Abstract
Использование данио модели системы для изучения развития, регенерации и болезнь расширяет к использованию взрослых сердцах клеточной диссоциации и очистки РНК, ДНК и белков. Все эти приложения требуют быстрого восстановления значительного числа данио сердца, чтобы избежать ген регулирования, метаболические и другие изменения, которые начинаются после смерти. Взрослых данио сердца также необходимы для изучения структуры сердца для различных мутантов и для изучения регенерации сердца. Тем не менее, традиционный данио сердце рассечение медленно и трудно и требует специальных инструментов, что делает крупномасштабное рассечение взрослых данио сердца утомительным. Традиционные методы также питают риск повреждения сердца во время вскрытия. Здесь мы опишем метод рассечения взрослых данио сердца, которое быстро, воспроизводимым, и сохраняет сердце архитектуры. Кроме того, этот метод не требует специальных инструментов, является безболезненным для рыбок данио,может быть выполнена на свежих или фиксированных экземпляров, и может быть выполнена на рыбок данио, как молодой, как один месяц. Описанный подход расширяет использование взрослых данио сердечно-сосудистых исследований.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда быть уверены, что утверждение IACUC или комитет по этике на месте перед началом любой экспериментальной методике, используя данио.
1. Подготовьте реактивы и настройки
- Подготовьте следующие решения. Найти рецепты для всех этих решений в стандартных данио пособий 10.
- 500 мл Яйцо воды
- 200 мл 0,03% Tricaine в яйце воды
- 100 мл 1x фосфатно-солевом буфере (PBS)
- РБК лизис буфера (по желанию)
- Направление буфера выбора (фиксатор, Trizol, PBS, и т.д.) в 1,5 мл пробирке на льду
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксатив и Trizol являются токсичными, если они вступают в контакт с кожей. Надевайте перчатки при работе с этими веществами.
- Подготовка установки рассечение:
- Расположите источник гусиная шея света над вскрытии микроскопом. Поместите крышку в 9 см чашки Петри на стадии вскрытии микроскопом, и залить тонким слоем 1x PBS вэто (крышка используется потому, что сама по себе блюдо слишком глубоко для легкого вскрытия).
- Поместите саму чашку Петри (не крышки) на столешницу вблизи рассекает рамки и влейте примерно 15 мл 1x PBS в нем. Используйте это, чтобы вымыть сердце после вскрытия. Кроме того, использование РБК буфера для лизиса.
- Место лезвие бритвы, две пары щипцов, microscissors (опционально), и пипетки рядом с микроскопом. Получение контейнер льдом, если эвтаназии путем быстрого охлаждения выбирается.
- Залить 200 мл 0,03% Tricaine в яйце воды в стеклянном стакане 250 мл, если эвтаназия по Tricaine выбран. Подготовьте небольшую биологическую мешок для утилизации данио туш.
2. Подготовьте данио рерио
- При фиксированном рыбы, довести фиксированный рыбу, промытую в PBS, в зависимости от настроек микроскопа.
- Эвтаназии весь взрослых данио при быстром охлаждении льдом в течение> 10 мин.
- Используйте пинцет, чтобы сделать отверстие в коже в течение брюшины(От сердца), чтобы помочь проникновению фиксатора, а затем поместить их в 4% параформальдегид в Фикс буфера 10 в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
- Кроме того, для свежей рыбы, рыбное место, чтобы быть умерщвлены в небольшом бак и довести до установки микроскопа. В зависимости от протокола рыба отдельного объекта и ниже по течению использования для расчлененных рыбы сердца, обезболить рыбу с Tricaine или усыпить быстрым охлаждением до обезглавливания.
- Чтобы использовать лед, подобрать одну рыбу с сетью рыбы и место в ледяной воде, пока рыба не перестает двигаться, примерно 5 мин.
- Кроме того, чтобы использовать Tricaine, подобрать одну рыбу с чистым и место рыбы в стакане раствора до движения жаберных упора.
- Быстро подобрать эвтаназии рыбу ее хвостового плавника и положите ее на бок в посудомоечной крышкой Петри, которая была заполнена с 1x PBS. Используйте пинцет, чтобы поднять грудного плавника с одной стороны, при использовании RAZOR лезвие, чтобы обезглавить рыбу с другой стороны, просто позади прикрепления грудного плавника (рис 1А). Выполните этот шаг либо, глядя в микроскоп или просто напрямую визуализации рыбу на столике микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий эвтаназии рыбы будет по-прежнему кровотечения после обезглавливания.
