Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

Introduction

O nervo óptico oferece uma localização ideal para o sistema nervoso central (SNC) de pesquisa regenerativa incluindo condições oftalmológicas como a neurite óptica, glaucoma e trauma. As injecções de uma variedade de células estaminais quer demonstraram eficácia ou mostraram-se promissores na substituição de mielina perdido, aumentando a contagem axonal e / ou prevenção de doenças degenerativas. ^1,2

O nervo óptico humano contém aproximadamente 1,2 milhões de axónios que viajam paralelas da retina para o quiasma com um diâmetro de cerca de 3,0-3,5 mm. ³ Para modelar doenças humanas em laboratório, o rato tem sido utilizado frequentemente. O nervo óptico de rato adulto contém cerca de 100.000 axónios dentro de um diâmetro de aproximadamente 0,5 mm. ⁴ Uma das principais limitações na pesquisa no SNC regenerativo é desossada acesso directo. As complicações e riscos cirúrgicos para o animal são maiores quando o crânio ou vértebras são removidos. Similar aos benefícios deabordagens minimamente invasivas da coluna vertebral, ⁵ injeções diretas do nervo óptico sem abrir o crânio de oferta reduzida complicações e uma recuperação mais rápida.

Esta técnica tem sido utilizada em estudos anteriores. ⁶ Neste manuscrito e vídeo acompanhante, que demonstram um procedimento minimamente invasivo para injectar células estaminais no nervo óptico de rato.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Johns Hopkins. Aparelhos de anestesia exigir uma inspecção anual e calibração, se necessário.

1. Anestesia e Posicionamento

1. Anestesia.
   1. Execute todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia com isofluorano 2-3%. Confirme nível adequado de anestesia por pitada dedo do pé e taxa de respiração. Verifique se o rato não se mexe em resposta a uma pitada dedo do pé.
      NOTA: Um vacilo indica anestesia que é tarde demais e pode exigir anestesia mais longos antes de iniciar ou uma concentração de isofluorano superior. A taxa de respiração inferior a 1 respiração cada 2 s é muito lento o que indica anestesia é demasiado elevada e pode exigir um aligeiramento da concentração de isofluorano.
   2. Prenda o animal como necessário para evitar o movimento da cabeça durante o procedimento. Coloque uma gota de lidocaína no olho cirúrgico. Use lágrimas artificiais a cada 10 minutos para evitar a secura sob anestesia. Daruma injecção de buprenorfina a 0,01 mg / kg SC pré-operatório e em seguida cada 6-8 horas, conforme necessário.
2. Posicionamento.
   1. Coloque ratos em um quadro estereotáxico e manter aquecido com uma almofada de aquecimento. Molhar a pele do couro cabeludo com álcool tendo o cuidado de evitar a exposição sobre os olhos. Use ferramentas estéreis e técnica estéril para minimizar o risco de infecções pós-operatórias.

2. Controle dos olhos

1. Coloque um fio de sutura 4-0 na conjuntiva lateral e amarrá-lo com sutura suficiente para permitir tração suave.

3. Dissecção

1. Dissecção inicial.
   1. Adicione uma incisão ~ 1 polegada na pele que recobre o cume orbital usando um bisturi tamanho 10, como mostrado na Figura 1. Retirar a pele e fáscia subjacente e cuidadosamente dissecar longe do painel frontal. Para evitar sangramento excessivo no cirúrgico, evitar o corte vasos sanguíneos enquanto dissecando a fáscia. Use estrategicamente placed pontas de algodão para proporcionar hemostase.
2. Dissecção mais profundo.
   NOTA: Com tração suave na conjuntiva puxando o olho para baixo e para fora do soquete, o músculo orbital superior entrará em vista. A fim de expor o nervo óptico, este deve ser cortado do músculo e gordura retro-orbital removido. A gordura pode ser descartado e não deve ser substituído após a injecção. A partir deste ponto, a fáscia nervo óptico deve ser visível como um feixe do nervo óptico em si, juntamente com os vasos sanguíneos envolvidos na dura-máter (Figura 1).
   1. Fazer uma pequena incisão na dura usando o bisturi ou com uma agulha de calibre 31 chanfrada para fazer a perfuração menos traumática.

