Abstract
Verwendung des Zebrafisch-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Regeneration und Krankheit wird in Richtung der Anwendung erwachsenen Herzen für Zelldissoziationslösung und Aufreinigung von RNA, DNA und Proteinen erweitert. Alle diese Anwendungen fordern die rasche Erholung der eine erhebliche Anzahl von Zebrafisch-Herz genregulatorischen, Stoffwechsel und andere Veränderungen, die nach dem Tod beginnen zu vermeiden. Erwachsenen Zebrafisch Herzen sind auch zur Untersuchung von Herzstruktur für eine Vielzahl von Mutanten und zur Untersuchung der Herzregeneration erforderlich. Jedoch ist die herkömmliche Zebrabärbling Herz Dissektion langsam und schwierig und erfordert Spezialwerkzeuge, so dass großflächige Dissektion erwachsenen Zebrafisch Herzen mühsam. Traditionelle Verfahren bergen auch das Risiko einer Beschädigung des Herzens während der Präparation. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation der erwachsenen Zebrafisch Herzen, schnell, reproduzierbar ist, und bewahrt Herzen Architektur. Außerdem funktioniert diese Methode nicht verlangen Spezialwerkzeugen, ist schmerzfrei für den Zebrafisch,kann auf frischem oder feste Proben durchgeführt werden und kann an Zebrafischen im Alter von 1 Monat alt durchgeführt werden. Die beschriebene Vorgehensweise erweitert die Verwendung von erwachsenen Zebrafisch für Herz-Kreislauf-Forschung.
Protocol
HINWEIS: Achten Sie stets darauf, dass IACUC oder Ethikkommission die Genehmigung ist an Ort und Stelle vor dem Beginn einer Versuchsdurchführung mit Zebrafisch sein.
1. Bereiten Sie Reagenzien und Setup
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen. Finden Sie die Rezepte für alle diese Lösungen in Standard Zebrafisch Handbücher 10.
- 500 ml Wasser Egg
- 200 ml 0,03% Tricaine in Egg Wasser
- 100 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
- RBC Lysis Buffer (optional)
- Zielpuffer der Wahl (Fixiermittel Trizol, PBS, etc.) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis
HINWEIS: Fixativ und Trizol sind giftig, wenn sie in Kontakt mit der Haut kommen. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit diesen Stoffen.
- Bereiten Dissektion Setup:
- Stellen Sie den Schwanenhals-Lichtquelle über das Binokular. Setzen Sie den Deckel eines 9 cm Petrischale auf dem Binokular Bühne, und gießen Sie eine dünne Schicht von 1 × PBS iner (der Deckel verwendet wird, weil die Schale selbst ist zu tief für eine einfache Zerlegung).
- Legen Sie die Petrischale selbst (nicht der Deckel) auf der Arbeitsplatte in der Nähe des Binokular und gießen Sie etwa 15 ml 1x PBS darin. Verwenden Sie diese Option, um das Herz nach der Sektion zu waschen. Alternativ können Sie RBC Lysis Buffer.
- Ort Rasierklinge zwei Zangenpaaren, Mikroscheren (optional) und eine Transferpipette neben dem Mikroskop. Besorgen Sie sich einen Behälter mit Eis, wenn Euthanasie durch schnelles Abkühlen gewählt wird.
- Gießen 200 ml von 0,03% Tricaine in Egg Wasser in einen 250 ml Glasbecher, wenn Euthanasie durch Tricaine gewählt wird. Bereiten Sie eine kleine Biohazard Sack zur Dekontaminierung von Zebrafisch-Kadaver.
2. Bereiten Sie Zebrafisch
- Für feste Fisch, bringen festen Fisch, in PBS gespült, mit dem Mikroskop-Setup.
- Euthanize die ganze erwachsenen Zebrafisch durch schnelles Abkühlen mit Eis für> 10 min.
- Verwenden einer Pinzette, um ein Loch in der Haut über das Bauchfell machen(Vom Herzen), um das Eindringen von Fixiermittel zu unterstützen, und sie dann in 4% Paraformaldehyd in Fix-Puffer 10 für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C.
