Abstract
Geliştirme, rejenerasyon okuyan ve hastalık hücre ayrışma ve RNA, DNA ve protein saflaştırılması için erişkin kalplerinde kullanımına doğru genişleyen için zebra balığı model sistem kullanımı. Bu uygulamaların hepsi düzenleyici geni, metabolik ve ölümden sonra başlar diğer değişiklikleri önlemek için zebrabalıkları kalplerin önemli sayıda hızlı iyileşme talep. Yetişkin zebrabalıkları kalpler de mutantların çeşitli kalp yapısını incelemek için ve kalp rejenerasyonu çalışmak için gereklidir. Ancak, geleneksel Zebra balığı kalp diseksiyon yavaş ve zor ve yetişkin zebrabalıkları kalplerin büyük ölçekli diseksiyonu sıkıcı hale özel araçlar gerektirir. Geleneksel yöntemler de diseksiyonu sırasında kalp zarar riskini barındırır. Burada, biz, hızlı, tekrarlanabilir ve kalp mimarisini koruyan yetişkin zebrabalıkları kalplerin diseksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem özel araçlar gerektirmez, Zebra balığı için ağrısızcan taze veya sabit örnekler üzerinde yapılabilir, ve bir aylık gibi genç zebrafish yapılabilir. açıklanan yaklaşım kardiyovasküler araştırma için yetişkin zebrafish kullanımını genişletiyor.
Protocol
NOT: Her zaman IACUC veya etik kurul onayı zebrafish kullanarak herhangi bir deneysel prosedür başlamadan önce yerinde olduğundan emin olun.
1. reaktifler ve kurulumu hazırlayın
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Standart zebrabalıkları kılavuzları 10 bu çözümlerin tüm tarifleri bulun.
- Yumurta 500 ml su
- Yumurta Su 0.03% Tricaine 200 ml
- 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu su, 100 ml (PBS)
- RBC Lizis Tamponu (isteğe bağlı)
- Buz üzerinde 1.5 ml mikrofüj tüpe tercih edilen hedef tamponu (sabitleyici olarak Trizol PBS, vs.)
NOT: Deri ile temas halinde Fiksatif ve Trizol zehirlidir. Bu maddelerin tutarken eldiven giyin.
- Diseksiyon kurulumu hazırlayın:
- Mikroskop üzerinde boyun ışık kaynağı yerleştirin. Diseksiyon mikroskop sahnede 9 cm Petri kabı kapağını yerleştirin ve içine 1x PBS ince bir tabaka dökmeko (çanak kendisi kolay bir diseksiyon için çok derin olduğu için kapak kullanılır).
- Diseksiyon kapsamı yakın tezgah üzerinde Petri kabı kendisi (değil kapak) yerleştirin ve o 1x PBS yaklaşık 15 ml dökün. Diseksiyonu sonrası kalbi yıkamak için kullanın. Alternatif olarak, RBC Lizis Buffer kullanın.
- Yer jilet, iki forseps, microscissors (isteğe bağlı) çiftleri, ve mikroskop yanında bir transfer pipet. Hızlı soğutma ile ötanazi seçilirse, bir buz kabı elde edilir.
- Tricaine ile ötanazi seçilirse, 250 ml'lik bir cam kabın içine yumurta su içinde% 0.03 Tricaine 200 ml dökün. Zebra balığı karkasların imhası için küçük bir biyolojik tehlike çanta hazırlayın.
2. Zebra balığı hazırlayın
- Sabit balık için, mikroskop kurulum, PBS içinde durulanır sabit balık, getir.
- > 10 dakika boyunca buz ile hızlı soğutma ile bütün yetişkin zebrafish öldürülür.
- Periton üzerinde deri bir delik yapmak için forseps kullanın(Kalp uzak) fiksatif nüfuz etmesini sağlamak ve daha sonra, 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile düzeltme Tampon 10 içinde% 4 paraformaldehid içinde koymak.
