Abstract
L'uso del sistema modello per lo studio zebrafish sviluppo, rigenerazione e malattia è espansione verso l'uso di cuori adulti per dissociazione cellulare e purificazione del DNA, RNA e proteine. Tutte queste applicazioni richiedono la rapida ripresa di un numero significativo di cuori zebrafish per evitare gene regolatore, metaboliche, e altri cambiamenti che iniziano dopo la morte. Cuori zebrafish adulti sono necessari anche per lo studio la struttura del cuore per una varietà di mutanti e per studiare la rigenerazione del cuore. Tuttavia, il tradizionale dissezione cuore zebrafish è lento e difficile e richiede strumenti specializzati, facendo su larga scala dissezione dei cuori di zebrafish adulto noioso. I metodi tradizionali porto anche il rischio di danneggiare il cuore durante la dissezione. Qui, si descrive un metodo per la dissezione di cuori di zebrafish adulto che è veloce, riproducibile, e conserva l'architettura del cuore. Inoltre, questo metodo non richiede strumenti specializzati, è indolore per il zebrafish,possono essere eseguite su campioni freschi o fissi, e possono essere eseguite sul pesce zebra giovane come un mese. L'approccio descritto espande l'uso di zebrafish adulto per la ricerca cardiovascolare.
Protocol
NOTA: Accertarsi sempre che l'approvazione IACUC o comitato etico è a posto prima di iniziare qualsiasi procedura sperimentale utilizzando zebrafish.
1. Preparare i reagenti e installazione
- Preparare le seguenti soluzioni. Trova le ricette per tutte queste soluzioni in manuali di zebrafish normali 10.
- 500 ml di acqua Egg
- 200 ml di 0,03% Tricaine a Egg Water
- 100 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS)
- RBC Lysis Buffer (optional)
- Il buffer di destinazione di scelta (fissante, Trizol, PBS, etc.) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga sul ghiaccio
NOTA: fissativo e Trizol sono tossici se entrano in contatto con la pelle. Maneggiare con guanti queste sostanze.
- Preparare l'installazione dissezione:
- Posizionare la sorgente luminosa collo di cigno sul microscopio da dissezione. Mettere il coperchio di un piatto 9 centimetri Petri sul palco microscopio da dissezione, e versare un sottile strato di 1x PBS in(il coperchio è utilizzato perché il piatto stesso è troppo profonda per un facile dissezione).
- Porre la capsula Petri in sé (non il coperchio) sul piano di lavoro in prossimità del campo di applicazione dissezione e versare circa 15 ml di 1x PBS in esso. Usare questo per lavare il cuore dopo la dissezione. In alternativa, utilizzare RBC Lysis Buffer.
- Luogo lametta, due paia di pinze, microscissors (opzionale), e una pipetta di trasferimento accanto al microscopio. Ottenere un contenitore di ghiaccio se viene scelto eutanasia per raffreddamento rapido.
- Versare 200 ml di 0,03% Tricaine a Egg acqua in un bicchiere di vetro da 250 ml se si sceglie l'eutanasia per Tricaine. Preparare una piccola borsa di rischio biologico per lo smaltimento delle carcasse di zebrafish.
2. Preparare Zebrafish
- Per il pesce fissa, portano pesce fisso, sciacquati in PBS, per la configurazione del microscopio.
- Euthanize tutta zebrafish adulto per un rapido raffreddamento con ghiaccio per> 10 min.
- Usare pinze per fare un buco nella pelle sopra il peritoneo(Dal cuore) per favorire la penetrazione di fissativo, e poi metterli in 4% paraformaldeide in Fix Buffer 10 per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
- In alternativa, per il pesce fresco, pesce posto da eutanasia in un piccolo serbatoio e portare alla messa a punto del microscopio. A seconda del protocollo di pesce della singola struttura e gli usi a valle per i cuori dei pesci sezionati, anestetizzare pesce con Tricaine o eutanasia da un raffreddamento rapido prima decapitazione.
- Per usare il ghiaccio, prendere un pesce con la rete di pesce e posto in acqua ghiacciata fino a quando il pesce si ferma, a circa 5 min.
- In alternativa, per usare Tricaine, prendere un pesce con la rete di pesce e posto nel bicchiere della soluzione fino a quando i movimenti delle branchie fermano.
- Prendere rapidamente il pesce eutanasia dal suo pinna caudale e adagiarla su un fianco nel coperchio piatto Petri che era pieno di 1x PBS. Utilizzare le pinze per sollevare un pettorale con una mano, mentre con l'Razolama r per decapitare il pesce con l'altra mano, appena posteriormente al fissaggio della pinna pettorale (Figura 1A). Eseguire questo passaggio sia guardando attraverso il microscopio o semplicemente visualizzare direttamente il pesce sul palco microscopio.
NOTA: Il pesce appena eutanasia saranno ancora sanguinano dopo la decapitazione.
