Abstract
Anvendelse af zebrafisk modelsystem til undersøgelse udvikling, regenerering og sygdom ekspanderer mod brug af voksne hjerter for celledissociering og oprensning af RNA, DNA og proteiner. Alle disse applikationer kræver en hurtig genopretning af et betydeligt antal zebrafisk hjerter for at undgå gen regulering, metaboliske og andre ændringer, der begynder efter døden. Voksne zebrafisk hjerter er også påkrævet for at studere hjerte struktur for en række forskellige mutanter og til at studere hjerte regenerering. Men den traditionelle zebrafisk hjerte dissektion er langsom og vanskelig og kræver specialiserede værktøjer, hvilket gør store dissektion af voksne zebrafisk hjerter trættende. Traditionelle metoder harbour også risikoen for at beskadige hjertet under dissektion. Her beskriver vi en metode til dissektion af voksne zebrafisk hjerter, der er hurtig, reproducerbar, og bevarer hjerte arkitektur. Hertil kommer, at denne metode ikke kræver specialiserede værktøjer, er smertefri for zebrafisk,kan udføres på friske eller faste prøver, og kan udføres på zebrafisk så unge som en måned gammel. Den beskrevne fremgangsmåde udvider brugen af voksne zebrafisk for kardiovaskulær forskning.
Protocol
BEMÆRK: Sørg altid for, at godkendelse IACUC eller etiske komité er på plads, før du begynder enhver eksperimentel procedure ved hjælp af zebrafisk.
1. Forbered reagenser og opsætning
- Forbered følgende løsninger. Find opskrifter for alle disse løsninger i standard zebrafisk manualer 10.
- 500 ml Egg Water
- 200 ml 0,03% tricaine i Egg Water
- 100 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS)
- RBC Lysis Buffer (valgfrit)
- Destination buffer valg (fiksativ Trizol, PBS, etc.) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør på is
BEMÆRK: Fikservæske og Trizol er giftige, hvis de kommer i kontakt med huden. Brug handsker ved håndtering af disse stoffer.
- Forbered dissektion opsætning:
- Placer svanehals lyskilde over dissektionsmikroskop. Placer låget på en 9 cm petriskål på dissektionsmikroskop fase, og hæld et tyndt lag 1x PBS idet (låget anvendes, fordi skålen selv er for dyb til en let dissektion).
- Anbring petriskålen selv (ikke låget) på køkkenbordet nær dissektionsmikroskop og hæld ca. 15 ml 1x PBS i det. Brug dette til at vaske hjertet efter dissektion. Alternativt kan du bruge RBC Lysis Buffer.
- Place barberblad, to par tænger, microscissors (valgfrit), og en overførsel pipette ved siden af mikroskop. Opnå en beholder med is, hvis eutanasi ved hurtig afkøling er valgt.
- Hæld 200 ml 0,03% tricaine i Egg vand i en 250 ml glasbæger hvis eutanasi af tricaine vælges. Forbered en lille biohazard taske til bortskaffelse af zebrafisk kroppe.
2. Forbered zebrafisk
- Til fast fisk, bringe fast fisk, skyllet i PBS, til mikroskopet setup.
- Aflive hele den voksne zebrafisk af hurtig nedkøling med is i> 10 min.
- Brug pincet til at lave et hul i huden over bughinden(Væk fra hjertet) for at hjælpe penetration af fiksativ, og derefter sætte dem i 4% paraformaldehyd i Fix Buffer 10 i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C.
- Alternativt, for frisk fisk, sted fisk, der skal aflives i en lille opbevaringstank og bringe til mikroskop setup. Afhængig af den enkelte facilitet fisk protokol og downstream anvendelser for dissekerede fisk hjerter, bedøve fisk med tricaine eller aflive af hurtig nedkøling før halshugning.
- For at bruge is, afhente en fisk med fiskenet og sted i isvand indtil fisken stopper bevæger sig, ca. 5 min.
- Alternativt til at bruge tricaine, afhente en fisk med fiskenet og plads i bægeret af løsningen indtil gælle bevægelser stoppe.
- Hurtigt afhente aflivet fisk ved sin halefinne og lægge den på sin side i petriskålen cover, der var fyldt med 1x PBS. Brug pincet til at løfte en brystfinnen med den ene hånd, mens du bruger Razor klingen halshugge fisken med den anden hånd, bare posteriort for fastgørelse af brystfinnen (figur 1A). Udfør dette trin, enten ved at kigge gennem mikroskop eller ved blot direkte visualisere fisk på mikroskop scenen.
BEMÆRK: Frisk aflivet fisk vil stadig bløder efter halshugning.
