Abstract
Bruk av sebrafisk modellsystem for å studere utviklingen, regenerering, og sykdom ekspanderer mot bruk av voksne hjerter for celledissosiasjon og rensing av RNA, DNA og proteiner. Alle disse programmene krever rask gjenoppretting av et betydelig antall av sebrafisk hjerter for å unngå gen regulatoriske, metabolsk, og andre endringer som begynner etter døden. Voksne sebrafisk hjerter er også nødvendig for å studere hjertestruktur for en rekke mutanter og for å studere hjerte regenerering. Imidlertid er den tradisjonelle sebrafisk hjerte disseksjon langsom og vanskelig og krever spesialverktøy, slik at storskala disseksjon av voksne sebrafisk hjerter langtekkelig. Tradisjonelle metoder også havn risikoen for å skade hjertet under disseksjon. Her beskriver vi en metode for disseksjon av voksne sebrafisk hjerter som er rask, reproduserbar, og bevarer hjerte arkitektur. Videre gjør denne metoden ikke krever spesialverktøy, er smertefri for sebrafisk,kan utføres på friske eller faste prøver, og kan utføres på sebrafisk som ung som en måned gammel. Tilnærmingen beskrevet utvider bruken av voksen sebrafisk for kardiovaskulær forskning.
Protocol
MERK: Pass alltid på at IACUC eller etikk komité godkjenning er på plass før du begynner på eksperimentell prosedyre ved hjelp av sebrafisk.
1. Forbered reagenser og oppsett
- Forbered følgende løsninger. Finn oppskrifter for alle disse løsningene i standardsebrafisk manualer 10.
- 500 ml Egg Water
- 200 ml 0,03% Tricaine i Egg Water
- 100 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS)
- RBC Lysis Buffer (valgfritt)
- Målbufferen av valg (fiksativ, Trizol, PBS, etc.) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør på is
MERK: fiksativ og Trizol er giftige hvis de kommer i kontakt med hud. Bruk hansker når du håndterer disse stoffene.
- Forbered disseksjon oppsett:
- Plasser gooseneck lyskilde over disseksjonsmikroskop. Sett lokket av en 9 cm petriskål på disseksjonsmikroskop scenen, og hell et tynt lag med 1x PBS inndet (lokket er brukt fordi fatet i seg selv er for dypt for en enkel disseksjon).
- Plasser petriskål selv (ikke lokket) på benken nær dissekere omfang og hell ca 15 ml 1x PBS i det. Bruk dette til å vaske hjertet etter disseksjon. Alternativt kan du bruke RBC Lysis Buffer.
- Sted barberblad, to par tang, microscissors (valgfritt), og en overføring pipette ved siden av mikroskop. Skaff en beholder med is hvis aktiv dødshjelp ved rask nedkjøling er valgt.
- Hell 200 ml 0,03% Tricaine i Egg Vann i en 250 ml begerglass hvis aktiv dødshjelp ved Tricaine er valgt. Forberede en liten biohazard bag for fjerning av sebrafisk skrotter.
2. Forbered Sebrafisk
- For fast fisk, ta med fast fisk, skylt i PBS, til mikroskopet oppsett.
- Avlive hele voksen sebrafisk ved rask nedkjøling med is for> 10 min.
- Bruk pinsett til å lage et hull i huden over peritoneum(Vekk fra hjertet) for å hjelpe penetrasjon av fiksativ, og deretter sette dem i 4% paraformaldehyde i Fix Buffer 10 for 2 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C.
- Alternativt, for fersk fisk, sted fisk skal avlives i en liten holding tank og bringe til mikroskop oppsettet. Avhengig av den enkelte innretningens fisk protokollen og nedstrøms bruksområder for de dissekerte fisk hjerter, bedøve fisk med Tricaine eller avlive ved rask avkjøling før halshogging.
- For å bruke is, plukke opp en fisk med fisk netto og sted i isvann til fisken slutter å bevege seg, ca 5 min.
- Alternativt, for å bruke Tricaine, plukke opp en fisk med fisk netto og sted i begeret av løsningen inntil gill bevegelser stanser.
- Raskt plukke opp den avlives fisken ved halefinnen og legge den på sin side i petriskål cover som var fylt med 1x PBS. Bruk pinsett til å løfte en brystfinnen med den ene hånden, mens du bruker Razor blad å halshogge fisken med den andre hånden, bare posterior til vedlegget på buksiden (figur 1A). Utføre dette trinnet enten ved å se gjennom mikroskop eller ved bare direkte visualisere fisken på mikroskopet scenen.
MERK: Fersk avlives fisken vil fortsatt blø etter halshogging.
