Abstract
A utilização do sistema modelo para estudar o desenvolvimento do peixe-zebra, a regeneração, e a doença está a expandir para utilização de coração do adulto para dissociação de células e purificação de RNA, DNA e proteínas. Todas estas aplicações exigem a rápida recuperação de um número significativo de corações de peixe-zebra para evitar gene regulador, metabólicas e outras mudanças que começam após a morte. Corações de peixe-zebra adultos são também necessários para estudar a estrutura do coração para uma variedade de mutantes e para estudar a regeneração cardíaca. No entanto, a dissecção do coração do peixe-zebra tradicional é lento e difícil e requer ferramentas especializadas, tornando dissecção em larga escala de corações de peixe-zebra adultos tedioso. Os métodos tradicionais também abrigam o risco de danificar o coração durante a dissecção. Aqui, descrevemos um método para dissecção de corações peixe-zebra adulto que é rápido, reprodutível, e preserva a arquitetura coração. Além disso, este método não requer ferramentas especializadas, é indolor para o peixe-zebra,pode ser realizada em amostras frescas ou fixos, e pode ser realizado em peixes-zebra tão jovens como um mês de idade. A abordagem descrita amplia o uso de peixe-zebra adulto para a investigação cardiovascular.
Protocol
NOTA: Certifique-se sempre de que a aprovação IACUC ou comitê de ética está no lugar antes de iniciar qualquer procedimento experimental usando peixe-zebra.
1. Prepare os reagentes e configuração
- Prepare as seguintes soluções. Encontrar as receitas para todas estas soluções em manuais de peixe-zebra padrão de 10.
- 500 ml de água ovo
- 200 ml de 0,03% em tricaina ovo Água
- 1x 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS)
- Tampão de lise de RBC (opcional)
- Destino tampão de escolha (fixador, Trizol, PBS, etc.) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo
NOTA: fixador e Trizol são tóxicos se entrarem em contacto com a pele. Usar luvas ao manusear estas substâncias.
- Prepare configuração dissecção:
- Posicione a fonte de luz gooseneck sobre o microscópio de dissecação. Colocar a tampa de uma placa de Petri de 9 centímetros na fase de microscópio de dissecação, e verter uma fina camada de fosfato em 1x-lo (a tampa é usada porque o prato em si é muito profunda para a dissecção fácil).
- Coloque a própria placa de Petri (não a tampa) na bancada perto do escopo de dissecação e despeje cerca de 15 ml de PBS 1x nele. Use-o para lavar o coração após a dissecação. Em alternativa, utilizar um tampão de lise de RBC.
- Lâmina de barbear lugar, dois pares de pinças, microtesouras (opcional), e uma pipeta de transferência ao lado do microscópio. Obter um recipiente de gelo, se a eutanásia de um arrefecimento rápido é escolhido.
- Despeje 200 ml de 0,03% tricaina em Egg água em um copo de vidro de 250 ml, se a eutanásia por tricaina é escolhido. Prepare um pequeno saco de risco biológico para eliminação de carcaças de peixe-zebra.
2. Prepare Zebrafish
- Para peixes fixo, trazer peixe fixo, lavadas em PBS, para a configuração do microscópio.
- Eutanásia todo o peixe-zebra adulto de um arrefecimento rápido com gelo durante> 10 min.
- Use uma pinça para fazer um furo na pele sobre o peritoneu(Longe do coração) para auxiliar a penetração do fixador, e, em seguida, colocá-los em 4% de paraformaldeído em tampão de Fix 10 durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C.
- Alternativamente, para o peixe fresco, peixe local para ser sacrificado em um pequeno tanque de retenção e trazer para a configuração do microscópio. Dependendo do protocolo de peixes da instalação individual e os usos a jusante para os corações de peixes dissecados, anestesiar peixe com tricaina ou eutanásia de um arrefecimento rápido antes de decapitação.
- Para usar o gelo, pegar um peixe com a rede de pesca e coloque em água gelada até que o peixe pára de se mover, cerca de 5 min.
- Como alternativa, para usar tricaina, pegar um peixe com a rede de pesca e coloque no copo da solução até movimentos de emalhar parar.
- Rapidamente pegar os peixes mortos por sua barbatana caudal e colocá-lo em seu lado na tampa placa de Petri que foi preenchido com 1x PBS. Use a pinça para levantar uma nadadeira peitoral com uma mão, enquanto estiver usando o razolâmina r para decapitar o peixe com o outro lado, apenas posterior à fixação da barbatana peitoral (Figura 1A). Execute esta etapa ou olhando através do microscópio ou apenas visualizar diretamente os peixes no palco microscópio.
NOTA: Peixes recentemente sacrificados ainda vai sangrar após a decapitação.
