Abstract
Gebruik van het zebravis modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling, regeneratie en ziekte zich uitstrekt tot gebruik van volwassen hart voor celdissociatie en zuivering van RNA, DNA en eiwitten. Al deze toepassingen vereisen het snelle herstel van aanzienlijke aantallen van de zebravis hart voor genregulerend, metabole en andere veranderingen die beginnen na de dood te voorkomen. Volwassen zebravissen harten zijn ook vereist voor het bestuderen hart structuur voor verschillende mutanten en voor het bestuderen hart regeneratie. Echter, de traditionele zebravis hart dissectie is traag en moeilijk en vereist gespecialiseerde gereedschappen, waardoor grootschalige dissectie van volwassen zebravissen harten vervelend. Traditionele methoden brengen ook het risico van beschadiging van het hart tijdens de dissectie. Hier beschrijven we een werkwijze voor dissectie van volwassen zebravissen harten die snel, reproduceerbaar en behoudt hart architectuur. Bovendien is deze methode niet gespecialiseerde hulpmiddelen nodig hebben, is pijnloos voor de zebravis,kan worden uitgevoerd op vers of vaste exemplaren, en kan worden uitgevoerd op de zebravis zo jong als een maand oud. De beschreven aanpak breidt het gebruik van volwassen zebravissen voor cardiovasculair onderzoek.
Protocol
LET OP: Zorg er altijd voor dat de goedkeuring IACUC of ethische commissie is op zijn plaats voor het begin van elke experimentele procedure met behulp van zebravis.
1. Bereid reagentia en setup
- Bereid de volgende oplossingen. Vind de recepten voor al deze oplossingen in standaard handboeken zebravis 10.
- 500 ml van het Ei Water
- 200 ml van 0,03% tricaïne in Egg Water
- 100 ml van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)
- RBC Lyseerbuffer (optioneel)
- Bestemming buffer van keuze (fixatief, Trizol, PBS, etc.) in een 1,5 ml microcentrifugebuis op ijs
OPMERKING: Fixatief en Trizol zijn giftig als ze in contact komen met de huid. Draag handschoenen bij het hanteren van deze stoffen.
- Bereid dissectie setup:
- Plaats de zwanenhals lichtbron over de dissectiemicroscoop. Plaats het deksel van een 9 cm Petrischaal op het ontleden microscoop podium en giet een dunne laag 1x PBS inhet (de deksel wordt gebruikt omdat de schaal zelf is te diep voor een gemakkelijke dissectie).
- Plaats de petrischaal zelf (niet de deksel) op het aanrecht bij het ontleden scope en giet ongeveer 15 ml 1x PBS daarin. Gebruik dit om het hart te wassen na dissectie. U kunt ook gebruik maken van RBC Lyseerbuffer.
- Place scheermes, twee paar tang, microscissors (optioneel) en een transferpipet naast de microscoop. Het verkrijgen van een container van ijs als euthanasie door snelle afkoeling wordt gekozen.
- Giet 200 ml van 0,03% tricaïne in Egg Water in een 250 ml bekerglas als euthanasie door tricaïne wordt gekozen. Bereid een kleine biohazard zak voor de verwijdering van de zebravis karkassen.
2. Bereid zebravis
- Voor vaste vissen, breng vaste vissen, gespoeld in PBS, aan de microscoop setup.
- Euthanaseren de hele volwassen zebravissen door snelle koeling met ijs gedurende> 10 min.
- Een tang om een gat in de huid over het peritoneum(Weg van het hart) steun penetratie van fixatief, en dan zet ze in 4% paraformaldehyde in Fix Buffer 10 voor 2 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C.
- Als alternatief voor verse vis, plaats vis te worden gedood in een klein vuilwatertank en breng aan de microscoop setup. Afhankelijk van de individuele faciliteit vis protocol en de downstream-toepassingen voor de ontleed vis harten, verdoven vis met tricaïne of euthanaseren door snelle afkoeling vóór onthoofding.
- Om ijs te gebruiken, halen een vis met de vis net en plaats in ijswater tot de vis stopt met bewegen, ongeveer 5 min.
- U kunt ook naar tricaïne gebruiken, halen een vis met de vis net en plaats in de beker van de oplossing tot kieuw bewegingen stoppen.
- Snel pak de geëuthanaseerd vis door zijn staartvin en leg het op zijn kant in de petrischaal cover die was gevuld met 1x PBS. Gebruik de tang om een borstvin tillen met één hand, terwijl het gebruik van de Razor mes de vis onthoofden met de andere hand, juist achter de bevestiging van de borstvin (Figuur 1A). Voer deze stap, hetzij door te kijken door de microscoop of door gewoon direct visualiseren van de vis op de microscoop podium.
OPMERKING: Vers geëuthanaseerd vis zal nog steeds bloeden na onthoofding.
