Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genom-dækkende protein-protein-interaktion Screening af protein-fragmentet Komplementering Assay (PCA) i levende celler

Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52255
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Département de Biologie, Institut de biologie intégrative et des systémes & PROTEO, Université Laval
* These authors contributed equally

Introduction

Protein-interaktion netværk (PIN-koder) tilbyder en lav opløsning kort over, hvordan proteiner funktionelt organiseret i cellen 1. Hver fysisk forbindelse mellem to proteiner eller protein-protein-interaktion (PPI), kan udgøre en forening, der er stabil i tid, såsom dem, der findes inden for protein-komplekser, og at bidrage til den strukturelle organisation af cellen. Disse forbindelser kan også repræsentere forbigående foreninger, der regulerer den pågældende aktivitet, stabilitet, lokalisering og interaktioner mellem de to partnere. Identifikation af fysisk interaktion partnere i et givet protein giver derfor rig information om funktion og regulering af dette protein 2,3. Af disse grunde har store indsats sat mod kortlægning af pinkoder i model organismer, herunder Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13 Caenorhabditis elegans 14 og Homo sapiens 15. Disse undersøgelser har givet vigtig indsigt i, hvordan proteiner er organiseret i cellen og dermed centrale oplysninger om proteiner med hidtil ukendte funktioner.

Adskillige strategier er blevet udviklet gennem årene til at studere PIN-koder. Disse teknologier kan groft inddeles i tre kategorier baseret på den form for oplysninger, de giver om PPI (revideret i 16-18). Den første er baseret på gær-to-hybrid og dets derivater 19. Disse teknologier giver oplysninger om den direkte forbindelse mellem par af proteiner, som gør det muligt at konstruere binære netværk. Den anden familie er baseret på affinitetsoprensning af agn proteiner og identifikation af deres tilknyttede partnere, såsom affinitetsrensning efterfulgt af massespektrometri 20. Disse tilgange identificere grupper af proteiner, der er direkteeller indirekte er forbundet, generelt på en stabil måde, og er ekstremt stærke til at identificere protein-komplekser. Den tredje tilgang er baseret på protein-fragment komplementeringsgrupper assays (PSA) 11,21. Denne fremgangsmåde giver en mellemliggende niveau af opløsning mellem de to tidligere strategier, da det giver mulighed at opdage direkte og proksimale associationer mellem proteiner. Hver teknik har sine egne styrker og svagheder, som for nylig revideret 18.

Den bedste beskrevne eukaryote PIN er langt den ene af den knopskydende gær Saccharomyces cerevisiae, delvis fordi dens proteom er relativt mindre kompleks end de andre model eukaryoter og fordi high-throughput assays til påvisning af PPI først er blevet analyseret og er mere effektivt implementeret i denne model organisme 9-12. En særlig effektiv metode til gær system er dihydrofolatreduktase-protein-fragment-komplementationsassay (DHFR-PCA), et assay, der har væretbruges i forskellige sammenhænge at studere gær PIN i standard og forstyrret forhold 11,22-26. Denne metode er baseret på en overlevelse assay, der muliggør påvisning af direkte og nær-direkte PPI for en given agn protein ved både endogene ekspressionsniveauer og native subcellulære lokaliseringer af interaktion partnere 11,21 på en kvantitativ måde 27. Signalet opnået under anvendelse af dette assay (dvs. koloni størrelse på high-density koloni arrays) afspejler således mængden af protein komplekser dannet mellem agn og byttedyr i et cellulært miljø næsten svarer til en af vildtypeceller. Assayet er baseret på rekonstitution af en reporter enzym involveret i folatmetabolismen, dihydrofolatreduktase (DHFR), hvorved to komplementære fragmenter af DHFR, som er fusioneret til de to proteiner af interesse bringes i nærhed, når de to proteiner interagerer, som igen fører til den reversible rekonstituering af enzymaktivitet 11 og væksten af stammen på et medium indeholdende methotrexat (MTX; figur 1). Denne forbindelse inhiberer den endogene DHFR-enzym, men ikke det muterede der anvendes i assayet 28. To samlinger af PCA-stammer, hvoraf det ene indeholder ~ 4.300 MATa stammer med en ORF fusioneret til DHFR F [1,2] fragment og en med ~ 4.800 MAT α stammer med en ORF fusioneret til DHFR [3] fragment, kan købes til implementere DHFR-PCA på små eller stor skala i alle laboratorier. Her beskriver vi en generel, men detaljeret protokol til screening for PPI mellem en agn protein og ~ 4.800 prey-proteiner ved hjælp af denne analyse.

