Introduction
Protein interaksjon nett (PIN) har en lav oppløsning kart over hvordan proteiner er funksjonelt organisert i cellen 1. Hver fysisk forbindelse mellom to proteiner eller protein-protein interaksjoner (PPI), kan representere en forening som er stabil med tiden, slik som de som finnes i proteinkomplekser og som bidrar til den strukturelle organisering av cellen. Disse tilkoblingene kan også representere forbigående foreninger som regulerer aktiviteten, stabilitet, lokalisering og interaksjoner mellom de to partnerne. Identifisere de fysiske interaksjonspartnere til et gitt protein gir derfor rik informasjon om funksjon og regulering av at protein 2,3. For disse grunner har store anstrengelser blitt satt mot kartlegging av PIN-koder i modellorganismer, inkludert Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, elegans Caenorhabditis 14 og Homo sapiens 15. Disse studiene har gitt viktig innsikt i hvordan proteiner er organisert i cellen og dermed nøkkelinformasjon om proteiner med tidligere ukjente funksjoner.
Flere strategier har blitt utviklet gjennom årene for å studere PIN-koder. Disse teknologiene kan grovt deles inn i tre kategorier basert på hva slags informasjon de gir på PPIs (anmeldt i 16-18). Den første er basert på gjær to-hybrid og dets derivater 19. Disse teknologiene gir informasjon om den direkte sammenhengen mellom par av proteiner, som gjør det mulig å konstruere binære nettverk. Den andre familie er basert på affinitetsrensing av agn proteiner og identifisering av de tilknyttede partnere, som f.eks affinitetsrensing etterfulgt av massespektrometri 20. Disse tilnærmingene identifisere grupper av proteiner som er direkteeller indirekte forbundet, generelt på en stabil måte, og er meget kraftige til å identifisere proteinkomplekser. Den tredje tilnærmingen er basert på protein-fragment komplemente analyser (PCAs) 11,21. Denne tilnærmingen gir et middels nivå av oppløsning mellom de to tidligere tilnærminger, som gjør det mulig å påvise direkte og proksimale assosiasjoner mellom proteiner. Hver teknikk har sine egne styrker og svakheter, som nylig anmeldt 18.
Den best beskrevet eukaryote PIN er den desidert en av de spirende gjær Saccharomyces cerevisiae, delvis fordi dens proteom- er relativt mindre kompleks enn de andre modell eukaryoter og fordi high-throughput analyser for å påvise PPIs først har blitt analysert og er mer effektivt implementert i denne modellorganisme 9-12. En spesielt kraftig metode for gjær systemet er dihydrofolatreduktase protein-fragment komplemente assay (DHFR-PCA), en metode som har værtbrukes i ulike sammenhenger for å studere gjær PIN i standard og perturbed forhold 11,22-26. Denne metoden er avhengig av en overlevelse analyse som gjør det mulig å påvise direkte og nesten direkte PPIs for en gitt agn protein på både endogene uttrykk nivåer og innfødte subcellulære lokaliseringer av interaksjonspartnere 11,21 i en kvantitativ måte 27. Den oppnådde ved hjelp av denne analyse (dvs. kolonistørrelse på høy tetthet koloni arrays) signal reflekterer således mengden av proteinkomplekser dannet mellom agn og byttedyr i et cellulært miljø nesten ekvivalent med en av villtype-celler. Analysen er basert på omdanning av et reporter-enzym som er involvert i folatmetabolismen, dihydrofolat reduktase (DHFR), hvorved to komplementære fragmenter av DHFR som er smeltet sammen med de to proteiner av interesse bringes i nærhet når de to proteiner påvirker hverandre, der i sin tur fører til reversible rekonstituering av enzymaktiviteten 11 og vekst av stammen på et medium inneholdende methotrexat (MTX; figur 1). Denne forbindelse hemmer den endogene DHFR-enzymet, men ikke den muterte en benyttet i analysen 28. To samlinger av PCA stammer, en som inneholder ~ 4300 Mata-stammer med en ORF smeltet til DHFR F [1,2] fragment og en som inneholder ~ 4800 MAT α stammer med en ORF smeltet til DHFR [3] fragment, kan kjøpes til implementere DHFR-PCA på liten eller stor skala i ethvert laboratorium. Her beskriver vi en generell men detaljert protokoll til skjermen for PPIs mellom ett agn protein og ~ 4800 byttedyr proteiner ved hjelp av denne analysen.
Protocol
1. Konstruksjon / verifisering av Bait Stammer
- Hvis agn stamme av interesse er tilgjengelig i Mata DHFR F [1,2] samling, hente det fra samlingen som beskrevet i trinn 1.1.1, ellers konstruere belastningen som beskrevet i trinn 1.1.2.
MERK: Protokollen er beskrevet her bruker en DHFR F [1,2] belastninger som agn og DHFR F [3] samling som byttedyr, som denne samlingen inneholder flere påkjenninger enn DHFR F [1,2] samling. Det er imidlertid mulig å utføre skjermen omvendt hvis agnet belastning er bare tilgjengelig i DHFR-F [3] samling eller i begge retninger hvis man trenger større dekning av interactome.- Tine glycerol lagerplate som inneholder agn belastningen på is i en time. Sterilaluminiumsfolie som dekker platen ved hjelp av 95% etanol. Stikk hull på folien med en steril spiss, pipette opp og ned for å suspendere cellene og strek 2-3 mL av glyserol lager på selektiv gjærekstrakt peptonedekstrose (YPD) + 100 ug / ml Nourseothricin (NAT) for å isolere enkeltkolonier. Inkuber i to dager ved 30 ° C.