Figur 1. Sebrafisk voksen hjerte disseksjon benytter sebrafisk anatomiske landemerker. (A) For å halshogge fisken, løft brystfinnen med en pinsett og bruke en skarp ren barberblad langs den røde stiplede linjen som vist. (B) For å stabilisere fisken hodet, plasserer man tine av tang i fisken munn mens den andre tine ligger over øyet, og deretter snu fisken hodet slik at ventral overflaten er opp og begge tindene av pinsett er stabil mot bunnen av petriskål. (C) Bruk gratis forceps å kutte festet av operculum (pil). (D) Løfte dette, er rygg aorta synlig som en hvit struktur med en rosa stripe betegner luminal blod (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Skjær Hjerte
- Visualisere fisken hodet under mikroskopet. Med en tang, stabilisere fiskehodet ved å plassere en tine av tang i fiskens munn, gjennom hjernen, mens den andre tinde er utenfor hodet, over hele øyet (figur 1B). Påse at begge tindene av tang er stabil mot bunnen av petriskålen. Holde fisken hodet på denne måten, bør dens ventral overflaten vendt oppover.
- Med den andre hånden, bruke andre tang for å kutte den ventrale feste av operculum til legemet (pil, figur 1C). Løfte dette litt med pinsett, den dØrsal aorta vises under som et hvitt struktur med en rød stripe av blod i aorta lumen (pil, figur 1D). Skjær rygg aorta med pinsett ved å knipe aorta og dra oppover; Alternativt kan du bruke microscissors å kutte rygg aorta.
- Nå bruker de andre pinsett til å ta tak i brystfinnen fra sin base, inkludert kroppen brusk i bunnen av finnen, og løft dette av. Gjenta med den andre brystfinnen. Av og til kommer hjertet ut med brystfinnene, så undersøke disse brikkene til å sørge for at hjertet ikke er festet før du kasserer dem.
MERK: På dette punktet, bør hjertet være synlig, fortsatt intakt og koblet til den gjenværende fisken hodet (selv om noen ganger det kommer av med brystfinner). Hjertet kan identifiseres ved sin form, sin rosa farge, og dens vesen omgitt av pigmentert hjerteposen. Fordi avliving av fisken blir utført raskt, kan fersk avlives fiske hjerter fortsatt være juling sloWLY. - La gå av fisken hodet med de første tang, slik at begge hendene holder tang og er gratis. Bruk begge pinsett til å erte hjertet bort fra hjerteposen. Gripe hjertet av resten av dorsal aorta, mens den gjenværende posen trekkes bort.
MERK: Enten fast eller frisk, er hjertet robust til milde trekke mens det omkringliggende bindevev er mer sprøtt. Derfor kan en hvilken som helst omgivende vev perikardial bli dissekert vekk med hjertet gjenværende intakte. - Kast left fisk skrotten i biohazard bag.
4. Klargjør Hjerte for Nedstrøms Applications
- Bruk pinsett, ta tak i hjertet ved kanten av rygg aorta / bulbus arteriosus og plassere hjertet i frisk fat med 1x PBS. Alternativt kan du bruke en overføring pipette. Flytt hjertet og tilbake i PBS ca. 10x å vaske bort så meget blod som mulig.
- For applikasjoner hvor det er viktig å fjerne all possible blodceller, vask i en 9 cm petriskål med 15 ml RBC Lysis Buffer istedenfor PBS, med samme back-og-tilbake bevegelse. Ved å bevare strukturen av hjertet er ikke viktig for den nedstrøms anvendelse (f.eks som gjør RNA), bruker tang eller microscissors å åpne hjertehulen og lette å skylle bort av blodceller.
- For applikasjoner der separate hjertekamrene ønskes Bruk pinsett eller microscissors å dissekere bulbus arteriosus, atrium, og hjertekammer fra hverandre.
- Overfør hjertet, eller separate kamre, til bestemmelsesbuffer på is.
MERK: Vanlige destinasjoner inkluderer buffere for celledissosiasjon, 4% paraformaldehyde, eller Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne metoden, kan en voksen sebrafisk hjerte bli dissekert i mindre enn 1 min, sammenlignet med over 5 min ved hjelp av tradisjonelle metoder 8. Hjerter dissekert med denne metoden er pålitelig intakt (Figur 2A), mens tradisjonelle metoder 8 krever kutte blindt inn i hjerteposen og derfor ofte føre til skade eller tap av atriet eller bulbus arteriosus (figur 2B). Hjerter dissekert opprettholde sin strukturelle integritet og er egnet for histologi (figur 2C), elektronmikroskopi (figur 2D), såvel som for anvendelser hvor hjertet er dissosiert eller pulverisert. I våre hender, fra en disseksjon av 50 hjerter i løpet av en ukes eksperimenter ble 50 hjerter innhentet strukturelt intakt. Vi har også lært denne teknikken til en kollega i laboratoriet som ikke hadde noen erfaring med sebrafisk disseksjon. 9 av 9 hjerter dissekert av nybegynnere kollega var også struklysstøperi, kystgeiter intakt. Dette disseksjon metoden er egnet for yngel eldre enn en måned gamle, og for voksne i alle aldre.