Figur 1. Zebrafisk voksen hjerte dissektion udnytter zebrafisk anatomiske vartegn. (A) For at halshugge fisken, løfte brystfinnen med en pincet og bruge en skarp ren barberblad langs den røde stiplede linie som vist. (B) For at stabilisere fisk hoved, placere en tand af tangen i fisken mund, mens den anden tand ligger over øjet, og drej derefter fisk hoved, så den ventrale overflade er op og begge Tænder af tangen er stabile mod bunden af petriskålen. (C) Brug den gratis kræfeps at skære fastgørelse af Laag (pil). (D) Løft dette, den dorsale aorta er synlig som en hvid struktur med en lyserød stribe betegner luminale blod (pil). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
3. Skær Heart
- Visualisere fiskehovedet under mikroskopet. Med en pincet, stabil fiskehovedet ved at placere en tand af tangen i fisken munden, gennem hjernen, mens den anden tand er uden hoved, på tværs af øjet (figur 1B). Sikre begge tænder af tangen er stabil mod bunden af petriskålen. Hold fisk hoved på denne måde, bør dets ventral overflade vender opad.
- Med den anden hånd, bruge den anden pincet til at skære den ventrale fastgørelse af operculum til kroppen (pil, figur 1C). Løft denne lidt med pincet, dorsal aorta vises nedenunder som et hvidt struktur med en rød stribe af blod i aorta lumen (pil, figur 1D). Skær dorsale aorta med pincet ved at klemme aorta og trække opad; alternativt, benytte microscissors til at skære den dorsale aorta.
- Nu bruge den anden pincet til at gribe brystfinnen fra sin base, herunder krop brusk i bunden af fin, og løft det af. Gentag med den anden brystfinnen. Lejlighedsvis, hjertet kommer ud med brystfinnerne, så undersøge disse stykker for at sikre, hjertet ikke er fastgjort inden kassering dem.
BEMÆRK: På dette tidspunkt bør hjerte være synlige, stadig er intakt og forbundet til den resterende fisk hoved (selv lejlighedsvis det kommer ud med brystfinnerne). Hjertet kan identificeres ved sin form, dens lyserøde farve, og dens væsen omgivet af pigmenteret hjertesækken. Fordi aflivning af fisken udføres hurtigt, kan frisk aflivet fisk hjerter stadig slå slowly. - Slip fiskehovedet med de første pincet, således at begge hænder holder pincet og er gratis. Brug begge pincet til at drille hjertet væk fra hjertesækken. Tag fat i hjertet af den resterende del af den dorsale aorta, mens de resterende hjertesækken trækkes væk.
BEMÆRK: Uanset om faste eller frisk, hjertet er robust over for blid trække mens det omgivende bindevæv er mere sprødt. Derfor kan enhver omgivende perikardiel væv dissekeres væk med hjertet resterende intakt. - Kassér den sidesten fisk slagtekroppen i biologisk farligt taske.
4. Forbered Heart for downstream-applikationer
- Ved hjælp af en pincet, tag fat i hjertet ved kanten af dorsale aorta / bulbus arteriosus og placere hjertet i den friske skål af 1x PBS. Alternativt kan du bruge en overførsel pipette. Flyt hjertet frem og tilbage i PBS ca. 10x at vaske så meget blod væk som muligt.
- Til anvendelser, hvor det er vigtigt at fjerne alle possible blodlegemer vaskes i en 9 cm petriskål med 15 ml RBC Lysis Buffer stedet for PBS under anvendelse af samme back-og-tilbage bevægelse. Hvis bevare strukturen af hjertet er ikke vigtigt for downstream program (f.eks, hvilket gør RNA), skal du bruge pincet eller microscissors at åbne hjertet hulrum og letter skylning væk af blodceller.
- Til anvendelser, hvor separate hjertekamre der ønskes, kan du bruge pincet eller microscissors at dissekere den bulbus arteriosus, atrium, og ventrikel fra hinanden.
- Overfør hjertet eller separate kamre, til destinationen buffer på is.
BEMÆRK: Almindelige destinationer omfatter buffere til celle dissociation, 4% paraformaldehyd, eller Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne metode, kan en voksen zebrafisk hjerte blive dissekeret på mindre end 1 min, sammenlignet med over 5 min ved hjælp af traditionelle metoder 8. Hearts dissekeret ved hjælp af denne metode er pålidelig intakt (figur 2A), mens traditionelle metoder 8 kræver skære blindt i hjertesækken og derfor almindeligvis forårsage skade eller tab af atriet eller bulbus arteriosus (figur 2B). Hearts dissekerede opretholde deres strukturelle integritet og er velegnet til histologi (figur 2C), elektronmikroskopi (figur 2D), samt til anvendelser, hvor hjertet er dissocierede eller pulveriserede. I vores hænder, fra en dissektion af 50 hjerter i løbet af en uges forsøg blev 50 hjerter opnået strukturelt intakt. Vi lærte også denne teknik til en kollega i laboratoriet, som ikke havde nogen erfaring med zebrafisk dissektion. 9 ud af 9 hjerter dissekeret af begynderen kollega var også struk-turelt intakt. Denne dissektion Metoden er velegnet til unge ældre end 1 måned gammel, og for voksne i alle aldre.