- Alternatif olarak, taze balık için yer balık küçük tutma tankında ötenazi edilecek ve mikroskop kurulum getirmek. Bireysel tesisin balık protokolü ve disseke balık kalpleri için mansap kullanımları bağlı, Tricaine ile balık uyutmak veya dekapitasyon önce hızlı soğutma ile euthanize.
- Balık durana kadar, buzlu suda balık net ve yerinde yaklaşık 5 dk bir balık pick up, buz kullanmak için.
- Alternatif olarak, solungaç hareketleri durana kadar çözümün beher balık ağı ve yer ile bir balık pick up, Tricaine kullanmak için.
- Hızla kuyruk yüzgecinin tarafından ötenazi balık almak ve 1x PBS ile doluydu Petri kabı kapağındaki yan yatıyordu. Razo kullanırken, bir yandan bir göğüs yüzgeci kaldırmak için forseps kullanınr bıçak sadece göğüs yüzgeci (Şekil 1A) bağlanması için posterior, diğer elinizle balık başını kesmek için. Mikroskop aracılığıyla bakarak ya da sadece doğrudan mikroskop sahnede balık görselleştirerek ya bu adımı gerçekleştirin.
NOT: Taze ötenazi balık hala dekapitasyon sonra kanayacak.
Şekil 1. Zebra balığı kalp diseksiyon yetişkin zebrabalıkları anatomik yerlerinden kullanır. (A), balık başını kesmek bir forseps ile göğüs yüzgeci kaldırın ve gösterildiği gibi kırmızı noktalı çizgi boyunca keskin, temiz jilet kullanmak için. (B), balık kafası kararlı balık ağzı süre forseps bir tine yerleştirmek için Diğer tine göz genelinde yatıyor, ve ventral yüzeyi yukarı ve forseps iki dişler Petri kabı dibine kararlı olduğunu böylece daha sonra balık kafasını çevirin. (C) serbest forc kullanıneps operculum'un (ok). (D) bu Kaldırma eki kesmek için, dorsal aort lümen kan (ok) gösteren bir pembe şeritli beyaz bir yapı olarak görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Kalp teşrih
- Mikroskop altında balık kafası gözünüzde canlandırın. Diğer tine göz (Şekil 1B) karşısında, baş dışında iken bir forseps ile, beynin aracılığıyla, balık ağızda forseps bir tine koyarak balık başını kararlı. Forseps iki dişler petri alt karşı kararlı olduğundan emin olun. Balık kafasını bu şekilde tutarak, ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde olmalıdır.
- Diğer elinizle, vücudun (Şekil 1C ok) için operculum'un ventral eki kesmek için ikinci forseps kullanabilir. Forseps ile biraz bu kaldırma dORSAL aort aort lümen (Şekil 1D ok) kan kırmızı şeritli beyaz bir yapı olarak altında görünecektir. Aort kısma ve yukarı doğru çekerek forseps ile dorsal aorta kesin; Alternatif olarak, sırt aorta kesmek için Microscissors kullanır.
- Şimdi, fin dibinde vücut kıkırdak dahil olmak üzere, tabanından göğüs yüzgeci kavramak için ikinci forseps kullanımı, ve bu kaldırın. Diğer göğüs yüzgeci ile tekrarlayın. Bazen, kalp göğüs yüzgeçleri ile geliyor, bu yüzden kalp onları atılmadan önce takılı olmadığından emin olmak için bu parçaları incelemek.
NOT: (zaman zaman göğüs yüzgeçleri ile kapalı geliyor olsa da) bu noktada, kalp, görünür hala bozulmamış ve kalan balık kafasına bağlı olmalıdır. Kalp şekli, onun pembe renk ve pigmentli perikard ile çevrili varlık tarafından tespit edilebilir. Balık ötenazi hızla yapılır, çünkü taze balık ötenazi kalpleri hala SLO yenerek olabilirWLY. - Her iki el forseps tutun ve ücretsiz böylece, ilk forseps ile balık kafa gidelim. Uzakta perikarttan kalp kızdırmak için her iki forseps kullanın. Kalan perikard uzak çekilirken dorsal aorta geri kalan kalbi kavrayın.