Protocol

1. Konstruktion / verifikation af Bait stammer

  1. Hvis agn stamme af interesse findes i MATa DHFR F [1,2] indsamling, hente det fra samlingen som beskrevet i trin 1.1.1, ellers konstruere stamme som beskrevet i trin 1.1.2.
    BEMÆRK: Den her beskrevne protokol bruger en DHFR F [1,2] stamme som en lokkemad og DHFR F [3] samling som byttedyr, da denne samling indeholder flere stammer end DHFR F [1,2] samling. Det er imidlertid muligt at udføre skærmen den anden vej rundt, hvis agnen stamme er kun tilgængelig i DHFR F [3] indsamling eller i begge orienteringer, hvis man kræver større dækning af interactome.
    1. Optøs glycerol stock plade, der indeholder lokkemad stamme på is i en time. Steriliser aluminiumsfolie dækker pladen ved anvendelse af 95% ethanol. Pierce folien med en steril spids, pipette op og ned for at opblande cellerne og stribe 2-3 pi glycerolstamopløsning på selektiv gærekstrakt peptondextrose (YPD) + 100 ug / ml nourseothricin (NAT) for at isolere enkelte kolonier. Inkuber i to dage ved 30 ° C.
    2. Opførelse af en agn PCA stamme (MATa DHFR F [1,2]).
      1. Brug high-fidelity polymerase og en standard-PCR-protokol, forstærke DHFR F [1,2] kassetten fra plasmid pAG25-linker-DHFR F [1,2] -ADHterm anvendelse af oligonukleotider med udhængende ender homolog til de sidste 40 bp af ORF'er 3'-enden eksklusive stopkodonen (Forward primer), og de ​​første 40 bp af genets 3'-UTR (reverse primer) (figur 1A).
      2. Omdan PCR-produktet ind i kompetente gærceller (sædvanligvis i en BY4741 stammen) ved anvendelse af standard LiOAc / PEG gærtransformation protokol som i 29 (figur 1A).
      3. Plade på selektiv YPD + Nat medium at isolere positive transformanter.
      4. Udfør en diagnostisk koloni PCR på isolerede kolonier for at bekræfte den korrekte DHFR F [1,2] fusion. Brug PRimers annealing 1) i det gen-kodende sekvens (Forward oligo) omkring 100 bp opstrøms for DHFR fusion og 2) i den ADH terminatoren af kassetten (Reverse oligo) (figur 1B).
      5. Sekventere PCR produkt ved Sanger sekventering for at bekræfte korrekt genfusion.
      6. Arkivere bekræftet agn stamme i 25% glycerol ved -80 ° C.
        BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette trin.

2. Pin-tool sterilisering og udskrivningsprocedurer

BEMÆRK: sterilisation nedenstående procedure blev optimeret til pin-værktøjer manipuleret af BM3-BC (S & P Robotics) robot platform, men kan tilpasses til andre platforme også. Dette afsnit beskriver de Pin-værktøjet sterilisering og udskrivning procedurer, der bruges til at overføre celler fra et miljø til et andet for resten af ​​protokollen. Interne scripts, der anvendes til at udføre disse rutiner kan fås på anmodning. Bemærk that alle trin kan udføres uden brug af en robot platform ved hjælp af en manuel pin-værktøj 30.

  1. Monter passende pin-værktøj på robot platform.
  2. Forbered rengøring og våde stationer som følger:
    1. Der tilsættes 500 ml sterilt vand i vandbadet station.
    2. Tilføj 320 ml sterilt vand i penslen station.
    3. Tilføj 380 ml 70% ethanol i sonikator når replikerende fra agarplade (86 x 128 mm omnitray indeholdende 35 ml størknet medium) til agarplade, eller 400 ml, når replikerende fra en mikrotiterplade indeholdende flydende kulturer til en agarplade.
    4. Tilsættes 35 ml sterilt vand i den våde station (bestående af en steril tom omnitray).
  3. Ved begyndelsen af ​​hver dag, der kræver robot platform, sterilisere pin-værktøjer fem gange for en minutter i sonicatorbad. I mellemtiden tænde UV-lampen i fem minutter for at sterilisere robotten kabinet.
    BEMÆRK: Dette er ikke påkrævet, hvis røveOT til huse under en steril hætte.
  4. Mellem hver pin værktøj replikation runde, sterilisere pin værktøjet som følger:
    1. Soak pin-værktøjet fem gange i 10 sek i vandbad station at fjerne celleklumper.
    2. Soak pin-værktøjet to gange frem og tilbage i børsten station.
      BEMÆRK: Den roterende børste fjerner resterende celler.
    3. Soak pin-værktøjet to gange i 20 sekunder i sonikator station.
      BEMÆRK: Resterende celler på stifterne vil blive fjernet ved sonikering eller dræbt af ethanol.
    4. Sørg for, at dyppe dybde af stifterne stiger på hver efterfølgende bad for at sikre korrekt sterilisering.
  5. Tør pin værktøj i lufttørrer station for 25 sek.
  6. Før du tager celler på kilden plader, våd stifterne i den våde station, som indeholder 35 ml sterilt vand i en omnitray.
  7. Dyp stifterne to gange i kolonierne fra kilden plade.
  8. Udskriv på en frisk hældes destination plade ved at trykke på agar overflade to gange (i det følgende benævnt virkningen af ​​"udskrive" et array).