- Alternativ für frischen Fisch, statt Fisch in einem kleinen Vorratstank eingeschläfert werden und bringen auf den Mikroskopaufbau. Je nach Fisch Protokoll der individuellen Einrichtung und die nachgelagerten Anwendungen für die seziert Fischherzen, betäuben Fisch mit Tricaine oder einschläfern durch schnelles Abkühlen, bevor Enthauptung.
- Um Eis zu verwenden, nehmen Sie einen Fisch mit dem Fisch net und in Eiswasser, bis der Fisch nicht mehr bewegt, ca. 5 min.
- Alternativ zu Tricaine verwenden, nehmen Sie einen Fisch mit dem Fischnetz und in das Becherglas von der Lösung, bis Kiemenbewegungen zu stoppen.
- Holen schnell auf die eingeschläfert Fisch durch seine Schwanzflosse und legen Sie sie auf die Seite, in der Petrischale Abdeckung, die mit 1x PBS gefüllt war. Verwenden Sie die Pinzette, um eine Brustflosse mit einer Hand zu heben, während der Verwendung der razor Klinge, um die Fische mit der anderen Hand zu köpfen, nur zur Befestigung der Brustflosse (1A) posterior. Führen Sie diesen Schritt, indem Sie entweder dem Mikroskop oder durch direkt Visualisierung der Fisch auf dem Mikroskoptisch.
HINWEIS: frisch getöteten Fischen noch nach Enthauptung bluten.
Abbildung 1: Zebrafisch erwachsenen Herzen Dissektion nutzt Zebrafisch anatomischen Landmarken. (A), um die Fische zu enthaupten, heben Sie den Brustflosse mit einer Pinzette und mit einem scharfen Rasierklinge entlang der rot gestrichelten Linie, wie dargestellt. (B), um die Fischkopf zu stabilisieren, legen Sie die Zinken der Zange im Fischmaul während der andere Zinken liegt über das Auge, und drehen Sie den Fischkopf, so dass die Bauchseite ist und die beiden Zinken der Zange sind gegen den Boden der Petrischale stabil. (C) Verwenden Sie die kostenlose forceps, um die Befestigung der Kiemendeckel (Pfeil). (D) Deinstallations diese geschnitten, als weißer Struktur mit einem rosa Streifen bezeichnet Lumen Blut (Pfeil) zu erkennen ist die dorsale Aorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
3. Präparieren Sie die Herz
- Visualisieren Sie die Fischkopf unter dem Mikroskop. Mit einer Pinzette, beruhigen die Fischkopf, indem Sie eine Zinken der Zange im Fischmaul, durch das Gehirn, während die andere Zinke ist außerhalb des Kopfes, über das Auge (Abbildung 1B). Sicherzustellen, dass beide Zinken der Zange sind stabil gegen den Boden der Petrischale. Halten der Fischkopf auf diese Weise, sollte seine Bauchseite nach oben zeigen.
- Mit der anderen Hand verwendet man die zweite Pinzette zum ventralen Befestigung des Verschlusses an dem Körper (Pfeil, 1C) geschnitten. Heben Sie diese leicht mit der Pinzette, die dØrsal Aorta wird unterhalb als weißer Aufbau mit einem roten Streifen von Blut in den Aortenlumen (Pfeil, 1D) angezeigt. Schneiden Sie die dorsale Aorta mit der Zange durch Zusammendrücken der Aorta und nach oben ziehen; alternativ können Sie Mikroschere, um die dorsale Aorta geschnitten.
- Verwenden Sie nun die zweite Zange, um die Brustflosse von seiner Basis zu erfassen, einschließlich des Körpers Knorpel an der Basis der Flosse, und heben Sie diese ab. Wiederholen Sie mit der anderen Brustflosse. Gelegentlich kommt das Herz mit den Brustflossen, so prüfen, diese Stücke um sicherzustellen, dass das Herz nicht vor dem Wegwerfen ihnen verbunden.