Figuur 1. zebravis volwassen hart dissectie maakt gebruik van zebravissen anatomische oriëntatiepunten. (A) om de vis te onthoofden, til de borstvin met een pincet en gebruik een scherpe schoon scheermesje langs de rode stippellijn zoals afgebeeld. (B) Om de vis kop te stabiliseren, plaats een tand van de tang in de vis mond terwijl de andere tand ligt aan de overkant van het oog, en zet de vis kop, zodat het ventrale oppervlak is en beide tanden van de tang zijn stabiel ten opzichte van de bodem van de petrischaal. (C) Gebruik de gratis krachteeps om de bevestiging van het operculum (pijl). (D) Het opheffen van deze gesneden, de dorsale aorta is zichtbaar als een witte structuur met een roze streep aanduiding luminale bloed (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
3. Ontleden het Hart
- Visualiseer de vis kop onder de microscoop. Met een pincet, stabiliseren de vis kop door het plaatsen van een tand van de tang in de vis mond, door de hersenen, terwijl de andere tand buiten het hoofd, over het oog (figuur 1B). Zorgen beide tanden van de tang zijn stabiel tegen de bodem van de petrischaal. Het vasthouden van de vis kop op deze manier, moet haar buikoppervlakte worden naar boven.
- Bij de andere kant gebruikt de tweede tang om de ventrale bevestiging van de operculum lichaamsgevormd (pijl, figuur 1C). Tillen dit iets met de tang, de dorsal aorta wordt hieronder weergegeven als een witte structuur met een rode streep van bloed in de aorta lumen (pijl, figuur 1D). Snijd de dorsale aorta met de tang door knijpen de aorta en omhoog te trekken; alternatief gebruik microscissors aan de dorsale aorta snijden.
- Gebruik nu de tweede tang om de borstvin grijpen van zijn basis, waaronder het lichaam kraakbeen aan de basis van de vin, en verwijder deze uit. Herhaal dit met de andere borstvin. Af en toe, het hart komt met de borstvinnen, dus onderzoekt deze stukken om ervoor te zorgen dat het hart is niet bevestigd om af te leggen.
LET OP: Op dit punt, moet het hart zichtbaar, nog steeds intact en aangesloten op de resterende vis kop te zijn (hoewel af en het komt uit met de borstvinnen). Het hart kan worden geïdentificeerd door zijn vorm, zijn roze kleur, en zijn wezen omgeven door gepigmenteerde hartzakje. Omdat euthanasie van de vis snel wordt uitgevoerd, kan vers geëuthanaseerd vis harten nog steeds kloppen sloWLY. - Laat de vis kop met de eerste tang, zodat beide handen houden pincet en zijn gratis. Gebruik beide tang om uit de buurt van het hartzakje plagen het hart. Pak het hart door de rest van de dorsale aorta, terwijl de resterende hartzakje wordt weggetrokken.
OPMERKING: Of het nu vast of fris, het hart is robuust om zacht te trekken, terwijl het omringende bindweefsel is meer brokkelig. Daarom kan elke omliggende pericardiale weefsel weg te worden ontleed met het hart intact blijft. - Gooi de overgebleven vissen karkas in de biohazard zak.
4. Bereid de Hart voor Downstream Toepassingen
- Met behulp van een tang, pakt het hart door de rand van de dorsale aorta / bulbusarteriosus en plaats het hart in de frisse schotel van 1x PBS. U kunt ook gebruik maken van een transfer pipet. Verplaats het hart heen en weer in de PBS ongeveer 10x zo veel bloed weg te wassen mogelijk.
- Voor toepassingen waarbij het belangrijk is om alle mogeli verwijderenle bloedcellen, wassen in een 9 cm Petrischaal met 15 ml RBC Lysis Buffer plaats PBS, met dezelfde heen en weer gaande beweging. Bij behoud van de structuur van het hart is niet belangrijk voor de stroomafwaartse toepassing (bv waardoor RNA) Gebruik de tang of microscissors de hartholte openen en vergemakkelijken wegspoelen bloedcellen.
- Voor toepassingen waarin afzonderlijke hartkamers gewenst, een tang of microscissors de bulbus arteriosus, atrium en ventrikel apart ontleden van elkaar.
- Transfer het hart, of afzonderlijke kamers, naar de bestemming buffer op ijs.
OPMERKING: Gemeenschappelijke bestemmingen omvatten buffers voor mobiele dissociatie, 4% paraformaldehyde, of Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methode kan een volwassen zebravissen hart ontleed in minder dan 1 minuut, tegen ruim 5 min op traditionele wijze 8. Harten ontleed met behulp van deze methode betrouwbaar intact (Figuur 2A), terwijl de traditionele methoden 8 vereisen snijden blindelings in het hartzakje en daarom vaak beschadiging of verlies van het atrium of bulbusarteriosus (Figuur 2B) veroorzaken. Harten ontleed behouden hun structurele integriteit en zijn geschikt voor histologie (figuur 2C), elektronenmicroscopie (figuur 2D), alsook voor toepassingen waar het hart wordt gedissocieerd of verpulverd. In onze handen, een ontleding van 50 harten in de loop van experimenten een week, 50 harten werden verkregen structureel intact. We hebben ook geleerd van deze techniek om een collega in het laboratorium, die geen ervaring met zebravissen dissectie had. 9 van 9 harten doorsneden door de beginner collega waren ook structureel intact. Deze dissectie methode is geschikt voor jongeren ouder dan 1 maand oud, en voor volwassenen van alle leeftijden.
