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Biology

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (पीसीए) द्वारा जीनोम चौड़ा प्रोटीन प्रोटीन सहभागिता स्क्रीनिंग

Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52255
* These authors contributed equally

Introduction

प्रोटीन बातचीत नेटवर्क (पिन) प्रोटीन कार्यात्मक सेल एक में आयोजित कर रहे हैं कि कैसे एक कम संकल्प नक्शा प्रदान करते हैं। प्रत्येक भौतिक दो प्रोटीन के बीच संबंध, या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई), इस तरह के प्रोटीन परिसरों के भीतर पाए जाने वाले के रूप में समय में स्थिर है कि एक संघ, का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं और उस सेल के संरचनात्मक संगठन के लिए योगदान करते हैं। ये कनेक्शन भी गतिविधि, स्थिरता, स्थानीयकरण और दो भागीदारों की बातचीत को विनियमित कि क्षणिक संघों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। एक दिया प्रोटीन की शारीरिक बातचीत भागीदारों की पहचान इसलिए कि प्रोटीन 2,3 के समारोह और विनियमन पर अमीर जानकारी प्रदान करता है। इन कारणों के लिए, बड़े प्रयासों Escherichia कोलाई 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर <सहित मॉडल जीवों में पिनों की मैपिंग की दिशा में डाल दिया गया है/ उन्हें> 13, Caenorhabditis 14 एलिगेंस और होमो 15 sapiens। इन अध्ययनों प्रोटीन पहले अज्ञात कार्यों के साथ प्रोटीन पर सेल और इस प्रकार महत्वपूर्ण जानकारी में आयोजित कर रहे हैं कि कैसे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

कई रणनीतियों पिन अध्ययन करने के लिए पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया गया है। इन प्रौद्योगिकियों को मोटे तौर पर (16-18 में समीक्षा) वे PPIs पर प्रदान की गई जानकारी के प्रकार पर आधारित तीन श्रेणियों में बांटा जा सकता है। पहले एक खमीर दो संकर और उसके डेरिवेटिव 19 पर आधारित है। इन प्रौद्योगिकियों द्विआधारी नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देता है जो प्रोटीन के जोड़े के बीच प्रत्यक्ष एसोसिएशन, के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। दूसरा परिवार चारा प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि और ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री 20 द्वारा पीछा आत्मीयता शुद्धि के रूप में उनके संबद्ध भागीदारों की पहचान पर आधारित है। इन तरीकों सीधे हैं कि प्रोटीन के समूहों की पहचानया परोक्ष रूप से आम तौर पर एक स्थिर तरीके से जुड़े हैं, और प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए अत्यंत शक्तिशाली हैं। तीसरे दृष्टिकोण प्रोटीन-टुकड़ा complementation assays के (PCAs) 11,21 पर आधारित है। यह प्रोटीन के बीच प्रत्यक्ष और समीपस्थ संघों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के रूप में यह दृष्टिकोण, दो पूर्व दृष्टिकोणों के बीच संकल्प की एक मध्यवर्ती स्तर प्रदान करता है। हाल ही में 18 की समीक्षा के रूप में प्रत्येक तकनीक, अपनी शक्तियों और कमजोरियों है।

इसके proteome PPIs के पहले assayed किया गया है पता लगाने के लिए अन्य मॉडल यूकेरियोट्स की और उच्च throughput assays के वजह से उन लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कम जटिल है और अधिक कुशलता से कर रहे हैं क्योंकि सबसे अच्छा वर्णित यूकेरियोटिक पिन भाग में, नवोदित खमीर की अब तक एक के द्वारा होता है इस मॉडल जीव 9-12 में लागू किया है। खमीर प्रणाली के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली विधि dihydrofolate रिडक्टेस प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (DHFR-पीसीए), कर दिया गया है कि एक परख हैमानक और परेशान शर्तों 11,22-26 में खमीर पिन अध्ययन करने के लिए अलग अलग संदर्भों में इस्तेमाल किया। इस विधि अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर और एक मात्रात्मक तरीके से 27 में बातचीत भागीदारों 11,21 के देशी subcellular localizations दोनों पर एक दिया चारा प्रोटीन के लिए प्रत्यक्ष और लगभग प्रत्यक्ष PPIs का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है कि एक अस्तित्व परख पर निर्भर करता है। इस परख (उच्च घनत्व कॉलोनी सरणियों पर यानी कॉलोनी आकार) का उपयोग कर प्राप्त संकेत इस प्रकार जंगली प्रकार की कोशिकाओं में से एक के लिए लगभग बराबर एक सेलुलर वातावरण में चारा और शिकार के बीच का गठन प्रोटीन परिसरों की राशि को दर्शाता है। परख फोलेट चयापचय में शामिल एक पत्रकार एंजाइम के पुनर्गठन पर आधारित है, dihydrofolate रिडक्टेस (DHFR), जिससे ब्याज की दो प्रोटीन के लिए जुड़े हुए हैं कि DHFR के दो पूरक टुकड़े दो प्रोटीन, जब बातचीत निकटता में लाया जाता है, जो बदले में एंजाइम गतिविधि 1 की प्रतिवर्ती पुनर्गठन करने के लिए सुरागएक मध्यम युक्त मिथोट्रेक्सेट पर तनाव का एक और विकास (MTX, चित्रा 1)। इस यौगिक अंतर्जात DHFR एंजाइम, लेकिन परख 28 में इस्तेमाल नहीं उत्परिवर्तित एक रोकता। पीसीए उपभेदों के दो संग्रह, जिसमें एक माता के साथ उपभेदों ~ 4300 ओआरएफ DHFR एफ से जुड़े हुए एक [1,2] टुकड़ा और ओआरएफ DHFR [3] टुकड़ा से जुड़े हुए एक, के लिए खरीदा जा सकता है के साथ उपभेदों α ~ 4800 मेट युक्त एक किसी भी प्रयोगशाला में छोटे या बड़े पैमाने पर DHFR-पीसीए को लागू करने। यहाँ, हम एक चारा प्रोटीन और इस परख का उपयोग ~ 4800 शिकार प्रोटीन के बीच PPIs के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सामान्य लेकिन विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Protocol