3. Kondensering af DHFR F [3] Samling i 1.536 Arrays anvendelse af en automatiseret Robotic Platform

  1. Thaw på is DHFR F [3] samling (60 plader med 96 brønde) og en yderligere 96-brønds plade fyldt med L-DHFR F [3] kontrol stamme (figur 1C), som indeholder DHFR F [3] fragment og opstrøms linker udtrykt alene som en negativ kontrol.
    BEMÆRK: I princippet dette fragment ikke interagerer med nogen DHFR-fragmentet fusionsprotein (se diskussionen for detaljer).
  2. Centrifuge plader (hurtig tur) før du fjerner aluminiumsfolie at undgå risiko for krydskontaminering mellem brønde.
  3. Kondensere samling på 16 arrays af 384 stammer (figur 2A). For at gøre dette, for hver 384 array, print fire glycerol plader på de fire kvadranter af en selektiv YPD + 250 ug / ml hygromycin B (hygB) omnitray hjælp the 96 pin-værktøj (her en 384-array kan opdeles i fire lige indbyrdes afstand kvadranter, hver bestående af 96 stillinger i en 2 x 2 matrix layout). Indsæt fire 96-brønds plader indeholdende L-DHFR F [3] negativ kontrol mellem de 60 andre plader for at få et endeligt sæt af 64 plader, der netop fylder fire 1.536 arrays. Steriliser pin værktøjet mellem hver replikationscyklus som beskrevet i trin 2.
    BEMÆRK: Sæt L-DHFR F [3] plader for at få en sådan plade på hver af de fire endelige 1.536 arrays.
  4. Pladerne inkuberes i to dage ved 30 ° C. BEMÆRK: På dette tidspunkt kan DHFR samlingen opbevares i en 384-format ved 4 C i op til en måned på agarplader.
  5. Kondensere samling i fire arrays af 1.536 stammer (figur 2A). For at gøre dette, for hver 1.536 array, udskrive fire arrays af 384 stammer på de fire kvadranter af en plade af samme medium som i trin 3.2 ved hjælp af 384 pin-værktøj (her kan en 1.536-array opdeles i fire eQually indbyrdes afstand kvadranter hver består af 384 stillinger i en 2 x 2 matrix layout).
  6. Pladerne inkuberes i to dage ved 30 ° C. BEMÆRK: På dette tidspunkt kan DHFR samlingen opbevares i en 1.536-format ved 4 C i op til en måned på agarplader.
  7. Repliker de fire arrays på samme medium at standardisere kolonistørrelse hjælp af en 1.536 pin-værktøj.
  8. Pladerne inkuberes i to dage ved 30 ° C.

4. High-throughput DHFR-PCA Procedure

  1. Podes en kultur af agn stamme (DHFR F [1,2] fusion) opnået fra trin 1.1.1 eller 1.1.2 i 20 ml flydende YPD + Nat i et 50 ml rør (figur 2B).
  2. Inkuber i to dage ved 30 ° C med rystning ved 250 rpm for at tillade kulturen at nå mætning.
  3. Efter to dages inkubation pladen 5 ml af kulturen på en YPD + Nat omnitray. Lad celler adsorberes på overfladen i 5-10 min og fjern overskydende væske (figur 2B). Gentag tWice at gøre tre gentagelser.
  4. Inkuber i to dage ved 30 ° C.
  5. Udskriv agn stamme fra trin 4.3 og 4.4 på 12 YPD-plader (nok til parring fire plader af DHFR F [3] indsamling × tre replikater) med en 1.536 pin-værktøjet ved hjælp af hver celle græsplæne ikke mere end fire gange.
  6. Udskriv passende array af DHFR F [3] samling på toppen af agn celler under anvendelse af 1.536 pin-værktøj (figur 2C).
  7. Lad stammerne mate ved inkubation i to dage ved 30 ° C.
  8. Vælg diploide celler ved at udskrive kolonier på omnitrays indeholdende YPD + hygB + Nat (figur 2C).
  9. Inkuber i to dage ved 30 ° C.
  10. Gentag diploid udvalg som beskrevet i trin 4.8 og 4.9 (figur 2B).
  11. Forbered plader med medier indeholdende MTX (MTX medium) en dag før brug følge disse trin 21 (ADVARSEL:. Vær forsigtig, når du arbejder med MTX, da det er et giftigt stof Brug altid handsker, protektion briller og en kittel ved håndtering det) (Figur 2C):
    1. Forbered 10x-Lys / mødte / ade aminosyre frafald i deioniseret vand. Filtersteriliser drop-out i en steril flaske ved anvendelse af en 0,2 um sterilt sprøjtefilter, eller hvis det er nødvendigt i store mængder, en 0,2 um flaske top filtreringstragten (tabel 1).
    2. Der fremstilles en 10 mg / ml MTX stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO). Anvendes umiddelbart efter tilberedning af opløsningen og fryse resten ved -20 ° C. Beskyt mod lys, som det er lysfølsom. Må ikke fryses MTX igen efter optøning det.
    3. Forbered medierne som følger (medium ingredienser og mængder er de samme som dem, der anvendes i Tarassov et al. 11):
      1. For en liter medium, blandes i to særskilte kolber: 1) 6,69 g gærnitrogenbase uden aminosyrer og uden ammoniumsulfat og 330 ml deioniseret vand; 2) 25 g af ædle agar og 500 ml deioniseret vand.
      2. Autoclave kolber ved 121 ° C i 20 minutter.
      3. Ækvilibrer temperatur i et vandbad ved 55 ° C i mindst en time.
      4. Bland de to kolber sammen og tilsættes 50 ml steril 40% glucose, 100 ml af 10x steril drop-out, og 20 ml MTX 10 mg / ml.
      5. Hæld 35 ml (se bemærkning nedenfor), i medium i omnitrays. Lad størkne i mindst en time og en halv. Shield plader fra lys.
        BEMÆRK: Her hælde 35 ml medium pr omnitray er afgørende for at sikre lige pladetykkelse, hvilket er vigtigt for alle efterfølgende trin.
  12. Billede plader fra anden runde af diploide valg med robot platform eller med en regelmæssig digitalkamera med ensartet plade belysning. Brug disse billeder til at identificere tomme stillinger på arrays ved udførelse downstream analyse. Kontroller, at parametrene for kameraet er altid det samme, og at robotten tændes.
  13. Print diploide celler på MTX medier using af 1.536 pin-værktøj.
  14. Inkuber i fire dage ved 30 ° C i plastikposer for at forhindre udtørring.
  15. Forbered en anden batch af omnitrays indeholdende MTX medium som beskrevet i trin 4.11.
  16. Efter fire dages inkubation fosforpladerne hjælp af robot platform eller regelmæssig digitalkamera. Kontroller, at parametrene for kameraet er altid det samme, og at robotten tændes.
  17. Udfør en anden runde af MTX valg ved at kopiere cellerne på det andet parti af MTX medier.
    BEMÆRK: Dette vil reducere væksten baggrund af PCA-stammer og øge den kvantitative opløsning.
  18. Inkuber i fire dage ved 30 ° C i plastikposer for at forhindre udtørring.
  19. Billede plader som beskrevet i trin 4.16.