HINWEIS: An dieser Stelle sollte das Herz sichtbar, noch intakt und mit dem restlichen Fischkopf verbunden sein (obwohl es gelegentlich kommt mit den Brustflossen). Das Herz kann durch seine Form, seine rosa Farbe, und sein Wesen durch pigmentierte Herzbeutel umgeben identifiziert werden. Da die Euthanasie der Fische wird schnell ausgeführt wird, können frisch getöteten Fischen Herz noch schlägt slo seinWLY. - Lassen Sie den Fischkopf mit der ersten Zange, so dass beide Hände halten Pinzette und sind kostenlos. Benutzen Sie beide Zangen, um das Herz von der Herzbeutel zu necken. Fassen Sie die Herzen durch den Rest der dorsalen Aorta während die restlichen Herzbeutel weggezogen.
HINWEIS: Ob fest oder frisch, ist robust leichtes Ziehen, während das umgebende Bindegewebe ist brüchig das Herz. Daher kann jeder umgebenden Herzbeutelgewebe weg mit das Herz intakt bleibt seziert werden. - Entsorgen Sie die übrig gebliebenen Fisch Karkasse in der biohazard Tasche.
4. Bereiten Sie den Inneres für Downstream-Anwendungen
- Mit einer Pinzette, fassen Sie die Herzen durch den Rand der dorsalen Aorta / Bulbus arteriosus und legen Sie die Herzen in der frischen Schüssel mit 1x PBS. Alternativ können Sie einen Transferpipette. Bewegen Sie die Herzen in der PBS und zurück zu 10-fach zu wie möglich weg zu waschen, so viel Blut.
- Für Anwendungen, bei denen es wichtig ist, alle possib entfernenle Blutkörperchen, Waschen in einer 9 cm Petrischale mit 15 ml RBC Lysispuffer anstelle von PBS mit derselben hin- und herbewegt. Wenn die Erhaltung der Struktur des Herzens ist nicht wichtig für die nachgeschaltete Anwendung (zB, was RNA), mit den Zangen oder Mikroscheren, um die Herzhohlraum zu öffnen und zu erleichtern Abspülen von Blutzellen.
- Für Anwendungen, bei denen separate Herzkammern gewünscht werden, verwenden Pinzette oder Mikroschere, um den Bulbus arteriosus, Vorhof und Herzkammer voneinander zu sezieren.
- Übertragen Sie das Herz, oder getrennte Kammern, in die Zielpuffer auf Eis.
HINWEIS: Gemeinsame Ziele sind Puffer für Zelldissoziation, 4% Paraformaldehyd oder Trizol.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Verfahrens kann ein Erwachsener Zebrabärbling Herz in weniger als 1 min präpariert werden, im Vergleich zu über 5 min mit traditionellen Methoden 8. Herz seziert mit dieser Methode sind zuverlässig intakt (2A), während die traditionellen Methoden 8 erfordern Schneiden blindlings in den Herzbeutel und damit häufig Beschädigung oder Verlust von Atrium oder Bulbus arteriosus (2B) verursachen. Herz präpariert behalten ihre strukturelle Integrität und sind geeignet für die Histologie (2C), Elektronenmikroskopie (2D), wie auch für Anwendungen, bei denen das Herz dissoziiert oder pulverisiert. In unseren Händen, von einer Dissektion von 50 Herzen im Laufe einer Woche Experimente, 50 Herzen wurden strukturell intakt erhalten. Wir brachten auch diese Technik, um einem Kollegen im Labor, die keine Erfahrung mit Zebrafisch Dissektion hatte. 9 von 9 Herzen durch den Anfänger Kollegen seziert wurden auch strukturell intakt. Diese Dissektion Methode eignet sich für Jugendliche, die älter als 1 Monat alt, und für Erwachsene jeden Alters.
