Abstract
Användning av zebrafisk modellsystem för att studera utveckling, regenerering, och sjukdom expanderar mot användning av vuxna hjärtan för cell dissociation och rening av RNA, DNA och proteiner. Alla dessa applikationer kräver den snabba återhämtningen av betydande antal zebrafisk hjärtan att undvika genreglerande, metabola och andra förändringar som börjar efter döden. Vuxna zebrafisk hjärtan krävs också för att studera hjärtstruktur för en mängd olika mutanter och för att studera hjärtregenerering. Men den traditionella zebrafisk hjärta dissektion långsamt och svårt och kräver specialverktyg, vilket gör storskalig dissektion av vuxna zebrafisk hjärtan tråkiga. Traditionella metoder härbärgerar också risken för skador på hjärtat under dissekering. Här beskriver vi en metod för dissektion av vuxna zebrafisk hjärtan som är snabb, reproducerbar och bevarar hjärt arkitektur. Vidare har denna metod inte kräver specialiserade verktyg, är smärtfri för zebrafisk,kan utföras på färska eller fasta prover, och kan utföras på zebrafisk så unga som en månad gammalt. Den strategi som beskrivs utökar användningen av vuxna zebrafisk för kardiovaskulär forskning.
Protocol
OBS: Se alltid till att IACUC eller etisk kommitté godkännande är på plats innan du påbörjar någon experimentell procedur använder zebrafisk.
1. Förbered reagenser och installation
- Bered följande lösningar. Hitta recept för alla dessa lösningar i standardzebrafisk handböcker 10.
- 500 ml Egg Vatten
- 200 ml 0,03% Tricaine i Egg Vatten
- 100 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- RBC Lysis Buffer (tillval)
- Destination buffert val (fixativ, Trizol, PBS, etc.) i en 1,5 ml mikrofugrör på is
OBS: Fixative och Trizol är giftiga om de kommer i kontakt med huden. Använd handskar vid hantering av dessa ämnen.
- Förbered dissektion setup:
- Placera svanhalsen ljuskälla över dissekera mikroskop. Placera locket på en 9 cm petriskål på dissekera mikroskop scenen, och häll ett tunt lager av 1x PBS idet (locket används eftersom skålen själv är för djupt för en enkel dissektion).
- Placera petriskål själv (inte locket) på bänkskivan nära dissekera omfattning och häll ca 15 ml 1x PBS i den. Använd detta för att tvätta hjärtat efter dissektion. Alternativt kan du använda RBC lyseringsbuffert.
- Placera rakblad, två par pincett, microscissors (tillval) och en överföringspipett bredvid mikroskopet. Skaffa en behållare med is om dödshjälp genom snabb kylning väljs.
- Häll 200 ml av 0,03% Tricaine i Egg vatten i ett 250 ml glasbägare om eutanasi genom Tricaine väljs. Förbered en liten väska biohazard för omhändertagande av zebrafisk kadaver.
2. Förbered Zebrafish
- För fast fisk, ta fast fisk, sköljdes i PBS, till mikroskop setup.
- Euthanize hela den vuxna zebrafisk genom snabb kylning med is för> 10 min.
- Använd pincett för att göra ett hål i huden över bukhinnan(Bort från hjärtat) för att underlätta penetration av fixativ, och sedan lägga dem i 4% paraformaldehyd i Fix Buffert 10 under 2 timmar vid RT eller O / N vid 4 ° C.
- Alternativt, för färsk fisk, plats fisk som skall avlivas i en liten förvaringstank och ta med till mikroskop installationen. Beroende på den enskilda anläggningens fisk protokoll och nedströms användningsområden för dissekerade fisk hjärtan, söva fisk med Tricaine eller avliva genom snabb nedkylning före halshuggning.
- För att använda is, plocka upp en fisk med fisk nät och placera i isvatten tills fisken stannar, approximativt 5 min.
- Alternativt att använda Tricaine, plocka upp en fisk med fisken nätet och plats i bägaren av lösningen tills gill rörelser stannar.
- Snabbt plocka upp avlivas fisk genom sin stjärtfenan och lägg det på sin sida i petriskålen locket som var fylld med 1x PBS. Använd pincett för att lyfta en bröstfenan med ena handen, medan du använder Razor bladet att decapitate fisken med den andra handen, bara posteriort om fastsättning av bröstfenan (Figur 1A). Utför detta steg, antingen genom att titta genom mikroskop eller genom att bara direkt visualisera fisken på mikroskop scenen.
OBS: Färskt euthanized fisk kommer fortfarande blöder efter halshuggning.
