Abstract
Utilisation du système modèle pour étudier le développement du poisson zèbre, la régénération et la maladie est l'expansion vers l'utilisation de cœurs adultes pour la dissociation cellulaire et la purification de l'ARN, l'ADN et les protéines. Toutes ces applications exigent la reprise rapide d'un grand nombre de cœurs de poisson zèbre pour éviter gène régulateur, métabolique, et d'autres changements qui commencent après la mort. Coeurs poisson zèbre adultes sont également nécessaires pour étudier la structure de coeur pour une variété de mutants et pour étudier la régénération cardiaque. Cependant, la dissection traditionnelle cardiaque poisson zèbre est lente et difficile et nécessite des outils spécialisés, ce qui rend la dissection grande échelle des cœurs de poisson zèbre adultes fastidieux. Les méthodes traditionnelles abritent également le risque d'endommager le coeur lors de la dissection. Ici, nous décrivons une méthode pour la dissection des cœurs de poisson zèbre adultes qui est rapide, reproductible, et préserve l'architecture cardiaque. En outre, cette méthode ne nécessite pas d'outils spécialisés, est indolore pour le poisson-zèbre,peut être effectuée sur des échantillons frais ou fixes, et peut être effectuée sur le poisson zèbre dès l'âge de un mois. L'approche décrite élargit l'utilisation de poisson zèbre adulte pour la recherche cardiovasculaire.
Protocol
REMARQUE: Assurez-vous toujours que l'approbation IACUC ou comité d'éthique est en place avant de commencer toute procédure expérimentale utilisant le poisson zèbre.
1. Préparer les réactifs et configuration
- Préparer les solutions suivantes. Trouver les recettes pour l'ensemble de ces solutions dans les manuels de poisson zèbre standards 10.
- 500 ml d'eau Egg
- 200 ml de 0,03% tricaïne à Egg eau
- 1x 100 ml de tampon phosphate salin (PBS)
- RBC tampon de lyse (facultatif)
- tampon de destination de choix (fixateur, Trizol, PBS, etc.) dans un tube de 1,5 ml sur la glace
REMARQUE: fixateur et Trizol sont toxiques si elles entrent en contact avec la peau. Porter des gants lors de la manipulation de ces substances.
- Préparer la configuration de dissection:
- Placez la source de lumière à col de cygne sur le microscope de dissection. Placez le couvercle d'une boîte de Pétri de 9 cm sur la scène de dissection microscope, et verser une fine couche de 1x PBS dans(le couvercle est utilisé parce que le plat lui-même est trop profonde pour une dissection facile).
- Placez la boîte de Pétri lui-même (pas le couvercle) sur le comptoir près du microscope à dissection et versez environ 15 ml de PBS 1x en elle. Utilisez cette solution pour laver le cœur après dissection. Vous pouvez également utiliser tampon de lyse RBC.
- Lieu lame de rasoir, deux paires de pinces, microciseaux (facultatif), et une pipette de transfert à côté du microscope. Obtenir un conteneur de glace si l'euthanasie d'un refroidissement rapide est choisie.
- Verser 200 ml de 0,03% tricaïne à Egg eau dans un bécher de 250 ml en verre si l'euthanasie par tricaïne est choisi. Préparer un petit sac de risque biologique pour l'élimination des carcasses de poisson zèbre.
2. Préparer le poisson zèbre
- Pour les poissons fixe, apporter du poisson fixe, rincées dans du PBS, à la configuration du microscope.
- Euthanasier tout le poisson zèbre adulte par un refroidissement rapide avec de la glace pour> 10 min.
- Utilisez une pince à faire un trou dans la peau sur le péritoine(Du coeur) pour faciliter la pénétration du fixateur, puis mettez-les dans 4% de paraformaldehyde dans Fix Buffer 10 pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C.
- Sinon, pour le poisson frais, le lieu poisson pour être euthanasié dans un petit réservoir de retenue et apporter à la configuration du microscope. Selon le protocole de poissons de l'installation individuelle et les utilisations en aval pour les cœurs de poissons disséqués, anesthésier les poissons avec de tricaïne ou euthanasier par un refroidissement rapide avant la décapitation.
- Pour utiliser de la glace, ramasser un poisson avec le filet de pêche et les placer dans de l'eau glacée jusqu'à ce que le poisson se arrête de bouger, environ 5 min.
- Sinon, pour utiliser tricaïne, ramasser un poisson avec le filet de pêche et le lieu dans le bécher de la solution jusqu'à l'arrêt des mouvements maillants.
- Prendre rapidement le poisson euthanasié par sa nageoire caudale et le poser sur son côté dans le plat couvercle Petri qui a été rempli de PBS 1x. Utilisez la pince pour soulever une nageoire pectorale avec une main, tout en utilisant le razor lame pour décapiter le poisson avec l'autre main, juste en arrière de l'attachement de la nageoire pectorale (figure 1A). Effectuez cette étape soit en regardant par le microscope ou simplement en visualisant directement le poisson sur la platine du microscope.