5. Image Analysis

  1. Analyser billeder af Colony arrays med brugerdefinerede ImageJ 31 scripts eller ved hjælp af offentliggjorte software såsom Colonizer, Ht koloni gitter analysator, Cell profiler, Colony billeder, ScreenMill, YeastXtract og gitter (udarbejdet i 32). Billedanalyse bør output en eller flere regneark, der indeholder koloni størrelser for hver position af hvert array, bruge disse koloni størrelser for alle efterfølgende analyser.
    BEMÆRK: I dette studie, brugte vi en brugerdefineret ImageJ script beskrevet i Leducq et al 33 (se diskussionen afsnittet for flere detaljer)..

6. Data Analysis

BEMÆRK: Resultater fra billedanalyse kan behandles på en tabulator som Excel eller ved hjælp af et scriptsprog som R 34. De følgende trin beskriver den procedure, ved hjælp af en brugerdefineret ImageJ 31 script.

  1. Ved hjælp af en brugerdefineret script, sammenkæde output filer fra billedanalyse og anmærke hver række med pladen og stamme oplysninger i Supplerende tabel 1.
  2. Log 2 omdanne kolonistørrelse værdier (Integreret tæthed eller koloni område her, kolonnen "IntDenBackSub & #8221; fra supplerende tabel 1 blev brugt).
    BEMÆRK: Værdi fordeling vil se ud som i figur 3A.
  3. Normalisere disse værdier ved at subtrahere den gennemsnitlige værdi af hver plade.
    BEMÆRK: Dette trin kontroller til plade skævhed, der kan følge af ulige medier mængde eller variation i billedet erhvervelse automatisk, og reducerer den indbyrdes replikat varians (figur 3B).
  4. Kontroller, at gentagelser korrelerer med hinanden (figur 3C) for at vurdere reproducerbarheden af forsøgene.
  5. For at differentiere interagere fra ikke-interagerende agn-byttedyr par, sætte en høj selvtillid tærskelværdi, der svarer til de 95-percentil af fordelingen af L-DHFR F [3] kontrol.
    BEMÆRK: I dette eksperiment, svarer dette til 3,39 (figur 3D). Alternativt kan en tærskelværdi baseret på overlapning med kendte fysiske interaktionskandidater såsom dem rapporteret i BioGRID 35 anvendes.Se diskussion for flere detaljer.
  6. For enhver agn, byttedyr filter identificeret som er involveret i falske positive interaktioner i DHFR-PCA-skærme (se diskussion for flere detaljer) og opført i Supplerende tabel 2 (identificeret som "1" i kolonnen "filtreret").
  7. Beregn gennemsnittet af de log2 normaliseret koloni størrelser af de tre gentagelser af hver interaktion (kolonne "Average score" i Supplerende tabel 2).

7. Validering af Physical interaktionskandidater Brug mindre forsøg

BEMÆRK: PPI af særlig interesse med en score over eller tæt på det anvendte tærskel kan valideres ved hjælp af DHFR-PCA-analysen i en mindre eksperimenterende design ved hjælp af en vækst assay på fast eller flydende MTX medium. Nedenstående trin viser proceduren for manuelt konstruere diploide PCA-stammer og udfører spot assays på MTX medium. Forsøgslederen skal udføre disse trin for alle necessary kontroller (Bait-DHFR F [1,2] x L-DHFR F [3], Zipper-linker-DHFR diploide stammer og linker-DHFR diploid stamme).

  1. Plade 2-3 pi af glycerol status over agn stammen genereres i 1.1.2.6), L-DHFR F [3] kontrol stamme, den Zipper-linker-DHFR og linker-DHFR diploide stammer på YPD + Nat, YPD + hygB og to gange YPD + Nat + hygB medier hhv.
  2. Hent bytte af interesse i DHFR F [3] indsamling og følg instruktionerne i trin 1.1.1, men streak presset på YPD + hygB medium i stedet for YPD + Nat medium.
  3. Udfør en diagnostisk PCR som i 1.1.2.4 at bekræfte DHFR F [3] fusion ved bytte locus og sekvensen af ​​produktet.
  4. Podes 1 ml flydende YPD-medium med haploide stammer at parre (Bait x bytte, Bait x L-DHFR F [3] kontrol) og vokse mindst to dage ved 30 ° C for at tillade de diploider at danne.
  5. Vælg diploider ved striber 4-5 pi af kulturen i 7.4 om fast YPD + hygB + Nat medium. Grow to dage på 30 ° C.
  6. Select en isoleret koloni og vokse natten over i flydende kultur (1 ml) for at udføre væksten assay.
  7. Forbered MTX og DMSO (samme ingredienser som MTX-medium, men uden MTX) plader en dag før brug. Se trin 4.11 for flere detaljer.
  8. Udfør vækst assay ved at spotte serielle fortyndinger af de forskellige kulturer på kontrol (DMSO) og udvælgelse plader (MTX).
    1. Fortynd prækulturer til OD = 1.
    2. Udfør fem-folds fortyndinger (op til en fortyndingsfaktor på 625) i en steril 96-brønds plade.
    3. Spot 4 pi af hver fortynding på PCA medier (DMSO og MTX).
    4. Inkuber ved 30 ° C i plastikposer for at forhindre udtørring.
    5. Billede plader fra dag 1 til 7 i inkubation ved hjælp af robot platform eller et almindeligt digitalkamera.