Figura 1. Zebrafish dissezione cuore adulto utilizza punti di repere anatomici zebrafish. (A) di decapitare i pesci, sollevare la pinna pettorale con una pinza e utilizzare una lama di rasoio pulito affilata lungo la linea tratteggiata rossa come mostrato. (B) Per stabilizzare la testa di pesce, mettere un dente della pinza nella bocca del pesce, mentre l'altro dente si trova attraverso l'occhio, e poi girare la testa di pesce in modo che la superficie ventrale è alto e due denti della pinza sono stabili contro il fondo della scatola di Petri. (C) Utilizzare la forc gratuitoeps per tagliare l'attaccamento del opercolo (freccia). (D) Sollevamento questo, l'aorta dorsale è visibile come una struttura bianca con una striscia rosa denota sangue luminale (freccia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Sezionare il Cuore
- Visualizza la testa di pesce sotto il microscopio. Con una pinza, stabilizzare la testa di pesce mettendo una tine della pinza nella bocca di pesce, attraverso il cervello, mentre l'altro dente è al di fuori della testa, attraverso l'occhio (Figura 1B). Garantire entrambi denti della pinza sono costanti contro il fondo della capsula di Petri. Tenendo la testa di pesce in questo modo, la sua superficie ventrale deve essere rivolto verso l'alto.
- Con l'altra mano, utilizzare la seconda pinza per tagliare l'attacco ventrale dell'opercolo al corpo (freccia, Figura 1C). Sollevamento questo un po 'con le pinze, il dOrsal aorta apparirà sotto una struttura bianca con una striscia rossa di sangue nel lume aortico (freccia, Figura 1D). Tagliare le aorta dorsale con la pinza pizzicando l'aorta e tirando verso l'alto; in alternativa, utilizzare microscissors per tagliare l'aorta dorsale.
- Ora, utilizzare la seconda pinza per afferrare la pinna pettorale dalla sua base, compresa la cartilagine corpo alla base della pinna, e sollevare fuori questo. Ripetere con l'altra pinna pettorale. Di tanto in tanto, il cuore esce con le pinne pettorali, quindi esaminare questi pezzi per assicurarsi che il cuore non è collegato prima di scartare.
NOTA: A questo punto, il cuore deve essere visibile, ancora intatta e collegato alla restante testa di pesce (anche se a volte si stacca con le pinne pettorali). Il cuore può essere identificato dalla sua forma, il suo colore rosa, e il suo essere circondato da pericardio pigmentata. Perché l'eutanasia del pesce viene effettuata rapidamente, cuori di pesce fresco eutanasia possono essere ancora battendo sloWLY. - Lasciate andare la testa di pesce con le prime pinze, in modo che entrambe le mani tengono pinze e sono gratuiti. Usare entrambe le pinze per prendere in giro il cuore lontano dal pericardio. Afferrare cuore dal resto dei dell'aorta dorsali mentre il pericardio rimanente viene tirato via.
NOTA: Sia fisso o fresco, il cuore è robusta a leggera trazione mentre il tessuto connettivo circostante è più friabile. Pertanto, qualsiasi tessuto pericardico circostante può essere sezionato via con il cuore rimasta intatta. - Eliminare la carcassa di pesce rimasto nel sacchetto.
4. Preparare il Cuore per applicazioni a valle
- Utilizzando pinze, afferrare il cuore dal bordo della aorta dorsale / bulbo arterioso e mettere il cuore nel piatto fresco di 1x PBS. In alternativa, utilizzare una pipetta di trasferimento. Spostare il cuore avanti e indietro nel PBS circa 10x per lavare via il più sangue possibile.
- Per applicazioni in cui è importante rimuovere tutto possibLe cellule del sangue, lavare in un piatto 9 centimetri Petri con 15 ml RBC Lysis Buffer invece di PBS, utilizzando lo stesso movimento di va e vieni. Se mantenendo la struttura del cuore non è importante per l'applicazione a valle (ad esempio, facendo RNA), utilizzare le pinze o microscissors per aprire la cavità cardiaca e facilitare risciacquo distanza di cellule del sangue.
- Per le applicazioni in cui sono determinanti: camere cardiache separati, utilizzare forcipe o microscissors per sezionare il bulbo arterioso, atrio e il ventricolo uno dall'altro.
- Trasferire il cuore o camere separate, al buffer di destinazione su ghiaccio.
NOTA: destinazioni più comuni includono buffer per dissociazione cellulare, 4% paraformaldeide, o Trizol.