Figura 1. Zebrafish dissecção coração adulto utiliza marcos anatômicos de peixe-zebra. (A) para decapitar o peixe, levante a nadadeira peitoral com uma pinça e usar uma lâmina limpa afiada ao longo da linha pontilhada vermelha, como mostrado. (B) Para firmar a cabeça de peixe, coloque um dente do fórceps na boca dos peixes enquanto o outro tine fica do outro lado do olho, e, em seguida, virar a cabeça de peixe de modo que a superfície ventral é para cima e as duas pontas da pinça são estáveis contra a parte inferior da placa de Petri. (C) Use a forc livreeps para cortar a ligação do opérculo (seta). (D) elevação isso, a aorta dorsal é visível como uma estrutura branca com uma listra rosa denotando sangue luminal (seta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Dissecar o Coração
- Visualize a cabeça de peixe sob o microscópio. Com uma pinça, estabilizar a cabeça de peixe, colocando um dente da pinça na boca de peixe, através do cérebro, enquanto que o outro dente é fora da cabeça, através do olho (Figura 1B). Certifique-se de ambas as garras de pinça são estáveis contra o fundo do prato de petri. Segurando a cabeça de peixe desta forma, a sua superfície ventral deve estar voltado para cima.
- Com a outra mão, utilizar a segunda pinça para cortar a ligação ventral do opérculo ao corpo (seta, Figura 1C). Levantar esta ligeiramente com a pinça, o dØrsal aorta aparece por baixo como uma estrutura branca com uma listra vermelha de sangue na luz aórtica (seta, Figura 1D). Corte as aorta dorsal, com a pinça por beliscar a aorta e puxando para cima; em alternativa, usar microtesouras para cortar a aorta dorsal.
- Agora, use a segunda pinça para agarrar a barbatana peitoral de sua base, incluindo a cartilagem corpo, na base da nadadeira, e levante esta off. Repita com a outra barbatana peitoral. Ocasionalmente, o coração sai com as nadadeiras peitorais, então examinar estas peças para certificar-se o coração não está conectado antes de descartá-los.
NOTA: Neste ponto, o coração deve estar visível, ainda intacto e conectado à cabeça de peixe restante (embora ocasionalmente ele sai com as nadadeiras peitorais). O coração pode ser identificado pela sua forma, a sua cor-de-rosa, e os seus estar rodeado por pericárdio pigmentada. Porque a eutanásia dos peixes é realizada rapidamente, corações peixe acabado de eutanásia pode ainda estar batendo slowly. - Deixe de lado a cabeça de peixe com os primeiros fórceps, para que ambas as mãos segurando uma pinça e são gratuitas. Use as duas pinças de provocar o coração longe do pericárdio. Agarrar o coração pelo restante da aorta dorsal, enquanto o restante pericárdio é puxado para fora.
NOTA: Se fixa ou fresco, o coração é robusto a suave puxando enquanto o tecido conjuntivo circundante é mais friável. Portanto, qualquer tecido de pericárdio circundante pode ser dissecado com o coração restante intacto. - Descarte a carcaça de peixe sobra no saco de risco biológico.
4. Prepare o coração para aplicações a jusante
- Utilizando uma pinça, segure o coração pela borda da aorta dorsal / arterial bulbus e colocar o coração no prato fresco de 1x PBS. Em alternativa, utilizar uma pipeta de transferência. Mova o coração e para trás na PBS cerca de 10x para lavar o máximo de sangue possível.
- Para aplicações em que é importante para remover todos possibiliOs glóbulos le, lavar em uma placa de Petri de 9 centímetros, com 15 ml de tampão de lise de RBC em vez de PBS, usando o mesmo movimento de vai-e-vem. Se preservar a estrutura do coração não é importante para a aplicação a jusante (por exemplo, tornando o RNA), usar os fórceps ou microtesouras para abrir a cavidade do coração e facilitar enxaguando de células sanguíneas.
- Para aplicações em que são desejados diferentes câmaras cardíacas, utilize uma pinça ou microtesouras para dissecar o bulbo arterial, átrio, e ventrículo afastados uns dos outros.
- Transferir o coração, ou câmaras separadas, para o buffer de destino em gelo.
NOTA: destinos comuns incluem buffers para dissociação celular, paraformaldeído 4%, ou Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando este método, um peixe-zebra coração adulto pode ser dissecado em menos de 1 minuto, em comparação com mais de 5 min, utilizando métodos tradicionais 8. Corações dissecados utilizando este método são seguramente intacta (Figura 2A), enquanto que os métodos tradicionais requerem 8 cortar cegamente no pericárdio e, portanto, comumente causar dano ou perda do átrio ou bulbus arterial (Figura 2B). Corações dissecados manter a sua integridade estrutural e são adequados para a histologia (Figura 2C), microscopia electrónica (Figura 2D), bem como para aplicações onde o coração é dissociar ou pulverizados. Nas nossas mãos, a partir de uma dissecção de 50 corações no decurso de experiências de uma semana, a 50 corações foram obtidos estruturalmente intacto. Nós também ensinou essa técnica para um colega no laboratório que não tinha experiência com dissecção peixe-zebra. 9 de 9 corações dissecados pelo colega novato também foram strucestruturalmente intacto. Este método de dissecação é adequado para jovens com mais de 1 mês de idade, e para adultos de todas as idades.