Representative Results

Supplerende Tabel 2 er et eksempel på repræsentative resultater opnået ved anvendelse af gær protein Nup82 fusioneret til DHFR F [1,2] fragment som lokkemad. Tærsklen med L-DHFR F [3] kontroller kan anvendes som en empirisk tærskel for at bestemme høj konfidens hits (figur 3D & 3E). Alternativt kan score ranking bruges til at udføre Gene ontologi berigelser eller andre funktionelle analyser 36 baseret på guld standarder 37. Kan hentes De kendte fysiske interaktionskandidater af agn fra databaser som BioGRID 35 og overlejret på data (figur 3E & 3F). I dette eksempel har fem ud af otte stor tillid hits tidligere blevet rapporteret som Nup82 interaktionskandidater og to er en del af Nup82 subcomplex, Nup116 og Nup159 (figur 3F og 3G). Det andet medlem af komplekset, Nsp1, viser ikke nogen Interaction i vores eksperiment. To byttedyr, Ade17 og Tef2 (ikke vist i figur 3F), havde score over den hårde tærskel, men disse er sandsynligvis falsk positive som de interagerer med næsten enhver agn protein i PCA skærme vi har udført (upublicerede resultater). På den anden side kan Pex30 repræsentere en hidtil ukendt fysisk interactor af Nup82 og vi var i stand til at bekræfte denne interaktion ved hjælp af DHFR-PCA ved lav-throughput (figur 3G). Pex30 er en peroxisomal membranprotein og er blevet rapporteret et par direkte interaktioner mellem kerneporen kompleks (NPC), og dette organel. En to-hybrid skærm identificeret to andre NPC protein, Nup53 og Asm4 (Nup59), som fysiske interaktionskandidater af Pex30 38, og en genetisk samspil mellem Pex30 og Nup170 er rapporteret 39. To andre interaktion partnere opdaget, Nup120 og Nup85 (figur 3F & 3G), er ikke en del af Nup82 sub-kompleks, der illustrerer evnenaf DHFR-PCA til at påvise interaktion mellem subcomplexes i større komplekser 11.

Figur 1
Figur 1:. Engineering gærstammer til high-throughput DHFR-PCA (. Figur tilpasset fra Leducq et al 2012 33) (A) Opførelse af haploide Mata og MAT α stammer at fusionere Gene1 (G1) og Gene2 (G2) med DHFR F [1,2] -NatMX og DHFR F [3] -HPH kassetter, hhv. Kassetter er amplificeret fra plasmider pAG25-DHFR F [1,2] og pAG32-DHFR F [3] med fremadrettede primere G1-5 'og G2-5 "og reverse primere G1-3" og G2-3 ", og derefter indsættes i genomet ved 3'-enden af ​​mål-genet ved homolog rekombination. De resulterende proteiner, P1 og P2, henholdsvis fusioneret til DHFR F [1,2] fragment (MATa) og DHFR F [3] fragment (MATa) via en fleksibel linker. (B) kontrol af konstruktionen i (A) udføres ved sekventering overgangene mellem Gene1 s og Gene2 s ORF'er og DHFR-kassetter. De beregnede PCA stammer af modstående samvirkende typer derefter parret til dannelse af en diploid. Diploide stammer vokse på MTX medium, hvis de to komplementære DHFR fragmenter bringes i nærhed af et samspil mellem P1 og P2, som genopretter aktiviteten af DHFR-enzymet. (C) Konstruktion af kontrol diploid PCA stammer til DHFR-PCA skærme. De negative kontroller (L-DHFR) er konstrueret ved at omdanne separat haploide Mata og MATa stammer med plasmiderne P41-linker-DHFR F [1,2] og P41-linker-DHFR F [3] 11, hhv. De to stammer er parret resulterer i en negativ kontrol diploid stamme, hvori DHFR fragmenter er i standsupplere hinanden (øverst). Positive kontroller er konstrueret ved hjælp af samme fremgangsmåde som for de negative kontroller, men de plasmider transformeret i haploide stammer (P41-zipper-linker-DHFR F [1,2] (P41-ZL-DHFR F [1,2]) og P41 -zipper-linker-DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) indeholder to GCN4 parallel leucin-zipper fragmenter fusioneret til de komplementære DHFR fragmenter, hvilket fører til en stærk og konstitutiv interaktion, der genopretter DHFR-aktivitet (nederst ). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: High-throughput DHFR-PCA procedure (figur tilpasset fra Leducq et al. 33) (A) MAT α DHFR F [3] samling. kondenseres i en 1536-format gennem to på hinanden følgende runder af kondens. Først glycerolstamopløsning plader kombineret med grupper af fire om selektiv YPD + hygB medium i en 384-format ved hjælp af 96 pin-værktøj. For det andet er 384 arrays kombineres med grupper af fire om selektiv YPD + hygB medium i en 1536-format ved hjælp af 384 pin-værktøj. (B) Cell græsplæner i MATa PCA agn stamme fremstilles ved dyrkning af en mættet kultur agn stammen i selektiv YPD + Nat medium og plettering kulturen på en YPD + Nat omnitray. (C) Disse græsplæner bruges til at parre den agn stamme med DHFR F [3] samling på YPD medium. Celler successivt overført to gange på YPD + hygB + Nat medium til at vælge for diploider og to gange på MTX medium til at udføre PCA. Væksten vil kun blive observeret på MTX medium, hvis DHFR fragmenter supplerer hinanden efter en interaktion mellem agn og prey-proteiner.e.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3:.. Data-analyser gennem trin på normalisering, bestemmelse af en betydning tærskel og identifikation af positive vekselvirkninger (A) Density fordeling af kolonistørrelse på hver plade (log 2) (B) Normalisering af medianen af hvert billede korrigerer for fordomme forbundet med plade-til-plade virkninger. (C) Heatmap viser Spearman korrelationskoefficienten mellem pladerne, hvilket bekræfter reproducerbarheden af proceduren. (D) Fordeling af scorer for de testede PPI og L-DHFR F [3] kontrol. En hård grænse kan indstilles til de 95-percentil af L-DHFR F [3] distributionen til at identificere høj tillid PPI (ved en stiplet lodretlinje). (E) Nummer rækkefølge fordelingen af den gennemsnitlige score for hver bytte. Tidligere rapporterede fysisk interaktion partnere Nup82p i BioGRID 35 er identificeret ved cirkler, og dem rapporteret i denne undersøgelse identificeres ved røde prikker. Tærsklen er defineret i (D) er vist som en stiplet linje. (F) Netværk viser den høje tillid PPI identificeret i denne undersøgelse. Blå kanter viser tidligere rapporterede fysiske interaktionskandidater (BioGRID 35) og gule kanter viser en tidligere urapporteret interaktion med Pex30. (G) Spot-fortynding assay af PCA diploide stammer involverer Nup82-DHFR F [1,2] og bytte-DHFR F [3 ] par identificeret som fysiske interaktionskandidater af Nup82p i nærværende undersøgelse. Vækst-assay blev udført i DMSO medium (MTX opløsningsmiddel, venstre panel) og MTX medium (højre panel). Negative kontroller består af Nup82-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] og Linker-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3], og en positiv kontrol bestående af than stærkt samspil mellem to leucin-zipper-dele (lynlås-DHFR F [1,2] - lynlås-DHFR F [3]), var inkluderet. Cellevækst bedre end de negative kontroller i MTX medium bør fortolkes som en fysisk interaktion. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Aminosyre Mængde (g)
Adeninsulfat * 0.2
L-Tryptophan 0.4
L-Tyrosin 0,3
L-phenylalanin 0,5
L-glutaminsyre (mononatriumsalt) 1,0
L-asparagin 1,0
L-valin 1.5
L-threonin 2,0
L-serin 3,75
Uracil 0.2
L-histidin HCl 0.2
L-arginin HCI 0.2
L-methionin * 0.2
L-lysin * 0.2
L-leucin 0,6
* Trukket tilbage, når der udføres standard PCA (som i denne protokol), men kan tilføjes til andre formål.