1. निर्माण / चारा उपभेदों के सत्यापन

  1. ब्याज की चारा तनाव माता DHFR एफ [1,2] संग्रह में उपलब्ध है, तो कदम 1.1.1 में वर्णित है, कदम 1.1.2 में वर्णित के रूप में अन्यथा तनाव का निर्माण, संग्रह से यह निकालते हैं।
    नोट: इस संग्रह DHFR एफ [1,2] संग्रह की तुलना में अधिक उपभेदों होता है यहाँ के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल, एक DHFR एफ preys के रूप में एक चारा और DHFR एफ [3] संग्रह के रूप में [1,2] तनाव का उपयोग करता है। हालांकि, यह एक interactome के उच्च कवरेज की आवश्यकता है अगर चारा तनाव DHFR एफ [3] संग्रह में या दोनों झुकाव में ही उपलब्ध है अगर चारों ओर स्क्रीन अन्य तरीके से प्रदर्शन करने के लिए संभव है।
    1. एक घंटे के लिए बर्फ पर चारा तनाव होता है कि ग्लिसरॉल शेयर थाली गला लें। 95% इथेनॉल का उपयोग थाली को कवर एल्यूमीनियम पन्नी जीवाणुरहित। पियर्स एक बाँझ टिप के साथ पन्नी, चयनात्मक खमीर निकालने peptone पर ग्लिसरॉल शेयर की कोशिकाओं और लकीर 2-3 μl resuspend करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट औरडेक्सट्रोज (YPD) + 100 माइक्रोग्राम प्रति एकल कालोनियों को अलग करने के क्रम में / एमएल Nourseothricin (नेट)। 30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए सेते हैं।
    2. एक चारा पीसीए तनाव का निर्माण (माता DHFR एफ [1,2])।
      1. प्लाज्मिड pAG25-संयोजक-DHFR एफ से DHFR एफ बढ़ाना, उच्च निष्ठा पोलीमर्स और एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल का प्रयोग [1,2] कैसेट [1,2] -ADHterm ऊपर के साथ oligonucleotides का उपयोग कर ओआरएफ के पिछले 40 बीपी को मुताबिक़ समाप्त होता है स्टॉप कोडोन (आगे प्राइमर) और जीन की 3'-UTR (रिवर्स प्राइमर) (चित्रा 1 ए) के पहले 40 बीपी को छोड़कर 3'-अंत।
      2. 29 (चित्रा 1 ए) के रूप में मानक LiOAc / खूंटी खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग (आमतौर पर एक BY4741 तनाव में) सक्षम खमीर कोशिकाओं में पीसीआर उत्पाद रूपांतरण।
      3. चयनात्मक YPD + नेट माध्यम पर प्लेट सकारात्मक transformants अलग करने के लिए।
      4. उचित DHFR एफ [1,2] फ्यूजन पुष्टि करने के लिए अलग कालोनियों पर एक नैदानिक ​​कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। जनसंपर्क का प्रयोग करेंimers जीन अनुक्रम कोडन (फॉरवर्ड oligo) DHFR संलयन के अपस्ट्रीम में लगभग 100 बीपी और 2) कैसेट (oligo रिवर्स) (चित्रा 1 बी) के ADH टर्मिनेटर में में) एक annealing।
      5. उचित जीन संलयन पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण द्वारा पीसीआर उत्पाद अनुक्रम।
      6. -80 डिग्री सेल्सियस पर 25% ग्लिसरॉल में पुष्टि चारा तनाव संग्रह।
        नोट: प्रोटोकॉल के इस कदम पर रुका हुआ जा सकता है।

2. पिन-उपकरण बंध्याकरण और मुद्रण प्रक्रियाएं

नोट: नीचे वर्णित नसबंदी प्रक्रिया BM3-बीसी (एस एंड पी रोबोटिक) रोबोट मंच से छेड़छाड़ पिन-उपकरणों के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन साथ ही अन्य प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह खंड प्रोटोकॉल के आराम के लिए एक दूसरे के लिए मध्यम से कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि पिन-उपकरण नसबंदी और मुद्रण प्रक्रियाओं का वर्णन है। इन दिनचर्या प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया घर में लिपियों अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है। नोट थाटी सभी कदम एक मैनुअल पिन उपकरण 30 का उपयोग करते हुए एक रोबोट मंच की जरूरत के बिना किया जा सकता है।

  1. रोबोट मंच पर उपयुक्त पिन उपकरण माउंट।
  2. इस प्रकार के रूप सफाई और गीला स्टेशनों तैयार:
    1. पानी के स्नान स्टेशन में बाँझ पानी की 500 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. ब्रश स्टेशन में बाँझ पानी की 320 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. एक अगर प्लेट के लिए तरल संस्कृतियों युक्त एक microtiter प्लेट से नकल जब अगर प्लेट के लिए, या 400 मिलीलीटर (जम माध्यम के 35 मिलीलीटर युक्त, 86 एक्स 128 मिमी omnitray) अगर प्लेट से नकल जब sonicator में 70% इथेनॉल के 380 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. गीला स्टेशन (एक बाँझ खाली omnitray से मिलकर) में बाँझ पानी की 35 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. रोबोट मंच की आवश्यकता है कि प्रत्येक दिन की शुरुआत में, sonicator स्नान में एक मिनट के लिए पिन औजार पांच बार बाँझ। पांच मिनट रोबोट बाड़े बाँझ के लिए इस बीच, यूवी दीपक पर बारी।
    नोट: यह लूटने अगर आवश्यकता नहीं हैओ.टी. एक बाँझ हुड के नीचे रखे है।
  4. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक पिन उपकरण प्रतिकृति दौर के बीच, पिन-उपकरण बाँझ:
    1. सेल clumps दूर करने के लिए पानी के स्नान स्टेशन में पिन उपकरण 10 सेकंड के लिए पांच बार भिगोएँ।
    2. दो बार आगे और पीछे ब्रश स्टेशन में पिन उपकरण भिगोएँ।
      नोट: घूर्णन ब्रश अवशिष्ट कोशिकाओं को हटा देगा।
    3. Sonicator स्टेशन में 20 सेकंड के लिए दो बार पिन उपकरण भिगोएँ।
      नोट: पिन पर कोशिकाओं शेष sonication द्वारा हटा दिया या इथेनॉल से मार डाला जाएगा।
    4. पिनों की सूई गहराई उचित नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए एक के बाद एक स्नान में बढ़ जाती है कि सुनिश्चित करें।
  5. 25 सेकंड के लिए एयर ड्रायर स्टेशन में पिन उपकरण सूखी।
  6. स्रोत प्लेटों पर कोशिकाओं लेने से पहले, एक omnitray में बाँझ पानी की 35 मिलीलीटर होता है जो गीला स्टेशन, में पिन गीला।
  7. स्रोत थाली से कालोनियों में दो बार पिन डुबकी।
  8. एजी छूकर एक हौसले डाला गंतव्य प्लेट पर प्रिंटगिरफ्तारी सतह दो बार (इसके बाद "छपाई" एक सरणी की कार्रवाई के रूप में करने के लिए कहा गया है)।

एक स्वचालित रोबोट मंच का उपयोग कर 1536 सरणियों में DHFR एफ [3] संग्रह 3. संक्षेपण