NOT: Sabit veya taze olsun, kalp çevreleyen bağ dokusu daha gevrek iken çekerek nazik sağlam olduğunu. Bu nedenle, herhangi bir çevreleyen perikard dokusu bozulmamış kalp kalan uzak disseke edilebilir. - Biohazard çanta içinde kalan balık karkas atın.
4. Alt Uygulamaları için Kalp hazırlayın
- Forseps kullanarak, dorsal aorta / bulbusu arteriosusun kenarında kalp kavramak ve 1x PBS taze çanak kalp yerleştirin. Seçenek olarak ise, bir transfer pipeti kullanılır. Ileri ve geri PBS içinde kalp Taşı yaklaşık 10x mümkün olduğunca çok kan yıkayacak için.
- Uygulamalar için her possib kaldırmak için önemli olduğule kan hücreleri, aynı arka ve ileri-hareketi ile yerine 15 ml PBS RBC Lizis Tamponu ile 9 cm'lik bir Petri kabındaki yıkayın. Kalbin yapısını koruyarak (örneğin, RNA yapma), kalp boşluğunu açın ve uzak kan hücrelerinin durulama kolaylaştırmak için forseps veya Microscissors kullanmak alt uygulama için önemli değilse.
- Ayrı kalp odaları istenilen edildiği uygulamalar için, birbirinden bulbusu arteriozus, atrium ve ventrikül incelemek için forseps veya Microscissors kullanın.
- Buz üzerinde hedef tampon kalp, ya da ayrı ayrı odaları, aktarın.
NOT: Ortak hedefler hücre ayrışma,% 4 paraformaldehid veya Trizol için tamponlar bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem kullanılarak, bir yetişkin, zebra balığı, kalp, geleneksel yöntemler kullanılarak 8 üzerinde 5 dakika ile karşılaştırıldığında, en az 1 dakika içinde parçalara edilebilir. Geleneksel yöntemler 8 perikard içine körü körüne kesme ve bu nedenle yaygın atrium veya bulbus arteriozus (Şekil 2B) hasar veya kaybına neden gerektirir ise, bu yöntem kullanılarak disseke Kalpler, (Şekil 2A) güvenilir sağlam. Parçalara Kalpler yapısal bütünlüğünü korumak ve histoloji (Şekil 2C), elektron mikroskobu (Şekil 2D) için uygun olan ve aynı zamanda kalp çözülmüş veya pulverize uygulamalar içindir. Bizim ellerde, bir hafta deneyler boyunca 50 kalplerin bir diseksiyonu, 50 kupa yapısal sağlam elde edilmiştir. Biz de Zebra balığı diseksiyon ile hiçbir deneyimi vardı laboratuarda bir meslektaşım bu tekniği öğretti. Acemi arkadaşı tarafından disseke 9 kupa 9 üzerinden ayrıca struc edilditurally sağlam. Bu diseksiyon yöntemi daha eski 1 aylık gençler için ve her yaştan yetişkinler için uygundur.