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Representative Results
Usando questo metodo, un cuore zebrafish adulto può essere sezionato in meno di 1 minuto, a fronte di oltre 5 min con metodi tradizionali 8. Hearts sezionati con questo metodo sono affidabile intatto (figura 2A), mentre i metodi tradizionali richiedono 8 tagliando alla cieca in pericardio e quindi comunemente causare danni o la perdita dell'atrio o bulbo arterioso (Figura 2B). Cuori sezionato mantengono la loro integrità strutturale e sono adatti per l'istologia (Figura 2C), microscopia elettronica (Figura 2D), nonché per applicazioni in cui il cuore è dissociata o polverizzata. Nelle nostre mani, da una dissezione di 50 cuori nel corso di esperimenti di una settimana, 50 cuori sono stati ottenuti strutturalmente intatto. Abbiamo anche insegnato questa tecnica per un collega in laboratorio che non aveva esperienza con dissezione zebrafish. 9 su 9 cuori sezionati dal principiante collega erano anche strutralmente intatto. Questo metodo di dissezione è adatto per i minori di età superiore a 1 mese di età, e per gli adulti di tutte le età.
Figura 2. Dissected cuori sono intatti e mantenere integrità architettonica. (A) in meno di 1 minuto, un cuore zebrafish adulto con un atrio intatto (A), il ventricolo (V), e bulbo arterioso (BA) può essere sezionato da un pesce eutanasia. (B) Tradizionale adulti dissezioni cuore zebrafish richiedono più tempo e anche quando è curata, correre il rischio di danni. Qui, solo il ventricolo è intatto. (C) Un cuore sezionato da un Tg (myl7 DsRed) pesce adulto ha mantenuto la sua integrità strutturale per l'utilizzo in istologia. L'atrio (A), il ventricolo (V), e bulbo arterioso (BA) sono visti, e le strutture più piccole come la valvola atrioventricolare (AV, freccia) e il tratto di efflusso (OFT, freccia) sono intatti. (D) </ Strong> microscopia elettronica di una wild-type cuore adulto sezionato mostra che sarcomeri rimangono intatti dal processo di dissezione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre sono stati descritti i metodi per sezionare cuore zebrafish adulto, questi metodi sono stati in termini di tempo e di solito causato danni al cuore durante la dissezione. Per eseguire esperimenti in cui può essere necessario un gran numero di cuori adulti, e / o quando evitare il degrado del tessuto cardiaco è importante per le applicazioni a valle, il tempo necessario utilizzando tecniche di dissezione tradizionali è proibitivo. Allo stesso modo, ottenendo riproducibile intatti, cuori intatti è importante per lo studio della struttura del cuore e per i metodi di immunoistochimica e microscopia. Abbiamo scoperto che, anche nelle mani dei principianti, il 100% dei cuori sezionati sono stati recuperati strutturalmente intatto. In generale, il metodo per la dissezione cuore adulto qui presentato presenta un anticipo nella tecnica che si espande l'uso di zebrafish adulti per una varietà di applicazioni attuali e future, compreso l'uso lesioni cuore e rigenerazione esperimenti.
Ci sono diversi passaggi critici well'ambito questo protocollo. Innanzitutto, a seconda dell'esperimento per i quali sono richiesti i cuori zebrafish, è importante risciacquare cuori il più possibile dalle cellule del sangue. Esempi di esperimenti che potrebbero trarre beneficio da rimuovere le cellule del sangue sono il recupero di cuori per RNA-Seq, in cui la presenza di sangue altererà profili di espressione genica, o per FACS ordinamento, in cui le cellule del sangue possono essere difficili da ordinare da cellule miocardiche. Dopo il pesce è eutanasia con Tricaine o ghiaccio, è importante decapitare il pesce rapidamente e permettere sanguinamento a verificarsi per contribuire a liberare il cuore di sangue in eccesso. Se un cuore integro, non è necessario per l'esperimento previsto, può essere utile per tagliare l'atrio e il ventricolo aperto quando in PBS per risciacquare ulteriormente il sangue. Tampone di lisi RBC può anche essere usato al posto di PBS.
In secondo luogo, come detto sopra, occasionalmente cuore viene via con una delle pinne pettorali, piuttosto che rimanere attaccato alla testa. Pertanto, tirare le pinne pettoralifuori sotto il microscopio in modo che il cuore può essere identificato. Infine, quando sezionare il cuore lontano da pericardio circostante, cercare di non cogliere il cuore stesso; invece, cogliere due pezzi di pericardio e entrambi tirare via dal cuore, che ha l'integrità strutturale più che il pericardio friabile. In questo modo, anche minimo danno al cuore può essere evitato.
Il cuore deve essere facilmente identificabile per la sua forma e le contrazioni. Per agevolare ulteriormente nel trovare cuore, si può sezionare un cuore che esprime una proteina fluorescente sotto un microscopio a fluorescenza dissezione. Questo è di solito non è necessario, ma può essere utile per principianti e / o per dissezioni di cuori molto piccoli.
Un limite di questa tecnica è che la dissezione cuore da piccoli pesci, cioè, più giovane di 3 settimane, è difficile; altre tecniche sono state progettate per dissezioni larvali 9. Inoltre, mentre è facile da sezionare il bulbo di unarteriosus, atrio e il ventricolo tra loro, non è possibile sezionare la valvola atrioventricolare propria. La valvola rimane attaccato al ventricolo nella maggioranza dei casi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
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