  1. बर्फ पर पिघलना DHFR एफ [3] संग्रह (60 96 अच्छी तरह प्लेटें) और एल DHFR एफ [3] नियंत्रण तनाव DHFR एफ शामिल है जो (चित्रा 1C), [3] टुकड़ा के साथ भरा एक अतिरिक्त 96 अच्छी तरह से थाली और नदी के ऊपर लिंकर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अकेले व्यक्त किया।
    नोट: सिद्धांत रूप में, इस टुकड़ा किसी भी DHFR-टुकड़ा संलयन प्रोटीन (विवरण के लिए चर्चा देखें) के साथ बातचीत नहीं करना चाहिए।
  2. कुओं के बीच पार संदूषण का जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी को हटाने से पहले अपकेंद्रित्र प्लेट (त्वरित स्पिन)।
  3. 384 उपभेदों (2A चित्रा) के 16 सरणियों पर संग्रह गाढ़ा। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक 384 सरणी के लिए, एक चयनात्मक YPD + 250 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल hygromycin बी (HygB) के चार quadrants पर प्रिंट चार ग्लिसरॉल प्लेटें वें का उपयोग कर omnitrayई 96 पिन उपकरण (यहाँ, एक 384 सरणी प्रत्येक एक 2 x 2 मैट्रिक्स लेआउट में 96 पदों में से मिलकर, चार समान रूप से interspaced quadrants में विभाजित किया जा सकता है)। वास्तव में चार 1536 सरणियों भरने कि 64 प्लेटों की एक अंतिम सेट के क्रम में 60 अन्य प्लेटों के बीच में एल DHFR एफ [3] नकारात्मक नियंत्रण युक्त चार 96 अच्छी तरह प्लेटें डालें। चरण 2 में वर्णित के रूप में प्रत्येक प्रतिकृति चक्र के बीच पिन उपकरण जीवाणुरहित।
    नोट: चार फाइनल 1536 सरणियों में से प्रत्येक पर एक ऐसी थाली है ताकि एल DHFR एफ [3] प्लेटें डालें।
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं। नोट: इस स्तर पर, DHFR संग्रह अगर प्लेटों पर अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 सेल्सियस पर एक 384 प्रारूप में संग्रहित किया जा सकता है।
  5. 1536 उपभेदों (2A चित्रा) के चार सरणियों में संग्रह गाढ़ा। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक 1536 सरणी के लिए, यहां (384 पिन उपकरण का उपयोग कर 3.2 कदम के रूप में ही माध्यम की एक थाली के चार quadrants पर 384 उपभेदों के चार सरणियों प्रिंट, एक 1536 सरणी चार ई में विभाजित किया जा सकता हैqually) एक 2 x 2 मैट्रिक्स लेआउट में प्रत्येक 384 पदों से मिलकर चतुर्भागों interspaced।
  6. 30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं। नोट: इस स्तर पर, DHFR संग्रह अगर प्लेटों पर अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 सेल्सियस पर 1536 प्रारूप में संग्रहित किया जा सकता है।
  7. एक 1536 पिन उपकरण का उपयोग कॉलोनी आकार के मानकीकरण के लिए एक ही माध्यम पर चार सरणियों को दोहराने।
  8. 30 सी में दो दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं।

4. उच्च throughput DHFR-पीसीए प्रक्रिया

  1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब (चित्रा 2B) में तरल YPD + नेट के 20 मिलीलीटर में कदम 1.1.1 या 1.1.2 से प्राप्त चारा तनाव (DHFR एफ [1,2] फ्यूजन) की एक संस्कृति टीका लगाना।
  2. संस्कृति संतृप्ति तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए 250 rpm पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस से कम दो दिनों के लिए सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के दो दिन, थाली के बाद एक YPD + नेट पर संस्कृति के 5 मिलीलीटर omnitray। कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए सतह पर सोखना करते हैं और अतिरिक्त तरल (चित्रा 2 बी) को हटा दें। दोहराएँ टीwice तीन प्रतिकृति बनाने के लिए।
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए सेते हैं।
  5. चार बार से अधिक नहीं प्रत्येक कोशिका लॉन का उपयोग कर एक 1536 पिन उपकरण के साथ (DHFR एफ [3] संग्रह × तीन प्रतिकृति के चार प्लेटों संभोग करने के लिए पर्याप्त) चरणों 4.3 और 4.4 12 पर YPD प्लेटों से चारा तनाव प्रिंट।
  6. 1536 पिन उपकरण (चित्रा -2) का उपयोग चारा कोशिकाओं के शीर्ष पर DHFR एफ [3] के संग्रह का उचित सरणी प्रिंट।
  7. उपभेदों 30 डिग्री सेल्सियस से कम दो दिनों के लिए incubating द्वारा दोस्त दें।
  8. YPD + HygB + नेट (चित्रा -2) युक्त omnitrays पर कालोनियों मुद्रण द्वारा द्विगुणित कोशिकाओं का चयन करें।
  9. 30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए सेते हैं।
  10. चरणों 4.8 और 4.9 (चित्रा 2B) में वर्णित के रूप में दोहराएँ द्विगुणित चयन।
  11. । यह एक जहरीले यौगिक है के रूप में MTX के साथ काम करते समय हमेशा दस्ताने पहनना सावधान रहना, prote: MTX (MTX मध्यम) एक दिन युक्त मीडिया उपयोग करने से पहले इन चरणों 21 (सतर्कता निम्नलिखित के साथ प्लेटों की तैयारीction के चश्मे और इसे संभाल जब एक प्रयोगशाला कोट) (चित्रा -2):
    1. 10x -lys तैयार करें / विआयनीकृत जल में / एडीई अमीनो एसिड ड्रॉप आउट मुलाकात की। बड़ी मात्रा में, अगर जरूरत है, एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष निस्पंदन कीप (तालिका 1) एक 0.2 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर एक बाँझ बोतल में ड्रॉप आउट फिल्टर बाँझ या।
    2. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 10 मिलीग्राम / एमएल MTX शेयर समाधान तैयार है। समाधान की तैयारी के तुरंत बाद का प्रयोग करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष फ्रीज। यह सहज है के रूप में प्रकाश से बचाने के। यह विगलन के बाद MTX फिर फ्रीज नहीं है।
    3. के रूप में निम्नानुसार (। मध्यम सामग्री और मात्रा Tarassov एट अल 11 में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में वही कर रहे हैं) मीडिया तैयार करें:
      1. मध्यम से एक लीटर के लिए, दो अलग-अलग बोतल में मिश्रण: 1) अमीनो एसिड के बिना और अमोनियम सल्फेट के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस की 6.69 ग्राम और विआयनीकृत पानी की 330 मिलीलीटर; विआयनीकृत पानी की अगर महान और 500 मिलीलीटर के 2) 25 ग्राम।
      2. 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव बोतल।
      3. कम से कम एक घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में तापमान संतुलित करना।
      4. दो बोतल एक साथ मिक्स और बाँझ 40% ग्लूकोज की 50 मिलीलीटर, 100 10x बाँझ ड्रॉप आउट की मिलीलीटर, और MTX 10 मिलीग्राम / एमएल के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
      5. 35 मिलीलीटर डालो omnitrays में मध्यम से (नीचे नोट देखें)। कम से कम एक घंटा और एक आधा के लिए जमना। प्रकाश से शील्ड प्लेटें।
        नोट: यहाँ, omnitray प्रति मध्यम की 35 मिलीलीटर डालने का कार्य सभी बहाव के चरणों के लिए महत्वपूर्ण है जो बराबर प्लेट की मोटाई, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  12. रोबोट मंच के साथ या वर्दी प्लेट रोशनी के साथ एक नियमित रूप से डिजिटल कैमरा के साथ द्विगुणित चयन के दूसरे दौर से छवि प्लेटें। बहाव के विश्लेषण प्रदर्शन जब सरणियों पर खाली पदों की पहचान करने के लिए इन तस्वीरों का प्रयोग करें। कैमरे के मापदंडों को हमेशा एक ही है और रोबोट प्रकाश पर दिया जाता है कि कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  13. MTX मीडिया उसी पर द्विगुणित कोशिकाओं प्रिंट1536 पिन उपकरण एनजी।
  14. सुखाने को रोकने के लिए प्लास्टिक की थैलियों में 30 डिग्री सेल्सियस पर चार दिनों के लिए सेते हैं।
  15. कदम 4.11 के रूप में वर्णित MTX मध्यम युक्त omnitrays के एक दूसरे बैच तैयार करें।
  16. ऊष्मायन के चार दिनों के बाद, छवि प्लेटें रोबोट मंच या नियमित रूप से डिजिटल कैमरे का उपयोग। कैमरे के मापदंडों को हमेशा एक ही है और रोबोट प्रकाश पर दिया जाता है कि कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  17. MTX मीडिया के दूसरे बैच पर कोशिकाओं नकल द्वारा MTX चयन के दूसरे दौर में प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: यह पीसीए उपभेदों की पृष्ठभूमि के विकास में कमी और मात्रात्मक संकल्प में वृद्धि होगी।
  18. सुखाने को रोकने के लिए प्लास्टिक की थैलियों में 30 डिग्री सेल्सियस पर चार दिनों के लिए सेते हैं।
  19. के रूप में छवि प्लेटों कदम 4.16 में वर्णित है।