Tabel 1:. Sammensætningen af 10X-Lys / mødt / ade frafald i MTX medium Mængder er for en liter 10x frafald. Stjerner angiver de forbindelser, der skal trækkes tilbage for standard MTX medium, men der kan tilsættes til andre formål.

Supplerende Tabel 1:. Kombineret data fra de 12 testplader Tabel 1 indeholder sammenkædede data fra ImageJ analyse udført ved hjælp af en brugerdefineret ImageJ script med hver række svarer til en enkelt position på hver 1.536 array. Derudover har hver række blevet kommenteret med oplysninger om billedfilen, DHFR samling plade, kopiere, ORF og protein navn.

Supplerende Tabel 2:. Gennemsnitlig normaliseret vækst per stamme Tabel 2 indeholder den gennemsnitlige Log 2 normaliseret vækst for hver stamme af samlingen sammen med standardafvigelsen. Filtreret byttedyr, hits og kendte fysiske interaktionskandidater identificeres i separate kolonner.

Discussion

Vi beskriver en protokol baseret på DHFR-PCA assay muliggør systematisk identifikation af fysiske interaktionskandidater for en given agn protein ved high-throughput. Denne protokol kan tilpasses ved screening for flere lokkemidler, og dette på ethvert ønsket niveau af replikation. Vi viser pålideligheden af ​​denne protokol ved identifikationen af ​​fysisk interaktion partnere for en agn protein involveret i kerneporen Complex: Nup82. Vores analyse aktiveret for at finde fem tidligere rapporterede interaktionskandidater og en tidligere urapporteret interactor (figur 3F & 3G), fremhæver metodens evne til at studere gærproteinet interactome.