Figura 2. Dissected corações estão intactos e manter a integridade arquitetônica. (A) Em menos de 1 min, um coração peixe-zebra adulto, com um átrio intacta (A), ventrículo (V), e arterial bulbus (BA) pode ser dissecado de um peixe sacrificados. (B) adultos Tradicional dissecções coração de peixe-zebra levar mais tempo e mesmo quando o cuidado é tomado, corre o risco de danos. Aqui, apenas o ventrículo está intacta. (C) Um coração dissecado a partir de uma Tg (myl7 dsRed) peixes adultos manteve a sua integridade estrutural para uso em histologia. O átrio (A), ventrículo (V), e arterial bulbus (BA) são vistos, e estruturas ainda menores, como a válvula atrioventricular (AV, seta) e a via de saída (OFT, seta) estão intactos. (D) </ Strong> A microscopia eletrônica de um coração dissecado adulto do tipo selvagem mostra que sarcômeros ser danificados pelo processo de dissecação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora os métodos para dissecar o coração de adulto peixe-zebra foram descritos, estes métodos foram demorada e normalmente causado dano ao coração durante a dissecção. Para realizar experiências onde pode ser necessário um grande número de coração do adulto, e / ou ao evitar a degradação do tecido do coração é importante para aplicações a jusante, o tempo necessário utilizando técnicas tradicionais de dissecção é proibitivo. Da mesma forma, a obtenção de reprodutível, corações intactos não danificados é importante para o estudo da estrutura do coração e para os métodos de imuno-histoquímica e microscopia. Descobrimos que, mesmo nas mãos de principiantes, 100% dos corações dissecados foram recuperados estruturalmente intacta. Em geral, o método para a dissecção do coração adulto aqui apresentado apresenta um avanço na técnica que se expande a utilização de peixe-zebra adulto para uma variedade de aplicações actuais e futuras, incluindo o uso de lesão cardíaca e experiências de regeneração.
Há vários passos críticos within este protocolo. Em primeiro lugar, dependendo da experiência para os quais são necessárias as corações de peixe-zebra, é importante para enxaguar corações, tanto quanto possível, a partir de células de sangue. Exemplos de experiências que se beneficiariam com a remoção de células do sangue incluem recuperação de corações para o RNA-Seq, onde a presença de sangue irá alterar perfis de expressão gênica, ou para FACS triagem, onde as células do sangue podem ser difíceis de classificar a partir de células do miocárdio. Após o peixe é sacrificado com tricaina ou gelo, é importante para decapitar os peixes rapidamente e permitir a hemorragia ocorrer para ajudar a eliminar o excesso de sangue do coração. Se um coração intacto não é necessária para a experiência planeada, pode ser útil para reduzir a aurícula e no ventrículo aberto quando em PBS para enxaguar mais para fora do sangue. Tampão de lise dos glóbulos vermelhos também podem ser utilizados em vez de PBS.
Em segundo lugar, tal como mencionado acima, ocasionalmente, o coração sai com uma das barbatanas peitorais, em vez de ficar ligado à cabeça. Por isso, puxe as nadadeiras peitoraisfora sob o microscópio de modo a que o coração pode ser identificado. Finalmente, quando dissecando o coração longe de circundante pericárdio, não tente entender o próprio coração; em vez disso, segure dois pedaços de pericárdio e puxá-los tanto para fora do coração, que tem integridade mais estrutural do que o pericárdio friável. Deste modo, até mesmo danos mínimos para o coração pode ser evitada.
O coração deve ser facilmente identificável pela sua forma e contrações. Como uma ajuda adicional em encontrar o coração, pode-se dissecar um coração expressar uma proteína fluorescente sob um microscópio de fluorescência de dissecação. Isso geralmente não é necessário, mas pode ser útil para iniciantes e / ou para dissecções de muito pequenos corações.
Uma limitação desta técnica é que dissecando corações de peixes pequenos, ou seja, menos de 3 semanas de idade, é difícil; outras técnicas foram projetados para dissecções larvais 9. Além disso, embora seja fácil para dissecar o bulbus umrteriosus, átrio, e ventrículo um do outro, não é possível a dissecção da válvula atrioventricular por si próprio. A válvula permanece ligado ao ventrículo, na maioria dos casos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