5. छवि विश्लेषण

  1. कस्टम ImageJ के साथ 31 लिपियों कॉलोनी सरणियों की छवियों का विश्लेषण या ऐसे उपनिवेशवादी, हिंदुस्तान टाइम्स कॉलोनी ग्रिड विश्लेषक, सेल प्रोफाइलर, कालोनी छवि के रूप में प्रकाशित सॉफ्टवेयर का उपयोग(32 में संकलित) आर, ScreenMill, YeastXtract और gitter। छवि विश्लेषण उत्पादन एक या प्रत्येक सरणी के प्रत्येक पद के लिए कॉलोनी के आकार से युक्त कई स्प्रेडशीट, सभी बहाव के विश्लेषण के लिए इन कॉलोनी आकार का उपयोग करना चाहिए।
    नोट: इस अध्ययन में, हम Leducq एट अल में वर्णित एक कस्टम ImageJ स्क्रिप्ट का इस्तेमाल किया 33 (अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।।

6. डेटा विश्लेषण

नोट: छवि विश्लेषण परिणाम से इस तरह के एक्सेल या आर 34 के रूप में इस तरह के एक पटकथा भाषा का उपयोग कर के रूप में एक सारणी में कार्रवाई की जा सकती है। निम्नलिखित कदम एक कस्टम ImageJ 31 स्क्रिप्ट का उपयोग प्रक्रिया का वर्णन।

  1. एक कस्टम स्क्रिप्ट का प्रयोग, छवि विश्लेषण से आउटपुट फाइल जुटना और थाली के साथ प्रत्येक पंक्ति व्याख्या और पूरक तालिका 1 में के रूप में जानकारी तनाव।
  2. कॉलोनी आकार मूल्यों (एकीकृत घनत्व या कॉलोनी क्षेत्र 2 लॉग इन करें परिणत, यहाँ, स्तंभ "IntDenBackSub & #8221; पूरक तालिका 1 से) का इस्तेमाल किया गया था।
    नोट: मान वितरण चित्रा 3 ए में के रूप में दिखेगा।
  3. प्रत्येक थाली के औसत मूल्य को घटाकर की इन मूल्यों को मानक के अनुसार।
    नोट: स्वत: छवि अधिग्रहण में असमान मीडिया मात्रा या भिन्नता से परिणाम, और अंतर को दोहराने के विचरण (3B चित्रा) कम कर देता है कि हो सकता है थाली पूर्वाग्रह के लिए यह कदम नियंत्रित करता है।
  4. प्रतिकृति प्रयोगों के reproducibility का आकलन करने के लिए एक दूसरे को (चित्रा -3 सी) के साथ संबंध स्थापित की जाँच करें।
  5. गैर बातचीत चारा शिकार जोड़े से बातचीत में अंतर करने के लिए, एल DHFR एफ [3] के नियंत्रण के वितरण के 95 वें प्रतिशतक के लिए इसी एक उच्च-विश्वास सीमा निर्धारित।
    नोट: इस प्रयोग में, इस 3.39 चित्रा (3 डी) से मेल खाती है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के BioGRID 35 की रिपोर्ट में उन लोगों के रूप में जाना जाता भौतिक interactors साथ ओवरलैप के आधार पर एक सीमा से इस्तेमाल किया जा सकता है।अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
  6. DHFR-पीसीए स्क्रीन में झूठी सकारात्मक बातचीत में शामिल (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) और (कॉलम में "एक" के रूप में पहचान "फ़िल्टर") पूरक तालिका 2 में सूचीबद्ध किसी भी रूप में चारा के लिए, फिल्टर पहचान preys।
  7. (अनुपूरक तालिका 2 में कॉलम "टूटने") प्रत्येक बातचीत के तीन प्रतिकृति के log2 सामान्यीकृत कॉलोनी आकार औसत।

शारीरिक interactors 7. मान्यकरण छोटे पैमाने पर प्रयोग का प्रयोग

नोट: एक के ऊपर स्कोर या ठोस या तरल MTX माध्यम पर एक विकास परख का उपयोग कर एक छोटे पैमाने पर प्रयोगात्मक डिजाइन में DHFR-पीसीए परख का उपयोग मान्य किया जा सकता लागू किया सीमा के करीब होने के विशेष हित के किसी भी पीपीआई। कदम नीचे मैन्युअल रूप से द्विगुणित पीसीए उपभेदों का निर्माण और MTX माध्यम पर हाजिर assays के प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रिया को दिखाते हैं। प्रयोगकर्ता सब necessar के लिए इन चरणों का प्रदर्शन करना चाहिएY नियंत्रण (चारा DHFR एफ [1,2] एक्स एल DHFR एफ [3], जिपर-संयोजक-DHFR द्विगुणित उपभेदों और linker-DHFR द्विगुणित तनाव)।

  1. 1.1.2.6 में उत्पन्न चारा तनाव की ग्लिसरॉल शेयर की प्लेट 2-3 μl), एल DHFR एफ [3] नियंत्रण तनाव, YPD + नेट, YPD पर जिपर-संयोजक-DHFR और linker-DHFR द्विगुणित उपभेदों + HygB और दो बार YPD + नेट + HygB मीडिया, क्रमशः।
  2. बजाय YPD + नेट माध्यम की YPD + HygB माध्यम पर तनाव DHFR एफ [3] संग्रह में ब्याज की शिकार निकालें और कदम 1.1.1 में निर्देशों का पालन करें, लेकिन लकीर।
  3. शिकार ठिकाना और अनुक्रम उत्पाद पर [3] फ्यूजन DHFR एफ पुष्टि करने के लिए 1.1.2.4 में के रूप में एक नैदानिक ​​पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
  4. दोस्त के लिए अगुणित उपभेदों के साथ तरल YPD माध्यम से 1 मिलीलीटर टीका लगाना (चारा चारा एक्स एल DHFR एफ [3] नियंत्रण, शिकार x) और diploids फार्म करने के लिए अनुमति देने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम दो दिन बढ़ता है।
  5. ठोस YPD + HygB + नेट माध्यम पर 7.4 में संस्कृति के 4-5 μl streaking द्वारा diploids का चयन करें। 30 डिग्री सेल्सियस से कम दो दिन के लिए आगे बढ़ें।
  6. Selecटी एक पृथक कॉलोनी और तरल संस्कृति (1 मिलीलीटर) में रातोंरात बढ़ने विकास परख करने के लिए।
  7. उपयोग करने से पहले एक दिन MTX और DMSO (MTX माध्यम के रूप में एक ही सामग्री है, लेकिन MTX के बिना) प्लेटें तैयार करें। अधिक जानकारी के लिए कदम 4.11 देखें।
  8. नियंत्रण (DMSO) और चयन प्लेट (MTX) पर विभिन्न संस्कृतियों के धारावाहिक dilutions खोलना द्वारा विकास परख प्रदर्शन करते हैं।
    1. आयुध डिपो = 1 के लिए precultures पतला।
    2. एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली में (625 के कमजोर पड़ने कारक तक) पांच गुना dilutions प्रदर्शन करते हैं।
    3. स्पॉट पीसीए मीडिया (DMSO और MTX) पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 4 μl।
    4. सुखाने को रोकने के लिए प्लास्टिक की थैलियों में 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. रोबोट मंच या एक नियमित रूप से डिजिटल कैमरे का उपयोग 1 ऊष्मायन के 7 दिनों से छवि प्लेटें।