REMARQUE: poissons fraîchement euthanasiés seront toujours saigner après la décapitation.
Figure 1. poisson zèbre dissection cardiaque adulte utilise des repères anatomiques de poisson zèbre. (A) à décapiter le poisson, soulevez la nageoire pectorale avec une pince et d'utiliser une lame de rasoir propre forte le long de la ligne pointillée rouge comme indiqué. (B) Pour stabiliser la tête du poisson, placer une dent de la pince dans la bouche de poisson tout l'autre dents se trouve à travers l'œil, puis tournez la tête du poisson afin que la surface ventrale est en place et les deux dents de la pince sont stables contre le fond de la boîte de Pétri. (C) Utilisez le forc gratuitementeps pour couper l'attachement de l'opercule (flèche). (D) de levage cela, l'aorte dorsale est visible comme une structure blanche avec une bande rose dénotant sang luminale (flèche). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
3. Disséquer le Cœur
- Visualisez la tête de poisson sous le microscope. Avec une pince, stabiliser la tête du poisson en plaçant une dent de la pince dans la bouche de poisson, à travers le cerveau, tandis que l'autre dent est en dehors de la tête, dans l'œil (figure 1B). Vérifiez que les deux dents de la pince sont stables contre le fond de la boîte de Pétri. Tenir la tête de poisson de cette façon, sa surface ventrale doit être orientée vers le haut.
- Avec l'autre main, utilisez les secondes pinces pour couper le attache ventral de l'opercule au corps (flèche, Figure 1C). Levage cette légèrement avec la pince, le dOrsal aorte apparaîtra sous forme d'une structure blanche avec une bande rouge de sang dans la lumière aortique (flèche, figure 1D). Couper l'aorte dorsale avec la pince en pinçant l'aorte et tirant vers le haut; alternativement, utiliser microciseaux pour couper l'aorte dorsale.
- Maintenant, utilisez les secondes pince pour saisir la nageoire pectorale de sa base, y compris le cartilage du corps à la base de la nageoire, et soulevez cette option. Répétez avec l'autre nageoire pectorale. Parfois, le cœur sort avec les nageoires pectorales, afin d'examiner ces pièces pour se assurer que le cœur ne est pas fixé avant de les jeter.
NOTE: A ce stade, le cœur doit être visible, encore intacte et relié à la tête de poisson restant (bien que parfois il se détache avec les nageoires pectorales). Le cœur peut être identifié par sa forme, sa couleur rose, et son être entouré par péricarde pigmentée. Parce que l'euthanasie du poisson est effectué rapidement, coeurs de poissons fraîchement euthanasiés peuvent encore être battu slovers l 'ouest. - Lâchez la tête du poisson avec les premiers forceps, afin que les deux mains tiennent pince et sont gratuits. Utilisez les deux pinces pour taquiner le coeur loin du péricarde. Saisissez le cœur par le reste de l'aorte dorsale tandis que le péricarde restante est retirée.
NOTE: Que fixe ou frais, le cœur est robuste pour tirer douce tandis que le tissu conjonctif environnant est plus friable. Par conséquent, ne importe quel tissu péricardique entourant peut être disséquée avec le cœur reste intacte. - Jeter la carcasse de restes de poisson dans le sac pour matières contaminées.
4. Préparer le coeur pour des applications en aval
- En utilisant des pinces, saisir le cœur par le bord de la aorte dorsale / bulbe artériel et placez le coeur dans le plat frais de 1x PBS. Vous pouvez également utiliser une pipette de transfert. Déplacez le coeur avant et en arrière dans le PBS environ 10x pour laver autant de sang que possible.
- Pour les applications où il est important d'éliminer toute possibLe globules, laver dans une boîte de Petri de 9 cm avec 15 ml de tampon de lyse RBC au lieu de PBS, en utilisant le même mouvement de va-et-vient. Si la préservation de la structure du coeur ne est pas importante pour l'application en aval (par exemple, ce qui rend l'ARN), utiliser la pince pour ouvrir ou microciseaux la cavité cardiaque et de faciliter le rinçage loin des cellules sanguines.
- Pour les applications dans lesquelles cavités cardiaques différents sont désirés, utiliser une pince à disséquer ou microciseaux le bulbe artériel, l'atrium et le ventricule à l'écart l'une de l'autre.
- Transférer le cœur, ou des chambres séparées, à la mémoire tampon de destination sur de la glace.
NOTE: destinations communs comprennent des tampons pour la dissociation cellulaire, 4% de paraformaldéhyde ou Trizol.