Abbildung 2. Dissected Herzen sind intakt und halten architektonische Integrität. (A) in weniger als 1 min, einer erwachsenen Zebrafisch-Herz mit einer intakten Atrium (A), Ventrikel (V) und Bulbus arteriosus (BA) können aus einer eingeschläfert Fisch zerlegt werden. (B) Traditionelle erwachsenen Zebrafisch Herzen Dissektionen länger dauern und auch dann, wenn darauf geachtet wird, führen Sie das Risiko einer Beschädigung. Hier ist nur die Herzkammer intakt. (C) Ein Herz aus einer Tg (myl7 dsRed) ausgewachsene Fische seziert gepflegt seine strukturelle Integrität für die Verwendung in der Histologie. Das Atrium (A), Ventrikel (V) und Bulbus arteriosus (BA) zu sehen sind, und die noch kleineren Strukturen wie der AV-Ventil (AV, Pfeil) und der Ausflusstrakt (OFT, Pfeil) intakt sind. (D) </ Strong>, Elektronenmikroskopie eines seziert Wildtyp erwachsenen Herzens zeigt, dass Sarkomeren bleiben die Dissektion Prozess unbeschädigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Während Verfahren zum Präparieren des erwachsenen Zebrafisch Herzen beschrieben worden sind, sind diese Methoden zeitaufwendig und häufig verursacht beim Präparieren von Schädigungen des Herzens. Experimente, wo eine große Anzahl von erwachsenen Herzen erforderlich sein, führen und / oder wenn die Vermeidung von Abbau von Herzgewebe ist wichtig für die Downstream-Anwendungen ist die Zeit unter Verwendung traditioneller Techniken Dissektion erforderlich unerschwinglich. Ebenso ist reproduzierbar erhalten unbeschädigt, intakt Herzen wichtig für Studie der Herzstruktur und für immunhistochemische und Mikroskopieverfahren. Wir haben festgestellt, dass selbst in den Händen von Anfängern, 100% der Herzen seziert wurden strukturell intakt gewonnen. Insgesamt ist das Verfahren zur erwachsenen Herzen Dissektion hier präsentierten stellt einen Fortschritt in der Technik, die die Verwendung von ausgewachsenen Zebrafisch für eine Vielzahl von gegenwärtigen und zukünftigen Anwendungen, einschließlich der Verwendung in Herzverletzung und Regenerationsversuche ausdehnt.
Es gibt mehrere wichtige Schritte wnnerhalb dieses Protokoll. Erstens, je nach Experiment, bei denen die Zebrafisch Herzen erforderlich sind, ist es wichtig, die Herzen soviel wie möglich von den Blutzellen zu spülen. Beispiele von Versuchen, die von Blutzellen zu entfernen profitieren würden umfassen Erholung von Herzen für RNA-Seq, in Anwesenheit von Blut werden Genexpressionsprofile zu ändern oder für FACS-Sortierung, wo Blutkörperchen schwer von Herzmuskelzellen zu sortieren. Nachdem der Fisch mit Tricaine oder Eis getötet, ist es wichtig, die Fische schnell zu enthaupten und lassen Blutungen auftreten, zu helfen, befreien den Herzen der überschüssiges Blut. Wenn ein intaktes Herz ist nicht für die geplante Experiment erforderlich ist, kann es hilfreich sein, das Atrium und Ventrikel geschnitten offen, wenn in PBS weiter spülen das Blut. RBC-Lyse-Puffer kann auch anstelle des PBS verwendet werden.
Zweitens, wie oben erwähnt, manchmal kommt das Herz mit einer der Brustflossen nicht bleiben an dem Kopf befestigt. Daher ziehen die Brustflossenunter dem Mikroskop, so dass das Herz kann identifiziert werden. Schließlich, wenn sezieren das Herz vom umgebenden Herzbeutel, versuchen Sie nicht, das Herz selbst zu erfassen; Stattdessen greifen zwei Stücke von Herzbeutel und ziehen sie beide vom Herzen weg, die mehr strukturelle Integrität als die brüchigen Herzbeutel hat. Auf diese Weise können selbst minimale Beschädigung des Herzens zu vermeiden.
Das Herz ist durch seine Form und Kontraktionen leicht erkennbar sein. Als zusätzliche Hilfe bei der Suche nach dem Herzen, kann man ein Herz für ein fluoreszierendes Protein unter einem Fluoreszenz Binokular Ausdruck zu sezieren. Dies ist in der Regel nicht erforderlich, kann aber für Anfänger und / oder zum Sezieren von sehr kleinen Herzen nützlich sein.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass das Auftrennen Herzen von kleinen Fischen, also jünger als 3 Wochen alt, ist schwierig; Andere Techniken zur Larven Dissektionen 9 ausgelegt. Auch, während es einfach ist, den Bulbus a sezierenrteriosus, Vorhof und Herzkammer von einander, ist es nicht möglich, die Atrioventrikularklappe eigener sezieren. Das Ventil bleibt an den Ventrikel in den meisten Fällen verbunden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
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