Şekil 2. Dissected kalpleri sağlam ve mimari bütünlüğünü korumak. 1 dakikadan daha az, sağlam bir atrium (A), ventrikül (V), ve bulbus arteriosus (BA) ile bir yetişkin zebrabalıkları kalbinde (A) ötenazi balık disseke edilebilir. (B) Geleneksel yetişkin zebrabalıkları kalp diseksiyonu uzun sürer ve dikkat bile, hasar riskini çalıştırın. Burada, sadece ventrikül sağlam. (C), bir Tg (myl7 DsRed), yetişkin balık kesilmiş bir kalp histoloji kullanılmak üzere yapısal bütünlüğünü korumuştur. atrium (A), ventrikül (V), ve bulbus arteriosus (BA) görülür ve atriyoventriküler vana (AV, ok) ve çıkış yolu gibi daha küçük yapılar (OFT, ok) sağlam. (D) </ Strong> disseke yabani tip yetişkin kalp Elektron mikroskobu sarkomer diseksiyon işlemi ile hasarsız kalır göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin zebrabalıkları kalp kesme yöntemleri tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yöntemler zaman alıcıdır ve genel olarak Diseksiyon sırasında kalbin hasar görmesine neden oldu. Yetişkin kalpte çok sayıda gerekli olabilir deneyleri gerçekleştirmek için, ve / veya kalp dokusu bozulmasını önlemek alt baş uygulamalar için önemli olduğunda, geleneksel diseksiyon teknikleri kullanılarak gereken süre engelleyicidir. Benzer bir şekilde, yeniden üretilebilir, hasarsız sağlam kalpleri elde kalp yapı çalışmaları için immünohistokimyasal ve mikroskop yöntemleri için önemlidir. Biz bile başlayanlar elinde, disseke kalplerin% 100 yapısal sağlam elde edildi bulundu. Genel olarak, burada sunulan yetişkin kalp diseksiyon yöntemi kalp yaralanması ve rejenerasyon deneylerde kullanılmak dahil olmak üzere mevcut ve gelecekteki uygulamalar, çeşitli yetişkin zebrafish kullanımını genişleten tekniği bir avans sunuyor.
W birkaç kritik adımlar vardırBu protokol ithin. İlk olarak, zebra balığı kalpler gerekmektedir olan deneye bağlı olarak, bu kan hücreleri mümkün olduğunca çok kalpleri durulanması önemlidir. Kan hücrelerinin çıkarılması yararlanacak deneylerin örnekleri arasında kan bulunması gen ekspresyon profillerinin değiştirilmesi, ya da kan hücrelerini, miyokard hücrelerinden sıralamak için zor olabilir sıralama FACS için olacak RNA sekansına için kalpler kurtarılmasını içerir. Balık Tricaine veya buz ile ötenazi sonra, hızla balık başını kesmek ve aşırı kan kalp kurtulmak yardımcı olmak için ortaya kanama izin önemlidir. Sağlam bir kalp planlı bir deney için gerekli değilse, bu PBS daha kan dışarı durulama zaman atrium kesmek ve açık ventrikül yardımcı olabilir. RBC parçalama tamponu yerine de PBS kullanılabilir.
Yukarıda belirtildiği gibi İkincisi, bazen kalp yerine kafasına bağlı kalıyorum daha göğüs yüzgeçleri biri ile çıkıyor. Bu nedenle, göğüs yüzgeçleri çekinMikroskop altında, kalp tespit edilebilir, böylece. Uzakta perikard çevredeki kalp diseksiyon Son olarak, kalbi kendisini kavramak için değil deneyin; yerine, perikard iki adet kavramak ve gevrek perikard daha yapısal bütünlüğe sahip kalp, onları uzak hem çekin. Bu şekilde, kalp daha az zarar önlenebilir.
Kalp şekli ve kasılmalar kolayca tanımlanabilir olmalıdır. Kalp bulmakta ilave bir yardım olarak, bir flöresanlı bir mikroskop altında bir flüoresan proteini ifade eden bir kalp incelemek olabilir. Bu genellikle gerekli değildir, ancak başlangıç için ve / ya da çok küçük kalplerin disseksiyonlarında yararlı olabilir.
Bu tekniğin bir sınırlama küçük balıklar, yani, daha genç 3 haftalık kalpleri diseksiyon, zor olmasıdır; Diğer teknikler, larva disseksiyonlarında 9 için özel olarak tasarlanmıştır. Kolay iken Ayrıca, bulbus a incelemek içinbirbirinden rteriosus, atrium ve ventrikül, kendi üzerine atriyoventriküler valfi incelemek mümkün değildir. Valf çoğu durumda ventrikülde bağlı kalır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6 (5), 109 (2008).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 36-45 (2007).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 122-131 (2013).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