Figur 2. dissekert hjerter er intakt og vedlikeholde arkitektonisk integritet. (A) På mindre enn 1 min, en voksen sebrafisk hjerte med en intakt atrium (A), ventrikkel (V), og bulbus arteriosus (BA) kan dissekert fra en avlives fisk. (B) Tradisjonell voksne sebrafisk hjerte disseksjoner ta lengre tid og selv når omsorg er tatt, risikerer skade. Her er intakt bare ventrikkelen. (C) En hjerte dissekert fra en Tg (myl7 DsRed) voksen fisk beholdt sin strukturelle integritet for anvendelse ved histologi. Atriet (A), ventrikkel (V), og bulbus arteriosus (BA) er sett, og enda mindre strukturer som atrioventrikulær ventilen (AV, pil) og utløpskanalen (OFT, pil) er intakt. (D) </ Strong> Elektronmikroskopi av en dissekert villtype voksen hjerte viser at sarcomeres forblir uskadet av disseksjon prosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om fremgangsmåter for å dissekere den voksne sebrafisk hjertet er blitt beskrevet, er disse metoder var tidkrevende og ofte forårsaket skade på hjertet under disseksjonen. For å utføre eksperimenter hvor et stort antall voksne hjerter kan være nødvendig, og / eller ved å unngå nedbrytning av hjertevevet er viktig for nedstrøms applikasjoner, er prohibitive den tid som kreves ved bruk av tradisjonelle teknikker disseksjon. Tilsvar, reproduserbart skaffe uskadde, intakte hjerter er viktig for studier av hjertestruktur og for immunhistokjemiske og mikroskopi metoder. Vi har funnet at selv i hendene på nybegynnere, ble 100% av hjerter dissekert gjenvunnet strukturelt intakt. Samlet metode for voksne hjerte disseksjon presenteres her presenterer et forskudd på teknikk som utvider bruken av voksen sebrafisk for en rekke nåværende og fremtidige applikasjoner, inkludert bruk i hjertet skade og regenerering eksperimenter.
Det er flere viktige skritt wTVen på denne protokollen. Først, avhengig av eksperimentet som sebrafisk hjerter er nødvendig, er det viktig å skylle hjerter så mye som mulig fra blodcellene. Eksempler på forsøk som ville ha nytte av å fjerne blodceller omfatter utvinning av hjerter for RNA-Seq, hvor tilstedeværelse av blod vil forandre genekspresjonsprofiler, eller for FACS-sortering, der blodceller kan være vanskelig å sortere fra myokardiale celler. Etter at fisken avlives med Tricaine eller is, er det viktig å decapitate fisken raskt og tillater blødning forekommer for å bidra til å befri sentrum av overskytende blod. Hvis en intakt hjerte ikke er nødvendig for den planlagte forsøk, kan det være nyttig å kutte atrium og ventrikkel åpen når i PBS til ytterligere skylle ut blodet. RBC lysis buffer kan også brukes istedenfor PBS.
Sekund, som nevnt ovenfor, av og til hjertet kommer ut med en av de brystfinner i stedet for å holde seg festet til hodet. Derfor trekker brystfinnerav under mikroskopet, slik at hjertet kan bli identifisert. Til slutt, når dissekere hjerte bort fra omkringliggende hjerteposen, prøv å ikke ta tak i hjertet selv; i stedet, bør du holde to stykker av hjerteposen og trekke dem begge bort fra hjertet, som har mer strukturell integritet enn sprøtt hjerteposen. På denne måten kan til og med minimal skade på hjertet unngås.
Hjertet skal være lett gjenkjennelige med sin form og sammentrekninger. Som et ytterligere hjelpemiddel for å finne sentrum, kan man dissekere et hjerte som uttrykker et fluorescerende protein under et fluorescens disseksjonsmikroskop. Dette er vanligvis ikke nødvendig, men kan være nyttig for nybegynnere og / eller for dissections av meget små hjerter.
En begrensning ved denne teknikk er at dissekere hjerter fra små fisk, dvs. yngre enn 3 uker gamle, er vanskelig; andre teknikker har blitt utviklet for larve disseksjoner 9. Også, mens det er lett å dissekere bulbus enrteriosus, atrium, og hjertekammer fra hverandre, er det ikke mulig å dissekere atrioventrikulær ventil på egen hånd. Ventilen forblir festet til ventrikkelen i de fleste tilfeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