4. Pipeta Injector

1. Retire uma micropipeta de vidro para um diâmetro de 50-100 um. Para garantir a estabilidade da montagem, a micropipeta em um micromanipulador e se ligar a uma seringa de Hamilton ligada a uma bomba de infusão.
2. Puxe as contas (ou células-tronco)reconstituída num volume de 0,5-1,0 mL na micropipeta retrógrada juntamente com o volume de 0,5 ul de uma solução de metil azul antes e depois.
   Observação: Uma taxa de infusão definida para 0,5-2 mL por min impede trauma para o nervo óptico.

5. Injeção

1. Diminuir a ponta da micropipeta para o nervo óptico logo acima da dura-máter entalhado.
   NOTA: Uma pequena, mas rápido movimento da ponta de vidro nos resultados do nervo óptico em menos danos. À medida que a bomba de infusão inicia, o corante azul de metilo deve destacar a área do nervo óptico injectado. O corante deve permanecer localizada dentro do nervo óptico sem vazando no espaço subaracnóide.
2. Seguir a segunda banda de azul de metileno para determinar quando a injecção de células estaminais é completa e ligar a bomba de infusão fora como a segunda dose de azul de metileno é injectado. Manter a micropipeta ainda dentro do nervo óptico durante 2 min para cada volume de 1 mL injectada no para prevenir altaejeção de pressão após a retirada da micropipeta.
   NOTA: Uma abordagem alternativa é conectar a ponta da pipeta a uma seringa cheia de ar que pode ser manipulado manualmente. De qualquer maneira, evitar força excessiva para minimizar o dano para os nervos ópticos. Recomendamos injetando não mais de 2 l de volume, em cada nervo óptico.

6. Acompanhamento

1. Immediate.
   1. Quando a injecção estiver concluída, remova a micropipeta, juntamente com todas as pontas de algodão usados ​​para fornecer hemostasia. Suturar a pele com seda 3-0 e remova o fio de sutura conjuntival.
   2. Mantenha ratos quente sobre uma almofada de aquecimento até que eles emergem da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
   3. Se o animal está exibindo sinais de dor excessiva, incluindo letargia, ataxia, ou trabalharam breathing, administrar analgesia adequada com buprenorfina intramuscular (0,05 mg / kg) até três vezes ao dia.
2. Longo prazo.
   1. Para a próxima 24-48 h, observe o rato por complicações da cirurgia, incluindo inchaço ou secreção da ferida ou outros sinais de dor, como vocalização, aparência curvada, não-aliciamento, ou não comer. Considere consulta com um veterinário ou a eutanásia ético, conforme necessário.

Representative Results

Na conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados e perfundidos com paraformaldeído a 4%. Os nervos ópticos foram cuidadosamente dissecados e montados para seccionamento criostático. A Figura 2 mostra um exemplo de um nervo óptico de rato inteiro com baixa potência, em que o corante azul de Evans foi injectada a fim de visualizar o local. A seta identifica a localização precisa da injecção. Esta dissecção foi realizada dentro de alguns minutos da injecção, tal como indicado pela difusão restrita do corante para o nervo. Em outras injeções, temos observado uma lenta difusão de corante para o quiasma ao longo de várias horas.

Figura 1:. Campo cirúrgico de vista O rato é posicionado com a acessar o olho esquerdo nesta figura. Uma incisão é feita acima do cume orbital ea fascialtecido é dissecado para baixo por trás do olho. Uma sutura conjuntival permite que o operador aplica tracção suave que puxa o nervo óptico sem intracraniana em vista a abertura do crânio.

Figura 2:. Dissecção macroscópica do nervo óptico injectado Utilizando corante azul de Evans, o local da injecção no nervo óptico pode ser grosseiramente visualizados sob um microscópio de dissecção. Nesta imagem, o nervo óptico foi cortado no local da injecção para mostrar o corante incorporado no interior do tecido do nervo óptico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lewis rat	Charles River	4	Any rat strain will work.
Anesthesia machine	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount
Infusion pump	Stoelting	53129
Dissection microscope	National Optical	409-411-1105
Fiber-optic light source	Fisher Scientific	12-562-21
Dissection and Stereotaxic Instrument	Stoelting	51400
Pipette Puller	Kopf	750
Pipettes	World Precision Instruments	18150-6
Disposable scalpel blades	Harvard Apparatus	810-15-021
Iridectomy scissors	Electron Microscopy Sciences	Uniband LA-4XF