Den her beskrevne protokol omfatter flere kritiske trin, som forsøgslederen bør være opmærksomme. Vi anbefaler, at 1) Sørg for, at agn DHFR F [1,2] fusion er korrekt (figur 1B); dette kan opnås ved sekventering af konstruktion og measuring korrekt proteinekspression under anvendelse af et anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR F [3] antistof; 2) Før påbegyndelse af skærmen, anbefales det at kontrollere, om nogen agn af interesse udviser promiskuøse interaktioner i PCA skærme. Dette kan gøres ved at udføre kontrol skærme med lokkemad krydset med passende L-DHFR kontrol eller manuelt parre lokkemaden med det passende L-DHFR kontrol og udførelse af en vækst-assay i MTX-medium. 3) Plader skal hældes dagen før de anvendes, så fugt er optimal for celle vedhæftning på agaroverfladen under trykning; 4) Kilde plader bør ikke anvendes mere end fire gange at overføre nok celler på destinationen pladen. Forøgelse af antallet af kopier af destination plade kan gøres ved successive trin for ekspansion (f.eks 4 eksemplarer -> 16 kopier -> 64 kopier). Alternativt kan cellerne blive hentet på forskellige positioner på græsplæner eller i kolonien mellem forskellige runder af replikation; 5) Hvis flere positions mangler efter diploide (e) valg, skal du sørge for, at kilden pladerne ikke blev brugt for mange gange i parring trin (trin 4,5-4,7); 6) Sørg for, at MTX mediet indeholder alle væsentlige ingredienser på de rette koncentrationer. Faktisk, hvis ingen vækst overhovedet er observeret på MTX medium, kan det være enten fordi ingen interaktion er detekterbar ved PCA for proteinerne af interesse, eller fordi MTX mediet blev ikke fremstillet korrekt. For at sikre at mediet tillader vækst af stammer viser DHFR fragmenter komplementering, kan en konstitutiv interaktion tilsættes på tomme positioner af indsamling og anvendt som en positiv kontrol, såsom DHFR-fragmenter fusioneret til leucin-zipper dele 33 (figur 1c). Parallelle der benyttes de linker-DHFR fragmenter eller lynlås-linker-DHFR fragmenter vil gøre det muligt at skelne mellem forhold, der tillader alle celler til at vokse (lav MTX koncentration eller agn protein, der har tendens til at gøre falsk positive interaktioner, som descrIBED nedenfor), og som forhindrer vækst af alle stammer (MTX-koncentration for høj eller hovedbestanddel mangler i medium); 7) Da PCA udføres gennem successive runder af gentagelser fra et medium til et andet, kan krydskontaminering blandt stammer mellem forskellige plader opstå, hvis, for eksempel, er pin-værktøjet ikke steriliseret korrekt mellem replikation runder og / eller den sidste vand bad (dvs. våd station) i sterilisering procedure er forurenet med kolonier af tidligere replikation runder. Flere holdninger til de arrays er tomme, og kan således anvendes som kontrol positioner, hvor ingen vækst bør overholdes for at opdage krydskontaminationer.

Billedanalyse kan udføres ved hjælp af flere publicerede software (se afsnit 5 i protokollen) eller enhver brugerdefineret script. I denne undersøgelse, den brugerdefinerede script udfører de følgende trin: 1) script subtraherer pixelværdier af en tom plade pixelværdier for hver plade med henblik på at samarbejderrect til belysning bias. 2) Scriptet konverterer hver baggrund korrigeret billede til binær hjælp af en pixel værdi tærskel på 10. 3) For hver 1.536 positioner hver plade, bestemt ved overlejring et rektangel på kanten kolonier, scriptet kører ImageJ "Analyze partikler ... "-funktionen i en cirkulær markering. Den cirkulære udvælgelse indstilles med en radius svarende til intervallet mellem to positioner minus 10 pixels. 4) script vælger den nærmeste partikel fra centrum af udvælgelse og bekræfter det som en koloni, hvis dens placering ikke er mere end halvdelen af ​​intervallet mellem to kolonier væk fra centrum af markeringen. 5) script måler pixelværdier for den valgte partikel på baggrund korrigeret billede. 6) For yderligere at rette eventuelle tilbageværende baggrundsbelysning bias, scriptet subtraherer middelværdien af ​​alle pixels fra cirkulær markering, der ikke var en del af en partikel til pixelværdier i kolonien. Summen af ​​disse korrigerede pixelværdis, der er lagret i kolonnen "IntDenBackSub" af supplerende tabel 1, anvendes som et mål for koloni størrelse.