- Bygging av et agn PCA stamme (MATA DHFR F [1,2]).
- Ved hjelp av høy-fi-polymerase og en standard PCR-protokollen, forsterke DHFR F [1,2] kassetten fra plasmid pAG25-linker-DHFR F [1,2] -ADHterm ved hjelp av oligonukleotider med overhengende ender som er homologe til den siste 40 bp av ORF største 3'-ende med unntak av stoppkodonet (forover primer) og til den første 40 bp av genets 3'-UTR (revers primer) (figur 1A).
- Forvandle PCR produkt til kompetente gjærceller (vanligvis i en BY4741 belastning) ved hjelp av standard LiOAc / PEG gjær transformasjon protokoll som i 29 (figur 1A).
- Plate på selektiv YPD + Nat medium å isolere positive transformanter.
- Utføre en diagnostisk koloni PCR på isolerte kolonier for å bekrefte den riktige DHFR F [1,2] fusjon. Bruker primers annealing 1) i genet kodende sekvens (Forward oligo) ca. 100 bp oppstrøms for DHFR-fusjon og 2) i ADH-terminatoren av kassetten (Revers oligo) (figur 1B).
- Sekvensere PCR produkt av Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig genfusjon.
- Arkivere bekreftet agn belastning i 25% glyserol ved -80 ° C.
MERK: Protokollen kan bli stanset på dette trinnet.
2. Pin-verktøy Sterilisering og Skrive Prosedyrer
MERK: sterilisering prosedyren beskrevet nedenfor ble optimalisert for pin-verktøy manipulert av den BM3-BC (S & P Robotics) robot plattform, men kan tilpasses andre plattformer også. Denne delen beskriver Pin-verktøy sterilisering og utskrift prosedyrer som brukes til å overføre celler fra ett medium til et annet for resten av protokollen. In-house skript brukes til å utføre disse rutinene kan fås på forespørsel. Note that alle trinn kan utføres uten behov for en robot plattform ved hjelp av en manuell pin-verktøy 30.
- Montere riktig pin-verktøy på robot plattformen.
- Forbered rengjøring og våte stasjoner som følger:
- Legg 500 ml sterilt vann i vannbadet stasjonen.
- Legg 320 ml sterilt vann i børstestasjonen.
- Legg 380 ml av 70% etanol i en sonikator når replikerende fra agar-plate (86 x 128 mm omnitray, inneholdende 35 ml av størknet medium) til agar plate, eller 400 ml ved å replikere i en mikrotiterplate inneholdende flytende kulturer til en agar-plate.
- Legg 35 ml av sterilt vann i den våte stasjonen (som består av en steril tom omnitray).
- I begynnelsen av hver dag som krever robot plattform, sterilisere pin-verktøy fem ganger for en min i sonicator bad. I mellomtiden, slå på UV-lampe for fem min å sterilisere roboten kabinett.
MERK: Dette er ikke nødvendig dersom raneot ligger under en steril hette. - Mellom hver pin-verktøy replikering runde, sterilisere pin-verktøyet som følger:
- Suge pin-verktøyet fem ganger for 10 sek i vannbad stasjonen for å fjerne celleklumper.
- Suge pin-verktøyet to frem og tilbake i børsten stasjonen.
MERK: Den roterende børste vil fjerne rester av celler. - Suge pin-verktøy to ganger for 20 sek i sonicator stasjonen.
MERK: Gjenværende celler på pinnene vil bli fjernet av ultralyd eller drept av etanol. - Kontroller at dipping dybden av pinnene øker på hver påfølgende bad for å sikre riktig sterilisering.
- Tørk pin-verktøy i luft tørketrommel stasjon for 25 sek.
- Før du tar celler på kildeplater, våt pinnene i den våte stasjon, som inneholder 35 ml sterilt vann i en omnitray.
- Dypp pinnene to ganger i de kolonier fra kilden plate.
- Skriv ut på en nytappet reisemålet plate ved å berøre agar overflaten to ganger (heretter kalt handlingen av "utskrift" en array).
3. Kondens av DHFR F [3] Collection i 1536 Arrays Bruke en Automated Robotic Platform
- Tine på is DHFR-F [3] samling (60 96-brønners plater), og en ytterligere 96-brønners plate som er fylt med L-DHFR-F [3] kontrollstammen (figur 1C), som inneholder DHFR-F [3] fragment og oppstrøms linker uttrykt alene som en negativ kontroll.
MERK: I prinsippet dette fragment skal ikke kommunisere med noen DHFR-fragment fusjonsprotein (se omtale for detaljer). - Sentrifuger plater (rask spinn) før du fjerner aluminiumsfolie for å unngå risiko for krysskontaminering blant brønner.
- Kondensere samling på 16 matriser av 384 stammer (Figur 2A). For å gjøre dette, for hver 384 array, print fire glyserol plater på de fire kvadrantene av en selektiv YPD + 250 mikrogram / ml Hygromycin B (HygB) omnitray hjelp the 96 pin-verktøyet (her, en matrise 384 kan deles i fire like kvadranter avstandsplasserte, hver bestående av 96 posisjoner i en 2 x 2-matrise layout). Sett fire 96-brønners plater inneholdende L-DHFR-F [3] negativ kontroll i mellom de 60 andre plater for å få en endelig sett av plater 64 som akkurat fyller fire 1536 matriser. Steriliser pin-verktøyet mellom hver replikasjonssyklus som beskrevet i trinn 2.
BEMERK: Før L-DHFR F [3] plater for å få en slik plate på hver av de fire siste 1536 matriser. - Inkuber platene i to dager ved 30 ° C. MERK: På dette stadiet, kan DHFR samling lagres i en 384-format ved 4 ˚C i opptil én måned på agarskåler.
- Kondensere samlingen i fire rekker av 1536 stammer (Figur 2A). For å gjøre dette, for hver 1536 array, skrive ut fire matriser av 384 stammer på de fire kvadrantene av en plate av samme medium som i trinn 3.2 med 384 pin-verktøy (her kan en 1536 matrise deles i fire equally interspaced kvadranter som hver består av 384 stillinger i en 2 x 2 matrise layout).
- Inkuber platene i to dager ved 30 ° C. MERK: På dette stadiet, kan DHFR samling lagres i en 1536-format ved 4 ˚C i opptil én måned på agarskåler.
- Replikere de fire arrays på samme medium for å standardisere koloni størrelse ved hjelp av en 1536 pin-verktøyet.
- Inkuber plater i to dager på 30 ˚C.
4. Høy throughput DHFR-PCA Prosedyre
- Inokulere en kultur av agnet stamme (DHFR F [1,2] fusion) oppnådd fra trinn 1.1.1 og 1.1.2 i 20 ml flytende YPD + Nat i et 50 ml rør (figur 2B).
- Inkuber i to dager ved 30 ° C med risting ved 250 rpm for å tillate kulturen å nå metning.
- Etter to dagers inkubering, plate 5 ml av kultur på et YPD + Nat omnitray. La celler adsorberes på overflaten i 5 til 10 minutter, og fjerne overskudd av væske (figur 2B). Gjenta twice å lage tre gjentak.
- Inkuber i to dager ved 30 ° C.
- Skriv ut agnet belastningen fra trinn 4.3 og 4.4 på 12 YPD plater (nok til å parre fire plater av DHFR F [3] samling × tre replikat) med en 1536 pin-verktøy bruker hver celle plenen ikke mer enn fire ganger.
- Print passende utvalg av DHFR-F [3] samling på toppen av agnet celler ved hjelp av tappen 1536-verktøyet (figur 2C).
- La stammer parre ved inkubering i to dager ved 30 ° C.
- Velg diploide celler ved å skrive kolonier på omnitrays inneholder YPD + HygB + Nat (Figur 2C).
- Inkuber i to dager ved 30 ° C.
- Gjenta diploide seleksjons som beskrevet i trinn 4.8 og 4.9 (figur 2B).
- Forbered plater med medier som inneholder metotreksat (MTX medium) en dag før bruk følge disse trinnene 21 (OBS:. Være forsiktig når du arbeider med metotreksat som det er et giftstoff alltid hansker, proteDette skjer briller og en frakk når du håndterer det) (Figur 2C):
- Forberede 10x -Lys / møtt / ade aminosyre drop-out i avionisert vann. Filter-sterilisere drop-out i en steril flaske ved hjelp av en 0,2 mikrometer steril sprøyte filter eller, om nødvendig i store mengder, en 0,2 mikrometer flaske topp filtrering trakt (tabell 1).
- Forberede en 10 mg / ml MTX stamløsning i dimethylsulfoxyd (DMSO). Bruk umiddelbart etter tilberedning av oppløsningen og fryse resten ved -20 ° C. Beskytte mot lys, som det er lysfølsomt. Ikke fryse MTX igjen etter tining det.
- Forberede media som følger (mellom ingredienser og mengder er de samme som de som brukes i Tarassov et al. 11):
- For en liter medium, bland i to separate kolber: 1) 6,69 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer og uten ammoniumsulfat og 330 ml avionisert vann; 2) 25 g edel agar og 500 ml avionisert vann.
- Autoklav kolber ved 121 ° C i 20 min.
- Ekvilibrere temperaturen i et vannbad ved 55 ° C i minst en time.
- Bland de to kolber sammen og tilsett 50 ml sterilt 40% glukose, 100 ml 10x steril drop-out, og 20 ml av MTX 10 mg / ml.
- Hell 35 ml (se merknad nedenfor) av medium i omnitrays. La stivne i minst en og en halv time. Skjermplater fra lys.
MERK: Her helle 35 ml medium pr omnitray er kritisk for å sikre lik platetykkelsen, noe som er viktig for alle nedstrøms trinn.
- Bilde plater fra den andre runden av diploid utvalg med robot plattform eller med et vanlig digitalkamera med uniform plate belysning. Bruke disse bildene for å identifisere tomme posisjoner på arrays når du utfører genetisk analyse. Pass på at parametrene til kameraet er alltid den samme og at roboten lyset er slått på.
- Skriv ut diploide celler på MTX media USIng av 1536 pin-verktøyet.
- Inkuber i fire dager ved 30 ° C i plastposer for å hindre uttørking.
- Forberede en andre parti av omnitrays inneholder MTX medium som beskrevet i trinn 4.11.
- Etter fire dager med inkubasjon, fosforplater med robot plattform eller vanlig digitalkamera. Pass på at parametrene til kameraet er alltid den samme og at roboten lyset er slått på.
- Utføre en ny runde med MTX utvalg ved å kopiere cellene på den andre parti av MTX media.
MERK: Dette vil redusere bakgrunns vekst av PCA stammer og øke den kvantitative oppløsning. - Inkuber i fire dager ved 30 ° C i plastposer for å hindre uttørking.
- Fosforplatene som beskrevet i trinn 4.16.
5. Bildeanalyse
- Analysere bilder av koloni arrays med tilpassede ImageJ 31 skript eller bruke publiserte programvare som Colonizer, Ht koloni grid analysator, Cell profiler, Colony bilder, ScreenMill, YeastXtract og gitter (kompilert i 32). Bildeanalyse bør utgang ett eller flere regneark som inneholder koloni størrelser for hver posisjon av hver matrise, bruke disse kolonistørrelser for alle nedstrøms analyser.
MERK: I denne studien brukte vi en tilpasset ImageJ skript beskrevet i Leducq et al 33 (se diskusjon seksjon for mer informasjon)..
6. Data Analysis
MERK: Resultater fra bildeanalyse kan behandles i en tabulator som excel eller bruke et skriptspråk som R 34. Følgende trinn beskriver prosedyren ved hjelp av en tilpasset ImageJ 31 script.
- Ved hjelp av en egendefinert skript, sette sammen utdatafiler fra bildeanalyse og kommentere hver rad med platen og sil informasjon som i Tilleggs tabell 1.
- Logg to transformere koloni størrelse verdier (Integrated tetthet eller koloniområde, her, kolonne "IntDenBackSub & #8221; fra Supplerende Tabell 1 ble brukt).
MERK: Verdi distribusjon vil se ut som i figur 3A. - Normalisere disse verdier ved å subtrahere medianverdien for hver plate.
MERK: Dette trinnet kontroller for plate skjevhet som kan skyldes ulik media mengde eller variasjon i automatisk image oppkjøpet, og reduserer den inter-replikere varians (Figur 3B). - Verifisere at replikater korrelerer med hverandre (figur 3C) for å vurdere reproduserbarheten av forsøkene.
- For å skille samspill fra ikke-samspill agn og byttedyr parene, satt en høy tillit terskel som tilsvarer de 95 persentilen av fordelingen av L-DHFR F [3] kontroller.
NB: I dette forsøk tilsvarer dette 3.39 (Figur 3D). Alternativt, kan en terskel basert på den overlapper med kjente fysiske interactors slik som de rapportert i BioGRID 35 benyttes.Se diskusjon for flere detaljer. - For noen agn, jakter filter identifisert som involvert i falske positive interaksjoner i DHFR-PCA-skjermer (se diskusjon for flere detaljer) og oppført i Tilleggs Tabell 2 (identifisert som "1" i kolonnen "filtrert").
- Gjennomsnitt de log2 normalisert koloni størrelser av de tre replikater av hver interaksjon (kolonne "Fordeling" i Tilleggs tabell 2).
7. Validering av Fysisk Interactors hjelp småskalaforsøk
MERK: Enhver PPI av spesiell interesse å ha en poengsum over eller nær søkt terskelen kan bli godkjent for bruk av DHFR-PCA-analysen i en liten skala eksperimentell design ved hjelp av en vekstanalyse på fast eller flytende MTX medium. Trinnene nedenfor viser prosedyren for å konstruere diploide PCA stammer manuelt og utføre stikk analyser på MTX medium. Eksperimentator bør utføre disse trinnene for alle imidlertid nødvendigy kontroller (Agn-DHFR F [1,2] x L-DHFR-F [3], Zipper-linker-DHFR diploide stammer og linker-DHFR diploid stamme).
- Plate 2-3 mL av glyserol lager av agn belastning generert i 1.1.2.6), L-DHFR F [3] kontroll belastninger, Zipper-linker-DHFR og linker-DHFR diploide belastning på YPD + Nat, YPD + HygB og to ganger YPD + Nat + HygB medier, henholdsvis.
- Hente byttet av interesse i DHFR F [3] samling og følg instruksjonene i trinn 1.1.1, men strek belastningen på YPD + HygB medium i stedet for YPD + Nat medium.
- Utføre en diagnostisk PCR som i 1.1.2.4 for å bekrefte DHFR F [3] fusjon ved byttet locus og sekvens produktet.
- Inokuler 1 ml flytende YPD-medium med den haploide stammer for å parre (Agn x byttedyr, agn x L-DHFR-F [3] kontroll) og vokse i minst to dager ved 30 ° C for å tillate diploider å danne.
- Velg diploidene ved å stryke 4-5 mL av kulturen i 7.4 på solid YPD + HygB + Nat medium. Grow to dager ved 30 ° C.
- Select en isolert koloni og vokse over natten i flytende kultur (1 ml) for å utføre vekstanalyse.
- Forbered MTX og DMSO (samme ingrediensene som MTX medium, men uten MTX) plater en dag før bruk. Se trinn 4.11 for flere detaljer.
- Utføre vekstanalyse ved å fange opp serielle fortynninger av de forskjellige kulturer på styre (DMSO) og seleksjonsplater (MTX).
- Fortynne forkulturer til OD = 1.
- Utføre fem-gangers fortynninger (opp til en faktor på 625 fortynning) i en steril 96-brønns plate.
- Spot 4 mL av hver fortynning på PCA media (DMSO og MTX).
- Inkuber ved 30 ° C i plastposer for å hindre uttørking.
- Fosforplatene fra dag 1 til 7 av inkubasjon ved hjelp av robot plattform eller et vanlig digitalkamera.
Representative Results
Tilsetnings Tabell 2 viser et eksempel på representative resultater oppnådd ved anvendelse av gjær-protein Nup82 kondensert til DHFR-F [1,2] fragment som agn. Terskelen definert med L-DHFR-F [3] kontroller kan brukes som en empirisk terskel for å bestemme høye pålitelighets treff (figurene 3D og 3E). Alternativt kan poengsummen rangeringen brukes til å utføre Gene ontologi enrichments eller andre funksjonelle analyser 36 basert på gullstandard 37. De kjente fysiske interactors av agn kan hentes fra databaser som BioGRID 35 og kledde på data (Tall 3E og 3F). I dette eksempelet har fem av åtte høy tillit treff tidligere blitt rapportert som Nup82 interactors og to er en del av Nup82 subcomplex, Nup116 og Nup159 (Figur 3F & 3G). Det andre medlemmet av komplekset, Nsp1, ikke viser noen intesjon i vårt eksperiment. To byttedyr, Ade17 og Tef2 (ikke vist i Figur 3F), hadde skårer over den harde terskel brukt, men disse vil trolig være falske positiver som de samhandler med nesten alle agn protein i PCA skjermene vi har utført (upubliserte resultater). På den annen side kan Pex30 representere en roman fysisk Interactor av Nup82 og vi var i stand til å bekrefte dette samspillet hjelp DHFR-PCA ved lav-gjennomløp (Figur 3G). Pex30 er en peroksisomal membran protein og noen direkte interaksjoner er rapportert mellom atom pore kompleks (NPC) og dette organelle. En to-hybrid skjerm identifisert to andre NPC protein, Nup53 og Asm4 (Nup59), som fysiske interactors av Pex30 38, og en genetisk interaksjon mellom Pex30 og Nup170 har blitt rapportert 39. To andre interaksjonspartnere oppdaget, Nup120 og Nup85 (Figur 3F & 3G), er ikke en del av Nup82 sub-kompleks, som illustrerer evnenav DHFR-PCA å oppdage interaksjoner innen og mellom subcomplexes i større komplekser 11.
Figur 1:. Engineering gjærstammer for høy gjennomstrømming DHFR-PCA (. Figur tilpasset fra Leducq et al 2012 33) (A) Bygging av haploide Mata og MAT α stammer å fusjonere Gene1 (G1) og Gene2 (G2) med DHFR F [1,2] -NatMX og DHFR-F [3] -HPH kassetter, hhv. Kassetter forsterkes fra plasmider pAG25-DHFR F [1,2] og pAG32-DHFR F [3] med termin primere G1-5 "og G2-5", og omvendt primere G1-3 "og G2-3", og deretter innføres i genomet ved 3'-enden av mål-genet ved homolog rekombinasjon. De resulterende proteiner, P1 og P2 er henholdsvis sammensmeltet til DHFR F [1,2] fragment (Mata) og DHFR-F [3] fragment (MATα) via en fleksibel linker. (B) Verifisering av konstruksjonen i (A) utføres ved å sekvensere overgangene mellom Gene1 og Gene2 s ORF og DHFR-kassetten. De konstruerte PCA stammer av motstridende parring typer er så parret for å danne en diploid. Diploide stammer som vokser på MTX medium hvis de to komplementære DHFR fragmenter bringes i nærhet av en vekselvirkning mellom P1 og P2, noe som rekonstruerer aktiviteten av DHFR-enzymet. (C) Konstruksjon av styre diploid PCA stammer for DHFR-PCA-skjermer. De negative kontroller (L-DHFR) er konstruert ved å transformere separat haploide Mata og MATα stammer med plasmider p41-linker-DHFR F [1,2] og p41-linker-DHFR F, henholdsvis [3] 11. De to stammer er merte som resulterer i en negativ kontroll diploid stamme hvor DHFR-fragmentene er i standå utfylle hverandre (øverst). Positive kontroller er konstruert med samme tilnærming som for de negative kontroller, men plasmidene forvandlet i haploide stammer (p41-glidelås-linker-DHFR F [1,2] (p41-ZL-DHFR F [1,2]) og p41 -zipper-linker-DHFR-F [3] (p41-ZL-DHFR-F [3])) inneholder to parallelle GCN4 leucin-glidelås-fragmenter fusjonert til de komplementære DHFR-fragmenter, noe som fører til en sterk og konstitutiv interaksjon som rekonstruerer DHFR-aktivitet (bunn ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: High-throughput DHFR-PCA prosedyre (figur tilpasset fra Leducq et al 33.) (A) MAT α DHFR F [3] samling. kondenseres i en 1536-format gjennom to påfølgende runder med kondens. Først er glyserol lager plater kombinert med grupper på fire om selektiv YPD + HygB medium i en 384-format ved hjelp av 96 pin-verktøyet. For det andre er 384 arrays kombineres med grupper på fire om selektiv YPD + HygB medium i en 1536-format med 384 pin-verktøy. (B) Celle plenene i Mata PCA agn belastning er utarbeidet ved å dyrke en mettet kultur av agn belastning i selektiv YPD + Nat medium og plating kulturen på en YPD + Nat omnitray. (C) Disse plener brukes til å parre agnet stamme med DHFR F [3] samling på YPD medium. Celler blir suksessivt overført to ganger på YPD + HygB + Nat medium for å selektere for diploider og to ganger på MTX medium til å utføre PCA. Veksten vil bare bli observert på MTX medium dersom DHFR-fragmenter utfyller hverandre etter en samspill mellom agn og bytte proteiner.e.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3:. Dataanalyser gjennom trinnene med normalisering, bestemmelse av en terskel betydning og identifisering av positive interaksjoner (A) Tetthet fordeling av kolonistørrelse på hver plate (log 2) (B) Normalisering av medianen for hvert bilde korrigerer for skjevheter forbundet med plate-til-plate-effekter. (C) Heatmap viser Spearman korrelasjonskoeffisienten mellom platene, noe som bekrefter reproduserbarheten av fremgangsmåten. (D) Fordeling av poengsummene for de testede PPIer og L-DHFR-F [3] kontroller. En hard terskel kan settes til 95-percentilen av L-DHFR F [3] distribusjonen å identifisere høy grad av tillit PPIs (representert ved en stiplet vertikallinje). (E) Rank for fordeling av gjennomsnittlig score på hvert bytte. Tidligere rapportert fysiske interaksjonspartnere Nup82p i BioGRID 35 er identifisert av sirkler og de som er rapportert i denne studien er identifisert med røde prikker. Terskelen definert i (D) er vist som en stiplet linje. (F) Network viser høy grad av tillit PPIer identifisert i denne studien. Blå kanter viser tidligere rapportert fysiske interactors (BioGRID 35) og gule kanter viser en tidligere urapportert interaksjon med Pex30. (G) Spot-fortynningsanalyse av PCA diploide stammer involverer Nup82-DHFR F [1,2] og byttedyr-DHFR F [3 ] parene identifisert som fysiske interactors av Nup82p i denne studien. Vekstanalyse ble utført i DMSO-medium (MTX oppløsningsmiddel, venstre panel) og MTX-medium (høyre panel). Negative kontroller bestående av Nup82-DHFR F [1,2] - linker-DHFR-F [3], og linker-DHFR F [1,2] - linker-DHFR-F [3] og en positiv kontroll som består av tHan sterk interaksjon mellom to leucin glidelås delene (glidelås-DHFR F [1,2] - glidelås-DHFR-F [3]) ble inkludert. Cellevekst overlegen til de negative kontrollene i MTX medium bør tolkes som en fysisk interaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Aminosyre | Mengde (g) |
| Adenin sulfate * | 0.2 |
| L-Tryptofan | 0.4 |
| L-Tyrosin | 0.3 |
| L-Fenylalanin | 0.5 |
| L-glutaminsyre (mononatriumsalt) | 1.0 |
| L-asparagin | 1.0 |
| L-Valine | 1.5 |
| L-Threonine | 2.0 |
| L-serin | 3.75 |
| Uracile | 0.2 |
| L-histidin HCl | 0.2 |
| L-Arginine HCI | 0.2 |
| L-metionin * | 0.2 |
| L-lysin * | 0.2 |
| L-Leucine | 0.6 |
| * Tilbaketrukket når du utfører standard PCA (som i denne protokollen), men kan legges til andre formål. | |
Tabell 1:. Sammensetning av 10X -Lys / møtt / ade drop-out i MTX medium Mengder er for en liter 10x drop-out. Stjernene betegne forbindelser som bør trekkes tilbake for standard MTX medium, men det kan legges til andre formål.
Supplerende Tabell 1:. Kombinerte data fra de 12 prøveplater Tabell 1 inneholder den sammenslåtte data fra ImageJ analyse utført ved hjelp av en tilpasset ImageJ script med hver rad tilsvarer en enkelt stilling på hver 1536 array. I tillegg har hver rad blitt annotert med informasjon om bildefilen, DHFR samling plate, replikere, ORF og protein navn.
Supplerende Tabell 2:. Gjennomsnittlig normalisert vekst per belastning Tabell 2 inneholder gjennomsnittlig Log 2 normalisert vekst for hver stamme av samlingen sammen med standardavviket. Filtrerte byttedyr, treff og kjente fysiske interactors er identifisert i egne kolonner.
Discussion
Vi beskriver en protokoll basert på DHFR-PCA-analyse gjør det mulig systematisk identifisering av fysiske interactors for en gitt agn protein ved høy gjennomstrømning. Denne protokollen kan tilpasses ved screening for flere agn, og dette på en hvilken som helst ønsket nivå av replikasjon. Vi demonstrerer påliteligheten av denne protokollen ved identifisering av fysiske interaksjonspartnere for et agn protein involvert i Nuclear Pore Complex: Nup82. Vår analyse aktivert finne fem tidligere rapporterte interactors og en tidligere urapporterte Interactor (Tall 3F & 3G), fremhever muligheten av metoden for å studere gjær protein interactome.
Protokollen er beskrevet her inneholder flere kritiske trinn som eksperimentator bør ta hensyn. Vi anbefaler å 1) Kontroller at agn DHFR F [1,2] fusjon er riktig (figur 1B); Dette kan bli oppnådd ved sekvensering av konstruksjonen og Målting riktig protein ekspresjon ved hjelp av et anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR-F [3] antistoff; 2) Før du begynner skjermen, anbefales det å kontrollere om noen agn av interesse viser promiskuøse interaksjoner i PCA-skjermer. Dette kan gjøres ved å utføre kontrollskjermer med agn krysset med den passende L-DHFR-kontroll, eller ved parring manuelt agnet med det passende L-DHFR kontroll og utfører en vekstanalyse i MTX medium. 3) Plater bør helles dagen før de brukes slik at fuktighet er optimal for celle tilslutning på agar overflaten under trykkeprosessen; 4) Kilde platene ikke bør brukes mer enn fire ganger for å overføre nok celler på destinasjonen plate. Økende antall kopier av destinasjonen plate kan gjøres ved suksessive trinn av ekspansjon (f.eks 4 eksemplarer -> 16 eksemplarer -> 64 eksemplarer). Alternativt kan cellene bli plukket i forskjellige posisjoner på plenene eller i kolonien mellom ulike runder med replikering; 5) Hvis flere positions mangler etter den diploide utvalg (s), sørg for at kilde platene ikke ble brukt for mange ganger i parings trinn (trinn 04.05 til 04.07); 6) Kontroller at MTX medium inneholder alle essensielle ingredienser på de riktige konsentrasjoner. Faktisk, hvis ingen vekst i det hele tatt er observert på MTX medium, kan det være enten fordi ingen interaksjon er detekterbar ved PCA for proteinene av interesse, eller på grunn av MTX-medium ble ikke fremstilt på riktig måte. For å sikre at det medium som tillater vekst av stammer som viser DHFR fragmenter komplementering, kan en konstitutiv interaksjon legges på tomme stillinger innsamling og anvendt som en positiv kontroll, for eksempel DHFR-fragmenter fusjonert til leucin-glidelås-deler 33 (figur 1C). Parallelle tester ved hjelp av linker-DHFR fragmenter eller glidelås-linker-DHFR fragmenter vil tillate å diskriminere mellom forholdene som gjør at alle celler til å vokse (lav MTX konsentrasjon eller agn protein som har en tendens til å lage falske positive interaksjoner, som descrIbed nedenfor) og forhold som hindrer vekst av alle stammer (MTX For høy konsentrasjon eller viktig ingrediens mangler i medium); 7) Gitt at PCA utføres ved suksessive runder av replikasjoner fra ett medium til et annet, kan kryss-forurensning mellom stammene mellom forskjellige plater oppstå hvis, for eksempel, er pinne-verktøy ikke steriliseres skikkelig mellom replikasjonsrunder og / eller den siste vann bad (dvs. våt stasjon) i steriliseringsprosessen er forurenset av kolonier av tidligere replikering runder. Flere posisjoner på arrays er tom og kan dermed brukes som kontrollposisjoner hvor ingen vekst bør overholdes for å oppdage kryss forurensing.
Bildeanalyse kan utføres ved hjelp av flere publiserte programvare (se kapittel 5 i protokollen) eller eventuelle egendefinerte skript. I denne studien, utfører egendefinert skript følgende trinn: 1) Skriptet trekker fra pikselverdiene i en tom plate til pixel verdier av hver plate for å correct for skjevheter belysning. 2) Skriptet konverterer hvert bakgrunn korrigert bilde til binær ved hjelp av en pikselverdien terskel på 10. 3) For hver 1536 posisjonene til hver plate, fastsatt overliggende et rektangel på kanten kolonier, kjører skriptet ImageJ "Analyze partikler ... "-funksjonen i en sirkulær markering. Den sirkulære valg settes med en radius som tilsvarer intervallet mellom to stillinger minus 10 piksler. 4) Skriptet velger det nærmeste partikkel fra sentrum av utvalget og bekrefter det som en koloni hvis beliggenheten er ikke mer enn halvparten av intervallet mellom to kolonier unna sentrum av utvalget. 5) Skriptet måler pikselverdier for den valgte partikkel på bakgrunnskorrigerte bilde. 6) For ytterligere å rette opp eventuelle gjenværende skjevheter bakgrunn belysning, subtraherer skriptet middelverdien av alle piksler fra sirkulær utvalg som ikke var en del av en partikkel til pikselverdier i kolonien. Summen av disse korrigert pixel verdir, som er lagret i kolonnen "IntDenBackSub" av Tilsetnings tabell 1, blir brukt som et mål på kolonistørrelse.
Et kritisk trinn i analysen del er valget av betydningen terskel. Her har vi valgt en terskel basert på fordelingen av den negative L-DHFR-F [3] kontroller, men avhengig av formålet med skjermen, kan slik terskel være for strenge. Faktisk, L-DHFR F [3] kontroller er overuttrykt (TEF sterk promoter) slik at de komplementære fragmenter kan spontant utfyller hverandre, og disse er derfor ikke representativt for ekspresjon av de fleste proteiner. Dette understrekes av det faktum at fordelingen av den L-DHFR-F [3] kontroller er høyere enn gjennomsnittet av bakgrunnsvekst (figur 3D). Dermed noen interaksjoner med score under denne strenge terskel, men det er klart utenfor bakgrunnen vekstfordelingen kan betraktes som mulige treff som kan representere, for eksempel, forbigående eller svak interhandlinger. Disse kan videre studert og kryss-validert hvis, for eksempel, er de to proteiner ikke uttrykkes på et nivå som kan tillate den spontane komplementering av DHFR-fragmenter som de L-DHFR kontroller. Som et alternativ, kunne man sette en betydning terskel basert på andelen av overlapping med rapporterte fysiske interactors i databaser som BioGRID 35 for å maksimere andelen av sanne positiver i løpet av falske positiver. Men i motsetning til bruk av L-DHFR fordeling, dette alternativ kan ikke alltid være mulig dersom, for eksempel, er antall kjente fysikalske interactors ikke er tilstrekkelig høy. Videre, har valget av betydning terskel en innvirkning på andelen av falske positive og falske negative i den endelige datasett. Faktisk, i likhet med enhver annen PPI påvisningsmetode, kan falske positive resultat av uspesifikke interaksjoner av et protein med DHFR-fusjonsproteinet dersom det for eksempel er proteinet meget rikelig som nevnt tidligere. Detteer eksemplifisert ved det faktum at noen jakter systematisk samvirke med alle agn proteiner i PCA-skjermer, og dermed må fjernes fra analysen 11 (f.eks Tef2 og Ade17 og Tilsetnings tabell 2). For å omgå dette problemet, en styre PCA skjermen av de to samlingene mot det passende L-DHFR-kontroll (F [1,2] eller F [3]) for å identifisere agn og jakter oppviser spontan DHFR fragmenter komplementering kan utføres i de spesifikke betingelser på hvert skjermbilde. Videre kan utføre en Gene Ontologi anrikning analyse øker tilliten til dataene hvis funksjon av en gitt agn er kjente. På den annen side kan DHFR-PCA gi opphav til falske negativer av flere grunner: 1) Ikke alle proteiner kan være kondensert til DHFR-fragmenter som disse kan destabilisere proteiner eller endre sin lokalisering hvis, for eksempel, DHFR-fusjon til C-terminale ende griper inn i et lokaliseringssignal; 2) DHFR rekonstituering i noen cellulære avdelinger may ikke produsere folat hvis, for eksempel, er ikke tilgjengelig en viktig forløper for folat syntese; 3) C-termini behov for å være innenfor en avstand på 8 nm for DHFR complementation å skje 11. Således kan en velkjent interaksjonen ikke bli detektert hvis deres C-termini ikke er nær nok på plass. Dette er eksemplifisert her ved det faktum at en stor fraksjon av Nup82 fysiske interaksjoner rapportert i databaser, hvorav de fleste er indirekte, ble ikke påvist i vår analyse. Likeledes vil interaksjonene mellom membranproteiner som C-termini er i trans-forhold til membranen ikke føre til DHFR fragmenter komplementering og vil ikke bli detektert 11. Begrensninger 1) og 3) kan omgås relativt enkelt ved å fusjonere DHFR-fragmentet til N-termini til proteinet. Dette kan hindre å forstyrre en lokaliseringssignal i nærheten av C-termini og kan tillate å oppdage et samspill mellom membran proteiner som N og C-terminalen er i cis relativetil membranen.
Flere utfordringer gjenstår i studiet av PIN-koder (anmeldt i 2,3). Kartene av PIN-koder produsert så langt har i stor grad blitt beskrevet i en enkelt eksperimentell betingelse for hver art og dermed tilby et enkelt bilde av hvordan protein nettverk kan være organisert. Det er derfor behov for utforskning av andre eksperimentelle forhold for å se hvordan PIN-koder kan bli omorganisert som svar på endringer i miljøet, bestemte stimuli, på tvers av utvikling eller følgende mutasjoner. Disse utfordringene vil bli overvunnet ved utvikling av nye teknologier for avhør PPIs i sanntid, i levende celler og ved å tilpasse dagens teknikker, slik at de kan brukes av et større fellesskap av laboratorier. Som en kvantitativ teknikk som kan detektere endringer i mengden av DHFR komplemente komplekser 27, kan DHFR-PCA være tilpasset for å overvinne disse utfordringer og har blitt brukt til å studere hvordan PPIer påvirkes av et DNA-ødeleggende middel 22 25, gendelesjoner 23,26 eller i andre gjær arter og deres hybrider 33. Utforske disse nye dimensjoner vil bli mer og mer viktig å avdekke dynamikken i PIN-koden.
Disclosures
En del av de åpne tilgang publiserings avgifter for denne artikkelen ble betalt av S & P Robotics.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institute of Health Research (CIHR) Grants 191 597, 299 432 og 324 265, en naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada Discovery stipend og Human Frontier Science Program stipend til CRL. CRL er en CIHR New etterforsker. Guillaume Diss er støttet av en PROTEO fellesskap. Samuel Rochette er støttet av NSERC og FRQNT stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
| 96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
| 384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
| 1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
| Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
| Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
| Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
| Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
| Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
| Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
| Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
- Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
- Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
- Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96 (2009).
- Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
- Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
- Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
- Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
- Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
- Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
- Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
- Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
- Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
- Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
- Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).
- Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
- Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
- Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
- Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).
- Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
- Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
- Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5 (2013).
- Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