Figur 2. dissekeret hjerter er intakte og vedligeholde arkitektoniske integritet. (A) På mindre end 1 min, en voksen zebrafisk hjerte med en intakt atrium (A), ventrikel (V), og bulbus arteriosus (BA) kan udskæres fra en aflivet fisk. (B) Traditionel voksne zebrafisk hjerte dissektioner tage længere og selv når omhu, løbe risikoen for skader. Her kun ventriklen er intakt. (C) Et hjerte dissekeret fra en Tg (myl7 dsRed) voksne fisk fastholdt sin strukturelle integritet til brug i histologi. Atrium (A), ventrikel (V), og bulbus arteriosus (BA) er set, og endnu mindre strukturer som den atrioventrikulære ventil (AV, pil) og udstrømningen tarmkanalen (OFT, pil) er intakte. (D) </ Strong> Elektronmikroskopi af en dissekeret vildtype voksen hjerte viser, at sarkomerer forbliver ubeskadiget ved dissektion processen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om der er beskrevet fremgangsmåder til at dissekere den voksne zebrafisk hjertet, disse metoder var tidskrævende og almindeligt forårsaget skade på hjertet under dissektion. For at udføre eksperimenter, hvor et stort antal voksne hjerter kan være behov for, og / eller når undgå forringelse af hjerte væv er vigtig for downstream-applikationer, den tid, der kræves ved hjælp af traditionelle dissektion teknikker er uoverkommelig. Ligeledes er vigtig for undersøgelse af hjertet struktur og til immunhistokemisk og mikroskopi metoder reproducerbart opnå ubeskadigede intakte hjerte. Vi fandt, at selv i hænderne på begyndere, var 100% af hjerter dissekeret udvundet strukturelt intakt. Samlet set metoden til voksne hjerte dissektion præsenteres her præsenterer en fremgang i teknik, der udvider brugen af voksne zebrafisk for en række nuværende og fremtidige applikationer, herunder brug i hjerte skade og regenerering eksperimenter.
Der er flere kritiske trin wnden denne protokol. Først, afhængigt af forsøget, for hvilke der kræves zebrafisk hjerter, er det vigtigt at skylle hjerter så meget som muligt fra blodceller. Eksempler på eksperimenter, der ville drage fordel af at fjerne blodceller omfatter genvinding af hjerter for RNA-Seq, hvor tilstedeværelsen af blod vil ændre genekspressionsprofiler eller til FACS-sortering, hvor blodlegemer kan være vanskeligt at sortere fra myocardiale celler. Efter fisken aflivet med tricaine eller is, er det vigtigt at halshugge fisk hurtigt og tillade blødningen forekommer at hjælpe befri hjertet af overskydende blod. Hvis et intakt hjerte ikke er nødvendige for den planlagte forsøg, kan det være nyttigt at skære atrium og ventrikel åbne, når i PBS til yderligere skylles ud blodet. RBC lysis buffer kan også anvendes i stedet for PBS.
For det andet, som nævnt ovenfor, lejlighedsvis hjertet kommer ud med en af brystfinnerne snarere end opholder fastgjort til hovedet. Derfor trækker brystfinnerfra under mikroskopet så hjertet kan identificeres. Endelig, når dissekere hjerte væk fra omgivende hjertesækken, så prøv ikke at forstå hjertet selv; i stedet, fat to stykker hjertesækken og trække dem begge væk fra hjertet, som har mere strukturel integritet end sprødt hjertesækken. På denne måde kan selv minimal skade på hjertet undgås.
Hjertet skal være lette at identificere ved sin form og sammentrækninger. Som en ekstra hjælp i at finde hjertet, kan man dissekere et hjerte udtrykker et fluorescerende protein under en fluorescens dissektionsmikroskop. Dette er normalt ikke nødvendigt, men kan være nyttige for begyndere og / eller dissektioner af meget små hjerter.
En begrænsning ved denne teknik er at dissekere hjerter fra små fisk, dvs. yngre end 3 uger gammel, er vanskelig; andre teknikker er blevet designet til larver dissektioner 9. Også, mens det er let at dissekere bulbus enrteriosus, atrium og ventrikel fra hinanden, er det ikke muligt at dissekere atrioventrikulær ventil på egen hånd. Ventilen forbliver fastgjort til ventriklen i de fleste tilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