Representative Results

पूरक तालिका 2 Nup82 DHFR एफ एक प्रलोभन के रूप में [1,2] टुकड़ा के लिए जुड़े हुए खमीर प्रोटीन का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम का एक उदाहरण है। एल DHFR एफ के साथ परिभाषित दहलीज [3] नियंत्रण उच्च आत्मविश्वास हिट (आंकड़े 3 डी और 3E) निर्धारित करने के लिए एक अनुभवजन्य दहलीज के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, स्कोर रैंकिंग जीन आंटलजी संवर्धन के प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया है या कार्यात्मक अन्य स्वर्ण मानकों 37 के आधार पर 36 का विश्लेषण करती जा सकता है। चारा के ज्ञात भौतिक interactors BioGRID 35 की तरह डेटाबेस से लिया गया है और डेटा (आंकड़े 3E और 3F) पर मढ़ा जा सकता है। इस उदाहरण में, पांच से आठ से बाहर उच्च आत्मविश्वास हिट पहले से Nup82 interactors के रूप में सूचित कर दिया गया है और दो ​​Nup82 subcomplex, Nup116 और Nup159 (चित्रा 3F और 3 जी) का हिस्सा हैं। जटिल, Nsp1 के अन्य सदस्य, किसी भी बातचीत नहीं दिखा हैहमारे प्रयोग में tion। दो preys, Ade17 और नहीं है (चित्रा 3F में दिखाया गया है) Tef2 लागू कठिन सीमा से ऊपर स्कोर था, लेकिन इनमें से वे हम (अप्रकाशित परिणाम) प्रदर्शन किया है पीसीए स्क्रीन में लगभग किसी भी चारा प्रोटीन के साथ बातचीत के रूप में झूठी सकारात्मक होने की संभावना है। दूसरी ओर, Pex30 Nup82 के एक उपन्यास शारीरिक interactor का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं और हम कम से throughput (चित्रा 3 जी) पर DHFR-पीसीए का उपयोग करते हुए इस बातचीत की पुष्टि करने में सक्षम थे। Pex30 एक peroxisomal झिल्ली प्रोटीन होता है और कुछ प्रत्यक्ष बातचीत परमाणु ताकना परिसर (एनपीसी) और इस organelle के बीच सूचना दी गई है। एक दो संकर स्क्रीन Pex30 38 के भौतिक interactors के रूप में, दो अन्य एनपीसी प्रोटीन, Nup53 और Asm4 (Nup59) की पहचान की है, और Pex30 और Nup170 के बीच एक आनुवंशिक बातचीत 39 सूचित किया गया है। दो अन्य बातचीत भागीदारों का पता चला, Nup120 और Nup85 (चित्रा 3F और 3 जी), क्षमता illustrating, Nup82 उप परिसर का हिस्सा नहीं हैंDHFR-पीसीए के भीतर और बड़े परिसरों 11 में subcomplexes के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए।

चित्र 1
चित्रा 1:। अगुणित माता और मेट α उपभेदों के उच्च throughput DHFR-पीसीए के लिए इंजीनियरिंग खमीर उपभेदों के लिए (। Leducq एट अल से अनुकूलित आंकड़ा 2012 33) (ए) के निर्माण DHFR साथ Gene1 (G1) और Gene2 (G2) फ्यूज एफ क्रमशः [1,2] -NatMX और DHFR एफ [3] -HPH कैसेट,। कैसेट G1-3 pAG25-DHFR एफ [1,2] और pAG32-DHFR एफ [3] आगे प्राइमरों G1-5 'और G2-5', और साथ प्राइमरों रिवर्स प्लास्मिड से परिलक्षित 'और G2-3', और फिर रहे हैं मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा लक्ष्य जीन के 3 'अंत में जीनोम में डाला। जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन, P1 और P2 क्रमश: विकास के लिए जुड़े हुए हैंHFR एफ [1,2] टुकड़ा (माता) और एक लचीला लिंकर के माध्यम से DHFR एफ [3] टुकड़ा (MATα)। (बी) के निर्माण का सत्यापन में (ए) Gene1 की और Gene2 के ORFs और बीच जंक्शनों अनुक्रमण द्वारा किया जाता है DHFR कैसेट। संभोग प्रकार के विरोध का निर्माण पीसीए उपभेदों तो एक द्विगुणित फार्म के लिए mated रहे हैं। दो पूरक DHFR टुकड़े DHFR एंजाइम की गतिविधि reconstitutes जो P1 और P2 के बीच एक संवाद ने निकटता में लाया जाता है अगर द्विगुणित उपभेदों MTX माध्यम पर बढ़ता है। (सी) निर्माण नियंत्रण का द्विगुणित पीसीए DHFR-पीसीए स्क्रीन के लिए उपभेदों। नकारात्मक नियंत्रण (एल DHFR) प्लास्मिड p41-संयोजक-DHFR एफ [1,2] और p41-संयोजक-DHFR एफ [3] 11, क्रमशः के साथ अलग से अगुणित माता और MATα उपभेदों बदलने से निर्माण कर रहे हैं। दो उपभेदों DHFR टुकड़ों में असमर्थ हैं, जिसमें एक नकारात्मक नियंत्रण द्विगुणित तनाव में जिसके परिणामस्वरूप mated रहे हैंएक दूसरे को (ऊपर) के पूरक हैं। सकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण के लिए के रूप में एक ही दृष्टिकोण का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं, लेकिन प्लास्मिड अगुणित उपभेदों (p41-जिपर-संयोजक-DHFR एफ [1,2] (p41-ZL-DHFR एफ [1,2]) और p41 में तब्दील -zipper-संयोजक-DHFR एफ [3] (p41-ZL-DHFR एफ [3])) DHFR गतिविधि reconstitutes कि एक मजबूत और विधान बातचीत करने के लिए होता है, जो पूरक DHFR टुकड़े के लिए जुड़े हुए दो GCN4 समानांतर leucine जिपर टुकड़े होते हैं (नीचे )। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: उच्च throughput DHFR-पीसीए प्रक्रिया (Leducq एट अल 33 से अनुकूलित आंकड़ा।) (ए) DHFR एफ [3] संग्रह α चटाई। संक्षेपण के लगातार दो राउंड के माध्यम से एक 1536 प्रारूप में सघन है। सबसे पहले, ग्लिसरॉल शेयर प्लेटें 96 पिन उपकरण का उपयोग कर एक 384 प्रारूप में चयनात्मक YPD + HygB माध्यम पर चार के समूह द्वारा संयुक्त रहे हैं। दूसरा, 384 सरणियों 384 पिन उपकरण का उपयोग कर एक 1536 प्रारूप में चयनात्मक YPD + HygB माध्यम पर चार के समूह द्वारा संयुक्त रहे हैं। माता पीसीए चारा तनाव (बी) सेल लॉन में चारा तनाव का एक संतृप्त संस्कृति बढ़ रही द्वारा तैयार किया जाता है एक YPD + नेट omnitray। (ग) इन लॉन पर संस्कृति चढ़ाना चयनात्मक YPD + नेट मध्यम और YPD माध्यम पर DHFR एफ [3] के संग्रह के साथ चारा तनाव दोस्त के लिए किया जाता है। प्रकोष्ठों क्रमिक diploids के लिए और दो बार पीसीए प्रदर्शन करने के लिए MTX माध्यम पर चयन करने के लिए YPD + HygB + नेट माध्यम पर दो बार स्थानांतरित कर रहे हैं। DHFR टुकड़े चारा और शिकार प्रोटीन के बीच एक संवाद निम्नलिखित एक दूसरे के पूरक अगर ग्रोथ केवल MTX माध्यम पर मनाया जाएगा।e.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। प्रत्येक छवि की औसत से डाटा सामान्य, एक महत्व दहलीज और सकारात्मक बातचीत की पहचान के निर्धारण के इस कदम के माध्यम से विश्लेषण करती कॉलोनी आकार की (ए) घनत्व वितरण प्रत्येक थाली पर (2 लॉग इन करें) (बी) के सामान्यीकरण पूर्वाग्रहों के लिए सही थाली से प्लेट प्रभाव के साथ जुड़े। (सी) हीटमैप प्रक्रिया के reproducibility, पुष्टि प्लेटों के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध गुणांक दिखा। परीक्षण किया PPIs के लिए स्कोर (डी) के वितरण और एल DHFR एफ [3] नियंत्रित करता है। एक हार्ड दहलीज के 95 वें प्रतिशतक करने के लिए सेट किया जा सकता है एल DHFR एफ [3] एक बिंदीदार खड़ी द्वारा प्रतिनिधित्व उच्च-विश्वास PPIs की पहचान करने के लिए वितरण (प्रत्येक शिकार के टूटने की लाइन)। (ई) रैंक आदेश वितरण। BioGRID 35 में Nup82p की पहले से सूचना दी शारीरिक बातचीत भागीदारों हलकों द्वारा की पहचान कर रहे हैं और इस अध्ययन की रिपोर्ट में उन लाल डॉट्स द्वारा पहचाने जाते हैं। (डी) में परिभाषित दहलीज एक बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है। (एफ) नेटवर्क इस अध्ययन में पहचान की उच्च-विश्वास PPIs दिखा। ब्लू किनारों पहले की रिपोर्ट में दिखाई शारीरिक interactors (BioGRID 35) और पीले किनारों Pex30 साथ एक पहले से unreported बातचीत दिखा। (जी) Nup82-DHFR एफ [1,2] और शिकार-DHFR एफ [3 शामिल पीसीए द्विगुणित उपभेदों के स्पॉट-कमजोर पड़ने परख ] जोड़े वर्तमान अध्ययन में Nup82p के भौतिक interactors के रूप में पहचान की। विकास परख DMSO के माध्यम (MTX विलायक, बाएं पैनल) और MTX मध्यम (सही पैनल) में प्रदर्शन किया गया था। एफ Nup82-DHFR से मिलकर नकारात्मक नियंत्रण [1,2] - Linker-DHFR एफ [3] और linker-DHFR एफ [1,2] - Linker-DHFR एफ [3] और एक सकारात्मक नियंत्रण टी से मिलकरदो leucine जिपर moieties के बीच वह मजबूत बातचीत (जिपर-DHFR एफ [1,2] - जिपर-DHFR एफ [3]) शामिल थे। MTX माध्यम में नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए बेहतर सेल के विकास के लिए एक शारीरिक संपर्क के रूप में व्याख्या की जानी चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एमिनो एसिड मात्रा (G)
एडिनाइन सल्फेट * 0.2
एल Tryptophane 0.4
एल tyrosine 0.3
एल फेनिलएलनिन 0.5
एल Glutamic एसिड (मोनोसोडियम नमक) 1.0
एल asparagine 1.0
एल valine 1.5
एल Threonine 2.0
एल सेरीन 3.75
Uracile 0.2
एल Histidine एचसीएल 0.2
एल Arginine एचसीएल 0.2
एल Methionine * 0.2
एल Lysine * 0.2
एल Leucine 0.6
* (इस प्रोटोकॉल के रूप में) मानक पीसीए प्रदर्शन कर लेकिन अन्य प्रयोजनों के लिए जोड़ा जा सकता है जब वापस ले लिया।