Et kritisk trin i analysen del er valget af tærskelværdien betydning. Her valgte vi en tærskel baseret på fordelingen af ​​den negative L-DHFR F [3] kontrol, men afhængigt af formålet med skærmen, kan en sådan tærskel være for strenge. Faktisk L-DHFR F [3] kontrol overudtrykkes (stærk TEF-promotor), således at komplementære fragmenter spontant kan supplere hinanden, og disse er derfor ikke repræsentative for ekspressionen af ​​de fleste proteiner. Dette understreges af den omstændighed, at fordelingen af ​​L-DHFR F [3] kontrol er højere end gennemsnittet af væksten baggrund (figur 3D). Således nogle interaktioner med score under denne streng grænse, men der er helt klart uden for distributionen vækst baggrund kan betragtes som formodede hits, der kan repræsentere, for eksempel, forbigående eller svag interaktioner. Disse kan undersøges yderligere og krydsvalideret hvis, for eksempel, er de to proteiner ikke udtrykkes på niveauer, der kan tillade spontan komplementering af DHFR fragmenter ligesom L-DHFR kontroller. Som et alternativ, kan man sætte en betydning tærskel baseret på andelen af overlapning med rapporterede fysiske interaktionskandidater i databaser som BioGRID 35 for at maksimere andelen af sande positive forhold falske positiver. Men i modsætning til anvendelse af L-DHFR distribution, dette alternativ kan ikke altid være mulig, hvis for eksempel antallet af kendte fysiske interaktionskandidater er ikke tilstrækkelig høj. Desuden er valget af tærsklen betydning har en indvirkning på andelen af ​​falsk positive og falsk negative i den endelige datasæt. Faktisk, som enhver anden PPI påvisningsassay kan falske positiver skyldes uspecifik interaktion af et protein med DHFR-fusionsprotein, hvis for eksempel proteinet er meget rigelige som tidligere nævnt. Detteer eksemplificeret ved det forhold, at nogle byttedyr systematisk interagere med alle bait-proteiner i PCA skærme og dermed skal fjernes fra analysen 11 (f.eks Tef2 og Ade17 tillægs- og tabel 2). For at omgå dette problem, en kontrol PCA skærm af de to samlinger mod passende L-DHFR kontrol (F [1,2] eller F [3]) for at identificere lokkemad og byttedyr udviser spontan DHFR fragmenter komplementering kan udføres i de særlige betingelser af hver skærm. Desuden kan udføre en Gene Ontology berigelse analyse øge tilliden i dataene, hvis funktionen af ​​en given agn er kendt. På den anden side kan DHFR-PCA give anledning til falske negativer af flere grunde: 1) ikke alle proteiner kan fusioneres til DHFR fragmenter, da disse kan destabilisere proteinerne eller ændre deres lokalisering hvis for eksempel DHFR fusion til C-terminus interfererer med en lokalisering signal; 2) DHFR rekonstituering i nogle cellulære rum may ikke producerer folat hvis for eksempel en afgørende forløber for folat syntese er ikke tilgængelig; 3) C-termini behov for at være i en afstand af 8 nm for DHFR komplementering at forekomme 11. Således kan en velkendt interaktion ikke detekteres, hvis deres C-termini ikke er tæt nok i rummet. Dette er eksemplificeret her ved det faktum, at en stor del af Nup82 fysiske interaktioner rapporteret i databaser, hvoraf de fleste er indirekte, ikke blev påvist i vores assay. Tilsvarende vil interaktioner mellem membranproteiner, som C-termini er i trans i forhold til membranen ikke føre til DHFR fragmenter komplementering og vil ikke blive registreret 11. Begrænsninger 1) og 3) kan omgås relativt enkelt ved at fusionere DHFR fragment til N-termini af proteinet. Dette kan forhindre at forstyrre en lokaliseringssignal nær C-terminalerne, og kan gøre det muligt at påvise en interaktion mellem membranproteiner, hvis N- og C-terminalen er i cis relativetil membranen.

Flere udfordringer i studiet af stifter (revideret i 2,3). Kortene af stifter produceret hidtil i vid udstrækning blevet beskrevet i en enkelt eksperimentel betingelse for hver art og dermed tilbyde en enkelt øjebliksbillede af, hvordan protein netværk kan organiseres. Der er derfor behov for udforskning af andre eksperimentelle betingelser for at se, hvordan PIN-koder kan omlægges som reaktion på miljøforandringer, specifikke stimuli, på tværs udvikling eller følgende mutationer. Disse udfordringer vil blive overvundet af udviklingen af ​​nye teknologier spørgekriterierne PPI'er i real-time, i levende celler og ved at tilpasse de nuværende teknikker, så de kan bruges af et større fællesskab af laboratorier. Som en kvantitativ teknik, der kan påvise ændringer i mængden af DHFR komplementering komplekser 27 kan DHFR-PCA tilpasses til at overvinde disse problemer og er blevet anvendt til at undersøge, hvordan PPI påvirkes af et DNA-beskadigende middel 22 25, gendeletioner 23,26 eller i andre gær arter og hybrider 33. Udforskning disse nye dimensioner vil blive mere og mere vigtigt at afsløre dynamikken i PIN-koden.

Disclosures

En del af de åbne adgang bekendtgørelsesgebyrer til denne artikel blev betalt af S & P Robotics.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 og 324.265, en naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada Discovery tilskud og en Human Frontier Science Program tilskud til EF-referencelaboratoriet. CRL er en CIHR Ny Investigator. Guillaume Diss understøttes af en PROTEO fællesskab. Samuel Rochette understøttes af NSERC og FRQNT stipendier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration S&P Robotics Inc. BM5-BC
96-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-96-10 Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins
384-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-384-10 Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins
1536-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-1536-05 Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins
Automated imaging module  S&P Robotics Inc. IMG-02
Methotrexate  Bioshop Canada Inc. MTX440  CAUTION: toxic compound
Hygromycin B  Bioshop Canada Inc. HYG003
Nourseothricin dihydrogen sulfate Werner BioAgents 5010000
Yeast-Interactome Collection  Thermo Scientific YSC5849
Omni Tray w/lid sterile  Thermo Scientific 242811
Anti-DHFR F[1,2] antibody  Sigma-Aldrich D1067
Anti-DHFR F[3] antibody   Sigma-Aldrich D0942

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
  2. Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
  3. Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
  4. Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96 (2009).
  5. Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
  6. Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
  7. Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
  8. Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
  9. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  10. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  11. Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
  12. Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
  13. Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
  14. Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
  15. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  16. Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
  17. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  18. Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
  19. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  20. Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
  21. Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
  22. Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
  23. Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
  24. Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
  25. Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
  26. Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).
  27. Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
  28. Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  30. Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  32. Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
  33. Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).
  34. Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  35. Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
  36. Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5 (2013).
  37. Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
  38. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
  39. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).

Tags

Cellular Biology protein-protein-interaktion (PPI); high-throughput screening; gær; protein-fragment-komplementationsassay (PCA); dihydrofolatreduktase (DHFR); high-density arrays; systembiologi; biologiske netværk
Genom-dækkende protein-protein-interaktion Screening af protein-fragmentet Komplementering Assay (PCA) i levende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rochette, S., Diss, G., Filteau, M., … More

Rochette, S., Diss, G., Filteau, M., Leducq, J. B., Dubé, A. K., Landry, C. R. Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells. J. Vis. Exp. (97), e52255, doi:10.3791/52255 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter