خبرة مع تشريح الزرد. كان 9 من أصل 9 قلوب تشريح من قبل زميل المبتدئين أيضا strucسليمة turally. هذه الطريقة تشريح مناسب للأحداث مضى عليها أكثر من 1 الشهر القديمة، وبالنسبة للبالغين من جميع الأعمار.
الشكل 2. تشريح قلوب سليمة والحفاظ على السلامة المعمارية. (A) في أقل من 1 دقيقة، قلب الزرد الكبار مع الأذين سليمة (A)، البطين (V)، والشريانية بصلة (BA) يمكن تشريح من سمكة الموت الرحيم. (B) الكبار التقليدية تشريح القلب الزرد تستغرق وقتا أطول وحتى عندما يتم الحرص، عرضة لخطر التلف. هنا، فقط البطين سليمة. (C) القلب تشريح من تيراغرام (myl7 dsRed) الأسماك البالغة الحفاظ على سلامة الهيكلية للاستخدام في الأنسجة. وينظر إلى الأذين (A)، البطين (V)، والشريانية بصلة (BA)، والهياكل أصغر مثل صمام الأذيني البطيني (AV، السهم) والمسالك تدفق (OFT، السهم) سليمة. (D) </ قوي> المجهر الإلكتروني لتشريح البرية من نوع القلب الكبار يظهر أن sarcomeres تبقى التالفة من خلال عملية تشريح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أساليب لتشريح القلب الزرد الكبار وقد وصفت، كانت هذه الأساليب تستغرق وقتا طويلا، وتسبب عادة الأضرار التي لحقت القلب أثناء تشريح. لإجراء التجارب حيث قد تكون هناك حاجة لعدد كبير من قلوب الكبار، و / أو عندما تجنب تدهور أنسجة القلب من المهم للتطبيقات المصب، والوقت المطلوب باستخدام تقنيات تشريح التقليدية باهظة. وبالمثل، والحصول على بتكاثر التالفة، وقلوب سليمة المهم لدراسة بنية القلب وللطرق المناعى والفحص المجهري. لقد وجدنا أنه حتى في أيدي مبتدئين، تم انتشال 100٪ من قلوب تشريح سليمة هيكليا. وعموما، فإن طريقة لتشريح القلب البالغين المقدمة هنا يقدم سلفة في الاسلوب الذي يوسع استخدام الزرد الكبار لمجموعة متنوعة من التطبيقات الحالية والمستقبلية، بما في ذلك استخدامها في إصابة القلب والتجارب التجدد.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة ثithin هذا البروتوكول. أولا، اعتمادا على التجربة التي يطلب من قلوب الزرد، من المهم لشطف قلوب أكبر قدر ممكن من خلايا الدم. أمثلة من التجارب التي يمكن أن تستفيد من إزالة خلايا الدم وتشمل استرداد قلوب لRNA تسلسل، حيث جود الدم سوف يغير ملامح التعبير الجيني، أو لFACS الفرز، حيث قد يكون من الصعب فرز من خلايا عضلة القلب من خلايا الدم. بعد الموت الرحيم السمك مع تريكين أو الجليد، من المهم لقطع رأس السمكة بسرعة والسماح نزيف يحدث للمساعدة في تخليص القلب من الدم الزائد. إذا لم يكن مطلوبا قلب سليمة للتجربة مخطط لها، يمكن أن تكون مفيدة لخفض الأذين والبطين مفتوحة عندما تكون في برنامج تلفزيوني لزيادة التشطيف الدم. ويمكن أيضا RBC العازلة تحلل أن تستخدم بدلا من برنامج تلفزيوني.
ثانيا، على النحو المذكور أعلاه، وأحيانا قلب يأتي قبالة مع واحدة من الزعانف الصدرية بدلا من البقاء تعلق على الرأس. لذلك، وسحب الزعانف الصدريةقبالة تحت المجهر بحيث يمكن التعرف على القلب. وأخيرا، عندما تشريح القلب بعيدا عن المحيطة التامور، وليس محاولة لفهم القلب نفسه. بدلا من ذلك، فهم قطعتين من التامور وسحب لهم على حد سواء بعيدا عن القلب، والتي لديها اكثر السلامة الهيكلية من التأمور قابلة للتفتيت. في هذه الطريقة، حتى الحد الأدنى من الضرر إلى القلب يمكن تجنبها.
وينبغي أن يكون قلب يسهل التعرف عليها من قبل شكله وتقلصات. كوسيلة مساعدة إضافية في العثور على القلب، يمكن للمرء أن تشريح القلب معربا عن بروتين فلوري تحت المجهر مضان تشريح. هذه هي عادة ليست هناك حاجة ولكن قد يكون من المفيد للمبتدئين و / أو لتشريح قلوب صغيرة جدا.
واحد الحد من هذه التقنية هو أن تشريح قلوب من الأسماك الصغيرة، أي الذين تقل أعمارهم عن 3 أسابيع من العمر، من الصعب، وقد تم تصميم تقنيات أخرى لتشريح اليرقات 9. أيضا، في حين أنه من السهل لتشريح بصلة لrteriosus، الأذين، والبطين عن بعضها البعض، فإنه ليس من الممكن لتشريح صمام الأذيني البطيني من تلقاء نفسها. صمام لا تزال تعلق إلى البطين في معظم الحالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