तालिका 1:। MTX माध्यम में 10X -lys / मुलाकात / एडीई ड्रॉप आउट की संरचना मात्रा 10x ड्रॉप आउट की एक लीटर के लिए कर रहे हैं। तारों के मानक MTX माध्यम के लिए वापस लिया जाना चाहिए कि यौगिकों निरूपित, लेकिन यह है कि अन्य प्रयोजनों के लिए जोड़ा जा सकता है।

पूरक तालिका 1:। 12 परीक्षण प्लेटों से संयुक्त डेटा तालिका 1 concatenated दा होता हैImageJ विश्लेषण से टा प्रत्येक पंक्ति में प्रत्येक 1536 सरणी पर एक भी स्थिति के लिए इसी के साथ एक कस्टम ImageJ स्क्रिप्ट का उपयोग कर प्रदर्शन किया। इसके अलावा, प्रत्येक पंक्ति, ओआरएफ और प्रोटीन नाम दोहराने, छवि फ़ाइल, DHFR संग्रह प्लेट के बारे में जानकारी के साथ एनोटेट कर दिया गया है।

पूरक तालिका 2:। तनाव औसत प्रति सामान्यीकृत विकास तालिका 2 मानक विचलन के साथ संग्रह की प्रत्येक तनाव के लिए औसत प्रवेश दो सामान्यीकृत विकास होता है। छानने का preys, हिट और ज्ञात भौतिक interactors अलग कॉलम में पहचाने जाते हैं।