Рисунок 1. Данио рерио взрослых сердце рассечение использует данио анатомические ориентиры. (), Чтобы обезглавить рыбу, поднимите грудную плавник с пинцетом и использовать острый чистый лезвие вдоль красной пунктирной линии, как показано на рисунке. (B), чтобы стабилизировать голову рыбы, положите одну зуб щипцов в рот рыбы время Другое зубцы лежит через глаза, а затем поверните голову рыбы, так что вентральной поверхности и обе лапы щипцов устойчивы по отношению к нижней части чашки Петри. (C) Используйте бесплатную ForcEPS сократить крепление крышечки (стрелка). (D) Подъемные это, спинной аорты видна в виде белой структуры с розовой полосой, обозначающей просвета кровь (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
3. Проанализируйте Сердце
- Представьте голову рыбы под микроскопом. С одной щипцов, стабилизировать голова рыбы путем размещения один зубец из щипцов во рту рыбы, через мозг, а другой выступ находится вне головки, через глаз (Фиг.1В). Убедитесь, что оба зубья пинцетом устойчивы к нижней части чашки Петри. Проведение голова рыбы таким образом, его вентральной поверхности должна быть обращена вверх.
- С другой стороны, использовать второй пинцет, чтобы сократить брюшной крепление крышечки к корпусу (стрелка, рис 1в). Подъемные это немного пинцетом, dorsal аорты появится под в виде белой структуры с красной полосой крови в просвет аорты (стрелка, рис 1D). Отрежьте спинной аорты с помощью пинцета зажимая аорты и потянув вверх; альтернативно можно использовать microscissors сократить спинной аорты.
- Теперь, используя второй пинцет, чтобы понять грудного плавника от своей базы, в том числе хрящ тела у основания плавника, и поднимите это от. Повторите с другой грудного плавника. Иногда сердце выходит наружу вместе с грудными плавниками, поэтому рассмотрим эти части, чтобы убедиться, что сердце не прилагается, прежде чем выбросить их.
Примечание: В этот момент, сердце должно быть видно, еще цела и соединен с остальной головы рыбы (хотя иногда он сходит с грудных плавников). Сердце может быть идентифицирован по его форме, его розового цвета, и его в окружении пигментной перикарда. Потому что эвтаназия рыб выполняется быстро, только что эвтаназии рыбы сердца все еще может быть избиение SLOwly. - Отпусти головы рыбы с первых щипцов, так что обе руки держат пинцетом и бесплатно. Используйте оба щипцы дразнить сердце от перикарда. Возьмитесь за сердце от остальной части спинной аорты, а остальные перикард оторвался.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксированный или свежие, сердце является устойчивым к нежным тянет, а окружающая их соединительная ткань более рыхлая. Таким образом, любой среде, в полости перикарда ткань может быть отсечен с сердцем оставшиеся нетронутыми. - Откажитесь от остатки рыбы тушу в биологической мешок.
4. Подготовьте сердце для последующих применений
- Использование щипцов, держитесь сердце у края спинной аорты / Bulbus артериального и поместить сердце в свежем блюдо 1x PBS. Кроме того, использование передачи пипетки. Перемещение сердце и обратно в PBS примерно в 10 раз, чтобы смыть столько крови, сколько возможно.
- Для применений, в которых важно, чтобы удалить все possibле кровяные клетки, вымыть в 9 см чашки Петри с 15 мл РБК лизирующего буфера вместо PBS, используя те же движения назад и вперед. Если сохранение структуры сердца, не важно по нисходящему приложения (например, делая РНК), используйте щипцы или microscissors, чтобы открыть полости сердца и облегчить вымывания клеток крови.
- Для приложений, в которых отдельные камеры сердца желательны, используйте щипцы или microscissors препарировать бульбус артериальный атриум, и желудочек друг от друга.
- Перевести на сердце, или отдельные камеры, в буфер назначения на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общие направления включают буферы для диссоциации клеток, 4% параформальдегида, или TRIZOL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот метод, взрослых данио сердце можно разбить менее чем 1 мин, по сравнению с более 5 мин с использованием традиционных методов 8. Сердца рассеченные с помощью этого метода достоверно нетронутыми (2А), в то время как традиционные методы 8 требуют резки слепо в перикард и поэтому обычно привести к повреждению или потере атриума или Bulbus артериального (рис 2б). Сердца рассеченные поддерживать свою структурную целостность и пригодны для гистологического (фиг.2С), электронной микроскопии (рис 2D), а также для применений, где сердце диссоциированных или измельченные. В наших руках, от рассечения 50 сердец на протяжении экспериментов неделе, 50 сердца были получены структурно нетронутыми. Мы также преподавал эту технику с коллегой в лаборатории, которые не имели никакого опыта с данио вскрытия. 9 из 9 сердцах расчлененный начинающему коллеге также STRUCрной нетронутыми. Этот метод рассечения подходит для несовершеннолетних старше 1 месяца, так и для взрослых всех возрастов.
Рисунок 2. расчлененный сердца целы и поддерживать архитектурную целостность. () В менее чем 1 мин взрослого данио сердца с неповрежденной предсердия (А), желудочек (V), и Bulbus артериального (BA) можно разрезать с эвтаназии рыбы. (B) Традиционный взрослых данио вскрытия сердца занимает больше времени, и даже когда приняты меры, рискуют повреждений. Здесь только желудочек без изменений. (С) сердца рассекали от Tg (myl7 DsRed) взрослых рыб сохраняет свою структурную целостность для использования в гистологии. Атриум (), желудочек (V), и бульбус артериальный (BA) видны, и даже более мелкие структуры, такие как атриовентрикулярного клапана (AV, стрелка) и оттока (OFT, стрелка) целы. (D) </ STRONG> Электронная микроскопия в расчлененного дикого типа взрослого сердца показывает, что саркомеры остаются неповрежденными в процессе вскрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как методы рассечения взрослых данио сердце были описаны, эти методы были трудоемким и обычно вызывается к повреждению сердца во время вскрытия. Для проведения экспериментов, где большое количество взрослых сердца могут быть необходимы, и / или когда избежать деградации ткани сердца имеет важное значение для последующих применений, время, необходимое использованием традиционных методов рассечение является чрезмерно высокой. Кроме того, воспроизводимо получать неповрежденные, неповрежденные сердца имеет важное значение для изучения структуры сердца и иммуногистохимических и микроскопии методами. Мы обнаружили, что даже в руках начинающих, 100% сердец расчлененный были восстановлены структурно нетронутыми. В целом, метод взрослого сердца вскрытия представленные здесь представляет собой шаг вперед в технике, которая расширяет использование взрослых данио для различных текущих и будущих приложений, в том числе использования в травме сердца и экспериментов по регенерации.
Есть несколько важных шагов Втithin этот протокол. Во-первых, в зависимости от эксперимента, для которого данио сердца, необходимого, важно, чтобы промыть сердца, насколько это возможно из клеток крови. Примеры экспериментов, которые выиграют от удаления клеток крови, включают восстановление сердцах Секвенирование РНК, где присутствие крови будет изменить профили экспрессии генов, или для FACS сортировки, где клетки крови может быть трудно разобраться с клеток миокарда. После эвтаназии рыба с Tricaine или льда, важно, чтобы обезглавить рыбу быстро и позволяют кровотечение происходит, чтобы помочь избавить сердце избыточного крови. Если нетронутыми сердце не требуется для планируемого эксперимента, это может быть полезно, чтобы сократить атриум и желудочка открытым, когда в PBS и далее промыть кровь. Эритроцитов лизирующего буфера также могут быть использованы вместо PBS.
Во-вторых, как отмечалось выше, иногда сердце отрывается с одним из грудных плавников, а не оставаться прикреплен к головке. Поэтому, потяните грудные плавникиот под микроскопом, так, что сердце можно идентифицировать. Наконец, когда рассекает сердце от окружающих перикарда, старайтесь не понять самого сердца; Вместо этого, понять две части перикарда и тянуть их как от сердца, которая имеет более структурную целостность, чем рыхлой перикарда. Таким образом, даже минимальные повреждения сердца можно избежать.
Сердце должно быть легко идентифицировать по своей форме и сокращений. В качестве дополнительной помощи в поиске сердце, можно препарировать сердце выражения флуоресцентный белок под флуоресцентным микроскопом рассекает. Это, как правило, не требуется, но может быть полезен для начинающих и / или для вскрытия очень малых сердца.
Одним из ограничений этого метода является то, что рассекает сердца от мелкой рыбы, то есть моложе 3-недельного возраста, трудно; другие методы были разработаны для личинок вскрытия 9. Кроме того, в то время как это легко рассекают Bulbus Аrteriosus, атриум, и желудочки друг от друга, это не возможно вскрыть атриовентрикулярным клапан сам по себе. Клапан остается прикрепленной к желудочка в большинстве случаев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