Figur 1. Zebrafish vuxen hjärta dissektion utnyttjar zebrafisk anatomiska landmärken. (A) För att halshugga fisken, lyft bröstfenan med en pincett och använda ett vasst rent rakblad längs den röda streckade linjen som visas. (B) För att stabilisera fiskhuvud, placera en tine av pincetten i fisk munnen medan den andra pinnen ligger över ögat, och slå sedan fisken huvudet så att den ventrala ytan är upp och båda pinnar av tången är stabila mot botten av petriskålen. (C) Använd gratis Forceps att klippa fastsättning av gällocket (pilen). (D) Lyft detta är rygg aorta syns som en vit struktur med en rosa rand betecknar luminala blod (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Dissekera Heart
- Visualisera fiskhuvudet under mikroskop. Med en pincett, stadig fiskhuvudet genom att placera en tine av tången i fisk munnen, genom hjärnan, medan den andra pinnen är utanför huvudet, över ögat (Figur 1B). Kontrollera att båda pinnar av tången är stadigt mot botten av petriskålen. Håll fiskhuvudet detta sätt bör dess ventrala yta vara vänd uppåt.
- Med den andra handen, använda den andra pincett för att skära den ventrala fästandet av kapseln till kroppen (pil, Figur 1C). Lyfta detta något med pincett, dorsal aorta visas undertill som en vit struktur med en röd rand av blod i aorta lumen (pil, figur 1D). Skär de dorsala aorta med pincetten genom att klämma aorta och dra uppåt; alternativt använd microscissors att klippa rygg aorta.
- Nu kan du använda den andra pincett för att ta tag i bröstfenan från sin bas, inklusive kroppen brosk vid basen av fenan, och lyft det av. Upprepa med den andra bröstfenan. Ibland kommer hjärtat ut med bröstfenorna, så pröva dessa bitar för att se hjärtat inte är ansluten innan du slänger dem.
OBS: Vid det här laget bör hjärtat vara synlig, fortfarande intakt och ansluten till den återstående fiskhuvudet (men ibland det lossnar med bröstfenorna). Hjärtat kan identifieras genom sin form, sin rosa färg och dess väsen omges av pigmenterad hjärtsäcken. Eftersom dödshjälp av fisken sker snabbt, kan nyligen euthanized fisk hjärtan fortfarande slå slowly. - Släpp fiskhuvudet med de första pincett, så att båda händerna håller pincett och är gratis. Använd båda pincett för att retas hjärtat bort från hjärtsäcken. Tag i hjärtat genom återstoden av de dorsala aortan medan resterande perikardium dras bort.
OBS: Oavsett om fast eller färsk, är hjärtat robust för skonsam dra medan den omgivande bindväven är sprödare. Därför kan alla omgivande perikardiell vävnad dissekeras bort med hjärtat kvar intakt. - Släng överblivna fisk kadavret i biohazard påsen.
4. Förbered Hjärta för nedströms Applications
- Använd pincett, ta tag i hjärtat vid kanten av den dorsala aorta / bulbus arteriosus och placera hjärtat i den friska maträtt av 1x PBS. Alternativt kan du använda en överföringspipett. Flytta hjärtat och tillbaka i PBS cirka 10x att tvätta bort så mycket blod som möjligt.
- För applikationer där det är viktigt att ta bort alla possible blodkroppar, tvätta i en 9 cm petriskål med 15 ml lyseringsbuffert i stället för PBS, med samma back-och-tillbaka rörelse. Om bevara strukturen av hjärtat är inte viktigt för nedströms ansökan (t.ex. gör RNA), använd pincett eller microscissors att öppna hjärtat hålrum och underlättar sköljning iväg av blodkroppar.
- För applikationer där separata hjärtkammare är önskvärda, använd pincett eller microscissors att dissekera bulbus arteriosus, atrium och ventrikel från varandra.
- Överför hjärtat, eller separata kammare, i destinationsbuffert på is.
OBS: Vanliga destinationer inkluderar buffertar för cell dissociation, 4% paraformaldehyd, eller Trizol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna metod kan en vuxen zebrafisk hjärta dissekeras på mindre än 1 minut, jämfört med över 5 min med traditionella metoder åtta. Hjärtan dissekerade med denna metod är tillförlitligt intakt (Figur 2A), medan traditionella metoder 8 kräver styckning blint in i hjärtsäcken och därmed ofta orsaka skada eller förlust av förmaket eller bulbus arteriosus (Figur 2B). Hjärtan dissekerade bibehålla sin strukturella integritet och är lämpliga för histologi (Figur 2C), elektronmikroskopi (figur 2D), liksom för tillämpningar där hjärtat dissocieras eller pulvriseras. I våra händer, från en dissektion av 50 hjärtan under loppet av en veckas experiment, var 50 hjärtan erhölls strukturellt intakta. Vi lärde också denna teknik till en kollega i laboratoriet som inte hade någon erfarenhet av zebrafisk dissektion. 9 av 9 hearts dissekerade av nybörjare kollega var också strukrellt intakt. Denna dissektion metod är lämplig för ungdomar äldre än 1 månad gamla, och för vuxna i alla åldrar.