Discussion

हम उच्च throughput पर किसी भी चारा प्रोटीन के लिए शारीरिक interactors के व्यवस्थित पहचान को सक्षम करने DHFR-पीसीए परख के आधार पर एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल अधिक फँसाना के लिए स्क्रीनिंग द्वारा रूपांतरित, और इस प्रतिकृति के किसी भी वांछित स्तर पर किया जा सकता है। हम परमाणु ताकना परिसर में शामिल एक चारा प्रोटीन के लिए शारीरिक बातचीत भागीदारों की पहचान करके इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता का प्रदर्शन: Nup82। हमारे विश्लेषण खमीर प्रोटीन interactome अध्ययन करने के लिए विधि की क्षमता पर प्रकाश डाला, पांच जैसा कि पहले बताया interactors और एक पहले से unreported interactor (आंकड़े 3F और 3 जी) को खोजने के लिए सक्षम होना चाहिए।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगकर्ता ध्यान देना चाहिए, जो करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है। हम चारा DHFR एफ [1,2] संलयन (चित्रा 1 बी) सही है कि सुनिश्चित कर लें) 1 करने के लिए सलाह देते हैं; इस निर्माण और measur अनुक्रमण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैएक विरोधी DHFR एफ [1,2] या विरोधी DHFR एफ [3] एंटीबॉडी का उपयोग उचित प्रोटीन अभिव्यक्ति आईएनजी; 2) स्क्रीन शुरू करने से पहले, यह ब्याज की किसी भी प्रलोभन पीसीए स्क्रीन में अनेक बातचीत दर्शाती यदि सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है। यह उचित एल DHFR नियंत्रण के साथ या मैन्युअल उपयुक्त एल DHFR नियंत्रण के साथ चारा संभोग और MTX माध्यम में एक विकास परख प्रदर्शन से पार फँसाना के साथ नियंत्रण स्क्रीन प्रदर्शन से किया जा सकता है। वे नमी छपाई की प्रक्रिया के दौरान अगर सतह पर सेल पालन के लिए इष्टतम है इतना है कि इस्तेमाल कर रहे हैं इससे पहले 3) प्लेट्स दिन डाला जाना चाहिए; 4) स्रोत प्लेटें गंतव्य थाली पर पर्याप्त कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए चार से अधिक बार इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। गंतव्य थाली की प्रतियों की संख्या बढ़ाने से विस्तार की लगातार कदम (-> 16 प्रतियां -> 64 प्रतियां जैसे चार प्रतियां) द्वारा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं लॉन पर या प्रतिकृति के विभिन्न दौर के बीच कॉलोनी में विभिन्न पदों पर चुना जा सकता है; 5) यदि कई Positions द्विगुणित चयन (एस), स्रोत प्लेटें संभोग चरण में भी कई बार इस्तेमाल नहीं किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें के बाद याद कर रहे हैं (4.5-4.7 कदम); 6) MTX मध्यम सही सांद्रता में सभी आवश्यक सामग्री शामिल है कि सुनिश्चित करें। सभी में कोई वृद्धि MTX माध्यम पर मनाया जाता है यदि वास्तव में, यह हो सकता है या तो कोई बातचीत हित के प्रोटीन के लिए या MTX मध्यम ठीक से तैयार नहीं किया गया था क्योंकि पीसीए द्वारा detectable है। मध्यम DHFR complementation टुकड़े दिखा उपभेदों के विकास की अनुमति देता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, एक विधान बातचीत संग्रह के खाली पदों पर जोड़ा जाता है और इस तरह के leucine जिपर moieties 33 (चित्रा 1C) से जुड़े हुए DHFR-टुकड़े के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। संयोजक-DHFR टुकड़े या जिपर-संयोजक-DHFR टुकड़े का उपयोग कर समानांतर परीक्षण Descr के रूप में, झूठी सकारात्मक बातचीत बनाने के लिए करते हैं कि सभी कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति की स्थिति है कि (कम MTX एकाग्रता या चारा प्रोटीन के बीच भेदभाव करने की अनुमति देगानीचे ibed) और सभी उपभेदों के विकास (MTX एकाग्रता बहुत अधिक या अनिवार्य अंग माध्यम में लापता) को रोकने की स्थिति है कि; उदाहरण के लिए, पिन उपकरण प्रतिकृति राउंड और / या आखिरी पानी के बीच ठीक से निष्फल नहीं है, अगर 7) पीसीए दूसरे के लिए एक मध्यम से अनुकरण के लगातार राउंड के माध्यम से किया जाता है यह देखते हुए कि, अलग प्लेटों के बीच उपभेदों के बीच पार संदूषण को हो सकती है नसबंदी प्रक्रिया में स्नान (यानी गीला स्टेशन) पिछले प्रतिकृति दौर की कालोनियों से दूषित कर रहा है। सरणियों पर कई पदों खाली हैं और इस तरह कोई विकास नहीं पार संदूषण का पता लगाने में मनाया जाना चाहिए जहां नियंत्रण के पदों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

छवि विश्लेषण कई प्रकाशित सॉफ्टवेयर्स (प्रोटोकॉल की धारा 5 देखें) या किसी भी कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग किया जा सकता है। 1) स्क्रिप्ट सह करने के क्रम में प्रत्येक थाली के मूल्यों पिक्सेल के लिए एक खाली थाली के पिक्सेल मूल्यों को घटा: इस अध्ययन में, कस्टम स्क्रिप्ट निम्न चरणों को कार्यान्वितरोशनी पूर्वाग्रहों के लिए rrect। 2) स्क्रिप्ट बढ़त कालोनियों पर एक आयत overlaying द्वारा निर्धारित प्रत्येक थाली में से प्रत्येक के 1536 पदों के लिए) 10. 3 के एक पिक्सेल मूल्य दहलीज का उपयोग कर द्विआधारी करने के लिए प्रत्येक पृष्ठभूमि सही तस्वीर बदल देता है, स्क्रिप्ट ImageJ "कणों का विश्लेषण करें रन ... एक परिपत्र चयन में "समारोह। परिपत्र चयन दो पदों पर शून्य से 10 पिक्सल के बीच के अंतराल के बराबर एक त्रिज्या के साथ स्थापित किया जाएगा। 4) स्क्रिप्ट चयन के केंद्र से निकटतम कण का चयन करता है और उसके स्थान दो कालोनियों के बीच नहीं आधे से अधिक अंतराल दूर चयन के केंद्र से अगर एक कॉलोनी के रूप में यह पुष्टि करता है। 5) स्क्रिप्ट पृष्ठभूमि सही तस्वीर पर चयनित कण के पिक्सेल मूल्यों के उपाय। 6) आगे किसी भी शेष पृष्ठभूमि रोशनी पूर्वाग्रहों को ठीक करने के लिए स्क्रिप्ट कॉलोनी के पिक्सेल मूल्यों के लिए एक कण का हिस्सा नहीं थे कि परिपत्र चयन से सभी पिक्सल का मतलब मूल्य को घटा देती है। इन सुधारा पिक्सेल मूल्य का योगपूरक 1 टेबल का स्तंभ "IntDenBackSub" में संग्रहित है, कॉलोनी आकार का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।

विश्लेषण भाग के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम महत्व दहलीज की पसंद है। यहाँ, हम नकारात्मक एल DHFR एफ [3] नियंत्रण के वितरण पर आधारित एक सीमा से चुना है, लेकिन स्क्रीन के उद्देश्य पर निर्भर करता है, इस तरह की दहलीज भी कठोर हो सकता है। पूरक टुकड़े अनायास एक दूसरे के पूरक हो सकता है और इन इस प्रकार सबसे अधिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि नहीं हैं कि दरअसल, एल DHFR एफ [3] नियंत्रण overexpressed कर रहे हैं (मजबूत TEF प्रमोटर) इस तरह के। इस एल-DHFR एफ के वितरण [3] नियंत्रण पृष्ठभूमि विकास (चित्रा 3 डी) के औसत से अधिक है कि इस तथ्य से प्रकाश डाला है। इस प्रकार, कुछ इस कड़े सीमा से नीचे के स्कोर होने बातचीत लेकिन उस पृष्ठभूमि विकास वितरण के बाहर स्पष्ट रूप से कर रहे हैं उदाहरण के लिए, क्षणिक या कमजोर इंटर के लिए प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि ख्यात मारता है, के रूप में माना जा सकता हैकार्रवाई। ये आगे का अध्ययन किया जा सकता है और उदाहरण के लिए, दो प्रोटीन एल DHFR नियंत्रण जैसे DHFR टुकड़े की सहज complementation अनुमति दे सकते हैं कि स्तर पर व्यक्त नहीं कर रहे हैं, अगर पार पुष्टि। एक विकल्प के रूप में, एक झूठी सकारात्मक से अधिक सच सकारात्मक का अनुपात को अधिकतम करने के क्रम में BioGRID 35 की तरह डेटाबेस में रिपोर्ट शारीरिक interactors साथ ओवरलैप के अनुपात के आधार पर एक महत्व सीमा निर्धारित कर सकता है। उदाहरण के लिए, ज्ञात भौतिक interactors की संख्या पर्याप्त उच्च नहीं है हालांकि, अगर एल DHFR वितरण के उपयोग के विपरीत, इस विकल्प हमेशा संभव नहीं हो सकता। इसके अलावा, महत्व दहलीज के चुनाव को अंतिम डेटा सेट में झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक के अनुपात पर एक प्रभाव है। जैसा कि पहले उल्लेख उदाहरण के लिए, प्रोटीन अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है, वास्तव में, अगर किसी भी अन्य पल्स पोलियो टीकाकरण का पता लगाने परख की तरह, झूठी सकारात्मक DHFR-संलयन प्रोटीन के साथ एक प्रोटीन की unspecific बातचीत से परिणाम कर सकते हैं। यहकुछ preys के व्यवस्थित ढंग से इस प्रकार, पीसीए स्क्रीन में सभी चारा प्रोटीन के साथ बातचीत और तथ्य यह है कि द्वारा उदाहरण है, विश्लेषण 11 (जैसे Tef2 और Ade17 और पूरक तालिका 2) से हटा दिया जाना चाहिए। इस समस्या को उचित एल DHFR नियंत्रण के खिलाफ दो संग्रह की एक नियंत्रण पीसीए स्क्रीन नाकाम करने के लिए (एफ [1,2] या एफ [3]) सहज DHFR complementation विशेष परिस्थितियों में किया जा सकता टुकड़े का प्रदर्शन फँसाना और preys की पहचान करने के लिए प्रत्येक स्क्रीन की। एक दिया चारा के समारोह में जाना जाता है इसके अलावा, अगर एक जीन आंटलजी संवर्धन विश्लेषण प्रदर्शन डेटा में आत्मविश्वास बढ़ा सकते हैं। दूसरी ओर, DHFR-पीसीए कई कारणों के लिए झूठी नकारात्मक को जन्म दे सकते हैं: 1) सभी प्रोटीन इन प्रोटीनों को अस्थिर या अगर उदाहरण के लिए, उनके स्थानीयकरण संशोधित कर सकते हैं के रूप में DHFR टुकड़े करने के लिए इनकार किया जा सकता है नहीं, करने के लिए DHFR संलयन सी टर्मिनस एक स्थानीयकरण संकेत के साथ हस्तक्षेप; कुछ सेलुलर डिब्बों मीटर में 2) DHFR पुनर्गठनउदाहरण के लिए, फोलेट संश्लेषण के लिए एक आवश्यक अग्रदूत उपलब्ध नहीं है, अगर प्र फोलेट का उत्पादन नहीं; DHFR complementation 11 घटित करने के लिए 3) सी-टर्मिनी की जरूरत 8 एनएम की दूरी के भीतर हो। उनकी सी टर्मिनी अंतरिक्ष में पर्याप्त बंद नहीं कर रहे हैं, इस प्रकार, यदि एक प्रसिद्ध बातचीत नहीं पाया जा सकता है। यह अप्रत्यक्ष कर रहे हैं, जिनमें से अधिकांश डेटाबेस, में सूचना दी Nup82 शारीरिक बातचीत का एक बड़ा अंश, हमारे परख में नहीं पाया गया है कि इस तथ्य से यहाँ उदाहरण है। DHFR complementation टुकड़े और 11 पता नहीं होगा करने के लिए इसी प्रकार, सी-टर्मिनी झिल्ली को पार सापेक्ष में हैं जिसके लिए झिल्ली प्रोटीन के बीच बातचीत का नेतृत्व नहीं करेंगे। सीमाएं 1) और 3) प्रोटीन के एन टर्मिनी को DHFR टुकड़ा fusing द्वारा अपेक्षाकृत बस उन्हें धोखा दिया जा सकता है। इतनी सी Termini के निकट एक स्थानीयकरण संकेत के साथ हस्तक्षेप करने के लिए रोक सकता है और जिसका झिल्ली प्रोटीन और एन सी टर्मिनस के बीच एक संवाद का पता लगाने के लिए अनुमति दे सकता सीआईएस सापेक्ष में कर रहाझिल्ली को।

कई चुनौतियों (2,3 में समीक्षा) पिन के अध्ययन में रहते हैं। अब तक का उत्पादन पिन के नक्शे काफी हद तक प्रत्येक प्रजाति के लिए एक एकल प्रायोगिक हालत में वर्णित किया गया है और इस तरह प्रोटीन नेटवर्क का आयोजन किया जा सकता है की एक एकल स्नैपशॉट की पेशकश की है। पिन विकास या निम्न म्यूटेशन भर में पर्यावरण परिवर्तन, विशिष्ट उत्तेजनाओं, के जवाब में पुनर्गठित किया जा सकता है देखने के लिए कैसे अन्य प्रयोगात्मक शर्तों के अन्वेषण के लिए एक की जरूरत इसलिए नहीं है। इन चुनौतियों जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में PPIs पूछताछ के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास के द्वारा और वे प्रयोगशालाओं का एक बड़ा समुदाय द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि मौजूदा तकनीक आदत डाल द्वारा दूर किया जाएगा। DHFR complementation की राशि में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं कि एक मात्रात्मक तकनीक 27 परिसरों के रूप में, DHFR-पीसीए इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और PPIs के एजेंट 22 को नुकसान पहुँचाए एक डीएनए से प्रभावित कर रहे हैं कि कैसे अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 25, जीन विलोपन 23,26 या अन्य खमीर प्रजातियों में और उनके संकर 33। इन नए आयामों की खोज पिन के गतिशील प्रकट करने के लिए अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा।

Disclosures

इस लेख के लिए खुला पहुँच प्रकाशन फीस का हिस्सा एस एंड पी रोबोटिक द्वारा भुगतान किया गया।

Acknowledgments

इस काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR) 191,597, 299,432 और 324,265, अनुदान द्वारा समर्थित किया गया एक प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा डिस्कवरी अनुदान के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल और सीआरएल करने के लिए एक मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान। सीआरएल एक CIHR नई अन्वेषक है। Guillaume Diss एक Proteo फैलोशिप द्वारा समर्थित है। सैमुअल Rochette NSERC और FRQNT फैलोशिप द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration S&P Robotics Inc. BM5-BC
96-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-96-10 Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins
384-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-384-10 Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins
1536-format Pin-tool S&P Robotics Inc. PH-1536-05 Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins
Automated imaging module  S&P Robotics Inc. IMG-02
Methotrexate  Bioshop Canada Inc. MTX440  CAUTION: toxic compound
Hygromycin B  Bioshop Canada Inc. HYG003
Nourseothricin dihydrogen sulfate Werner BioAgents 5010000
Yeast-Interactome Collection  Thermo Scientific YSC5849
Omni Tray w/lid sterile  Thermo Scientific 242811
Anti-DHFR F[1,2] antibody  Sigma-Aldrich D1067
Anti-DHFR F[3] antibody   Sigma-Aldrich D0942

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 97 प्रोटीन प्रोटीन बातचीत (पीपीआई); उच्च परिणाम स्क्रीनिंग; खमीर; प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (पीसीए); dihydrofolate रिडक्टेस (DHFR); उच्च घनत्व सरणियों; सिस्टम जीव विज्ञान; जैविक नेटवर्क
जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-टुकड़ा complementation परख (पीसीए) द्वारा जीनोम चौड़ा प्रोटीन प्रोटीन सहभागिता स्क्रीनिंग
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Rochette, S., Diss, G., Filteau, M., More

Rochette, S., Diss, G., Filteau, M., Leducq, J. B., Dubé, A. K., Landry, C. R. Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells. J. Vis. Exp. (97), e52255, doi:10.3791/52255 (2015).

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