Figuur 2. Dissected harten zijn intact en architectonische integriteit te behouden. (A) In minder dan 1 minuut, een volwassen zebravissen hart met een intacte atrium (A), ventrikel (V), en bulbusarteriosus (BA) kunnen worden ontleed vanuit een geëuthanaseerd vis. (B) Traditionele volwassen zebravissen hart dissecties langer duren en zelfs wanneer zorg wordt genomen, lopen het risico op schade. Hier is alleen de ventrikel intact. (C) Een hart ontleed uit een Tg (myl7 DsRed) volwassen vissen handhaafde zijn structurele integriteit voor histologisch. Het atrium (A), ventrikel (V) en bulbusarteriosus (BA) worden waargenomen, en nog kleinere structuren zoals de atrioventriculaire klep (AV, pijl) en het uitstroomkanaal (OFT, pijl) intact. (D) </ Strong> Elektronenmicroscopie van een ontleed wild-type volwassen hart laat zien dat sarcomeres blijven onbeschadigd door de dissectie proces. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel werkwijzen voor het ontleden van de volwassen zebravissen hart zijn beschreven, deze werkwijzen zijn tijdrovend en meestal veroorzaakt schade aan het hart tijdens dissectie. Voor experimenten waarbij een groot aantal volwassen hart nodig zijn, uitvoeren en / of bij het voorkomen degradatie van hartweefsel is belangrijk voor downstreamtoepassingen, de benodigde tijd voor traditionele dissectie technieken onbetaalbaar. Evenzo reproduceerbaar verkrijgen onbeschadigde, intacte hart is belangrijk voor studie van hartstructuur en immunohistochemische en microscopische methoden. We vonden dat zelfs in de handen van beginners, 100% harten ontleed teruggewonnen structureel intact. Kortom, de werkwijze voor volwassen hart dissectie gepresenteerde vormt een vooruitgang in de techniek dat het gebruik van volwassen zebravissen voor verschillende huidige en toekomstige toepassingen, waaronder het gebruik van hart schade en regeneratie experimenten uitbreidt.
Er zijn verschillende kritische stappen wedurende dit protocol. Eerst afhankelijk van het experiment waarbij de zebravis hart vereist, is het belangrijk harten zoveel mogelijk van bloedcellen spoelen. Voorbeelden van experimenten die baat zouden hebben bij het verwijderen van bloedcellen van de terugwinning van de harten voor RNA-Seq, waar de aanwezigheid van bloed genexpressie profielen zal veranderen, of voor FACS sorteren, waar bloedcellen moeilijk om te sorteren van hartspiercellen kunnen zijn. Nadat de vis wordt gedood met tricaïne of ijs, is het belangrijk om de vis snel onthoofden en laat bloedingen optreden om af het hart van overtollige bloed. Wanneer een intacte hart niet vereist voor de geplande experiment, kan het nuttig zijn om het atrium en ventrikel snijden open toen in PBS verder spoelen het bloed. RBC lysis buffer kan ook worden gebruikt in plaats van PBS.
Ten tweede, zoals hierboven vermeld, soms het hart verwijderd worden met een van de borstvinnen plaats blijven aan de kop. Daarom trekt de borstvinnenoff onder de microscoop, zodat het hart kan worden geïdentificeerd. Ten slotte, wanneer het ontleden weg van omliggende hartzakje het hart, probeer niet om het hart zelf te begrijpen; in plaats daarvan, pakt twee stukken hartzakje en trek ze beiden weg van het hart, dat meer structurele integriteit dan de broze hartzakje heeft. Zo kan zelfs minimale schade aan het hart te vermijden.
Het hart moet gemakkelijk herkenbaar door zijn vorm en contracties. Als extra steun vinden het hart, kan men een hart ontleden expressie van een fluorescerend eiwit onder een fluorescentie stereomicroscoop. Dit is gewoonlijk niet noodzakelijk, maar kan nuttig zijn voor beginners en / of dissecties zeer kleine harten.
Een beperking van deze techniek is dat ontleden harten van kleine vissen, dwz jonger dan 3 weken oud, moeilijk; andere technieken zijn ontworpen larven dissecties 9. Ook al is het makkelijk om de bulbus een ontledenrteriosus, atrium en ventrikel van elkaar, is het niet mogelijk de atrioventriculaire klep op zichzelf ontleden. De klep blijft meestal aan het ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