Figur 2. Dissekerade hjärtan är intakta och behålla arkitektoniska integritet. (A) På mindre än 1 minut, en vuxen zebrafisk hjärta med en intakt atrium (A), kammare (V), och bulbus arteriosus (BA) kan skäras ut från en avlivas fisk. (B) Traditionell vuxna zebrafisk hjärta dissektioner ta längre och även när man är försiktig, riskerar att skada. Här är bara ventrikeln intakt. (C) Ett hjärta dissekerat från ett Tg (myl7 dsRed) vuxna fiskar bibehöll sin strukturella integritet för användning i histologi. Atrium (A), kammare (V), och bulbus arteriosus (BA) ses, och ännu mindre strukturer som atrioventrikulärt ventilen (AV, pil) och utflöde (OFT, pil) är intakta. (D) </ Strong> Elektronmikroskopi av en dissekeras vildtyp vuxna hjärta visar att sarkomerer förblir oskadad genom dissektion processen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan metoder för att dissekera den vuxna zebrafisk hjärta har beskrivits, var dessa metoder tidsödande och ofta orsakat skador på hjärtat under dissekering. För att utföra experiment där ett stort antal vuxna hjärtan kan behövas, och / eller när man undviker nedbrytning av hjärtvävnad är viktigt för tillämpningar efter, är orimlig den tid som krävs med traditionella dissektion tekniker. På samma sätt är viktigt för studier av hjärtstruktur och för immunhistokemiska och mikroskopimetoder reproducerbart erhålla oskadade, intakta hjärtan. Vi fann att även i händerna på nybörjare, var 100% av hjärtan dissekerade återvinnas strukturellt intakta. Sammantaget metoden för vuxna hjärt dissektion presenteras här presen ett framsteg inom teknik som utökar användningen av vuxna zebrafisk för en mängd av nuvarande och framtida tillämpningar, inklusive användning i hjärtskada och regenereringsexperiment.
Det finns flera viktiga steg wnom detta protokoll. Först, beroende på experimentet som de zebrafisk hjärtan krävs, är det viktigt att skölja hjärtan så mycket som möjligt från blodceller. Exempel på experiment som skulle gynnas av att ta bort blodceller inkluderar återvinning av hjärtan för RNA-Seq, där förekomst av blod kommer att förändra genuttrycksprofilerna, eller för FACS sortering, där blodkroppar kan vara svåra att sortera från hjärtmuskelceller. Efter fisken avlivas med Tricaine eller is, är det viktigt att decapitate fisken snabbt och tillåta blödning inträffa att hjälpa till att befria hjärtat av överskott av blod. Om en intakt hjärta inte krävs för den planerade experimentet, kan det vara till hjälp att skära förmaket och kammaren öppen när i PBS för att ytterligare skölja ur blodet. Lyseringsbuffert kan också användas i stället för PBS.
För det andra, såsom nämnts ovan, ibland hjärtat lossnar med en av bröstfenorna stället för att förbli fäst till huvudet. Därför drar bröstfenornaoff under mikroskopet så att hjärtat kan identifieras. Slutligen när dissekera hjärta bort från omgivande hjärtsäcken, försök inte att förstå själva hjärtat; istället, ta tag två bitar av hjärtsäck och dra dem båda bort från hjärtat, som har mer strukturell integritet än den spröda hjärtsäcken. På detta sätt kan till och med minimal skada på hjärtat undvikas.
Hjärtat ska vara lätta att identifiera genom sin form och sammandragningar. Som ett ytterligare stöd i att hitta hjärtat, kan man dissekera ett hjärta som uttrycker ett fluorescerande protein under ett fluorescens dissekera mikroskop. Detta är oftast inte behövs men kan vara användbart för nybörjare och / eller för dissektioner av mycket små hjärtan.
En begränsning med denna teknik är att dissekera hjärtan från småfisk, dvs yngre än 3 veckor gamla, är svårt; andra tekniker har utformats för larv dissektioner 9. Också, medan det är lätt att dissekera bulbus enrteriosus, atrium, och ventrikeln från varandra, är det inte möjligt att dissekera den atrioventrikulära ventilen på egen hand. Ventilen förblir fäst till ventrikeln i de flesta fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