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Representative Results
En utilisant cette méthode, un poisson zèbre cœur adulte peut être disséqué en moins de 1 min, par rapport à plus de 5 min selon la méthode traditionnelle 8. Coeurs disséqués en utilisant cette méthode sont fiable intacte (figure 2A), alors que les méthodes traditionnelles nécessitent huit coupe aveuglément dans le péricarde et donc souvent causer des dommages ou la perte de l'atrium ou bulbe artériel (figure 2B). Coeurs disséqués conservent leur intégrité structurale et conviennent pour l'histologie (figure 2C), la microscopie électronique (figure 2D), ainsi que pour des applications où le cœur est dissocié ou pulvérisé. Dans nos mains, à partir d'une dissection de 50 coeurs au cours des expériences d'une semaine, 50 coeurs ont été obtenues structurellement intact. Nous avons aussi appris cette technique à un collègue dans le laboratoire qui ne avait aucune expérience avec la dissection du poisson zèbre. 9 sur 9 cœurs disséqués par le débutant collègue étaient également structurellement intacte. Cette méthode de dissection est adapté pour les mineurs âgés de plus de 1 mois, et pour les adultes de tous âges.
Figure 2. disséqué coeurs sont intacts et maintenir l'intégrité architecturale. (A) en moins de 1 min, un cœur poisson zèbre adulte avec un atrium intacte (A), le ventricule (V), et bulbe artériel (BA) peut être disséqué d'un poisson euthanasié. (B) adultes traditionnel poisson zèbre dissections cardiaques prennent plus de temps et même quand on prend soin, courir le risque de dommages. Ici, seul le ventricule est intact. (C) Un coeur disséqué d'une Tg (myl7 DsRed) poissons adultes a maintenu son intégrité structurelle pour une utilisation dans l'histologie. L'atrium (A), le ventricule (V), et bulbe artériel (BA) sont vus, et même plus petites structures comme la valve auriculo-ventriculaire (AV, flèche) et les voies de sortie (OFT, flèche) sont intacts. (D) </ Strong> La microscopie électronique d'un coeur adulte de type sauvage disséqué montre que sarcomères ne sont pas endommagées par le processus de dissection. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien que les méthodes pour disséquer le cœur de poisson zèbre adulte ont été décrits, ces méthodes étaient de temps et souvent causé des dommages au cœur lors de la dissection. Pour effectuer des expériences où un grand nombre de coeurs adultes peuvent être nécessaires, et / ou lorsque éviter la dégradation du tissu cardiaque est important pour les applications en aval, le temps nécessaire en utilisant des techniques de dissection traditionnels est prohibitif. De même, l'obtention reproductible en bon état, coeurs intacts est important pour l'étude de la structure du cœur et des méthodes d'immunohistochimie et microscopie. Nous avons constaté que, même dans les mains des débutants, 100% des cœurs disséqués ont été récupérés structurellement intact. Dans l'ensemble, la méthode de dissection du cœur adulte présenté ici présente une avance technique qui se développe dans l'utilisation de poisson zèbre adulte pour diverses applications actuelles et futures, y compris une utilisation dans une lésion cardiaque et expériences de régénération.
Il ya plusieurs étapes critiques wurant ce protocole. Tout d'abord, en fonction de l'expérience dont les coeurs de poisson zèbre sont nécessaires, il est important de rincer cœurs autant que possible à partir de cellules sanguines. Exemples d'expériences qui pourraient bénéficier de l'élimination des cellules de sang comprennent la récupération des cœurs pour l'ARN-Seq, où la présence de sang va modifier les profils d'expression génique, ou pour FACS de tri, où les cellules sanguines peuvent être difficiles à trier des cellules myocardiques. Après le poisson est euthanasié avec tricaïne ou de la glace, il est important de décapiter le poisson rapidement et permettre à des saignements de se produire pour aider à débarrasser le cœur de l'excès de sang. Si un cœur intact ne est pas requis pour l'expérience planifié, il peut être utile de réduire l'oreillette et du ventricule lorsque ouvert dans du PBS pour rincer le sang supplémentaire. Tampon de lyse RBC peut également être utilisé au lieu de PBS.
En second lieu, comme mentionné ci-dessus, de temps en temps le cœur se détache avec une des nageoires pectorales, plutôt que de rester fixé sur la tête. Par conséquent, tirer les nageoires pectoralesoff sous le microscope de telle sorte que le coeur peut être identifié. Enfin, en disséquant le coeur loin du péricarde entourant, essayez de ne pas saisir le cœur lui-même; à la place, saisir deux morceaux de péricarde et tirez les deux loin du coeur, qui a une plus grande intégrité structurelle que le péricarde friable. De cette manière, même des dommages minimes pour le cœur peut être évitée.
Le cœur doit être facilement identifiable par sa forme et contractions. Comme une aide supplémentaire à trouver le cœur, on peut disséquer un coeur exprimant une protéine fluorescente sous un microscope de fluorescence de dissection. Ce ne est généralement pas nécessaire mais peut être utile pour les débutants et / ou pour des dissections de très petits coeurs.
Une des limites de cette technique est que la dissection cœur de petits poissons, ce est à dire, âgé de moins de trois semaines, est difficile; d'autres techniques ont été conçus pour dissections larvaires neuf. En outre, se il est facile à disséquer un bulberteriosus, atrium, et le ventricule de l'autre, il ne est pas possible de disséquer la valve auriculo-ventriculaire de sa propre. La vanne reste attachée au ventricule dans la plupart des cas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
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