Introduction
Белковых сетей (ПИИ) предлагают с низким разрешением карту, как белки, функционально организована в клетке 1. Каждый физическое соединение между двумя белками, или белок-белковое взаимодействие (ИЦП), может представлять собой связь, которая является стабильной во времени, например, те, что в белковых комплексов и способствовать структурной организации клетки. Эти соединения могут также представлять переходные ассоциации, которые регулируют активность, стабильность, локализацию и взаимодействие двух партнеров. Определение физических партнеров взаимодействия данного белка, следовательно, обеспечивает богатую информацию о функции и регуляции этого белка 2,3. По этим причинам, большие усилия были направлены к отображению булавки в модельных организмов, в том числе кишечной палочки 4-6, Arabidopsis THALIANA 7, Saccharomyces CEREVISIAE 8-12 дрозофилы </ EM> 13, Caenorhabditis Элеганс 14 и человека разумного 15. Эти исследования дали важную информацию о том, как белки организованы в клетке и, таким образом, ключевой информации на белки с ранее неизвестными функциями.
Некоторые стратегии были разработаны на протяжении многих лет изучают PIN-коды. Эти технологии могут быть широко сгруппированы в три категории в зависимости от того, какую информацию они предоставляют на ИПП (обзор за 16-18). Первый из них основан на дрожжевой двухгибридный и его производных 19. Эти технологии обеспечивают информацию о прямой связи между парами белков, что позволяет построения двоичных сетей. Вторая семья основана на аффинной очистки приманки белков и определения их ассоциированных партнеров, таких как аффинной очистки с последующим масс-спектрометрии 20. Эти подходы идентификации группы белков, которые непосредственноили косвенно связаны, как правило, в стабильном режиме, и чрезвычайно мощным, чтобы определить белковые комплексы. Третий подход основан на белок-фрагмент комплементационных анализа (СПС) 11,21. Такой подход обеспечивает промежуточный уровень разрешения между двумя бывшими подходов, так как она позволяет обнаруживать прямые и проксимальных ассоциации между белками. Каждый метод имеет свои сильные и слабые стороны, как недавно рассмотрели 18.
Наиболее описано эукариотической ПИН, безусловно, один из начинающего дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE, отчасти потому, что его протеом относительно менее сложным, чем у других моделей эукариот и потому высокой пропускной анализов для определения ИПП, были сначала исследованы и более эффективно в этой модели организма 9-12. Особенно мощный метод для системы дрожжей дигидрофолатредуктаза белок-фрагмент комплементация анализ (DHFR-PCA), анализ, который былиспользуется в различных контекстах для изучения PIN-код дрожжей в стандартных и возмущенных условиях 11,22-26. Этот метод основан на анализе выживаемости, что позволяет обнаруживать прямых и почти прямых ИПП для данного белка приманки на обоих эндогенных уровней экспрессии нативных и субклеточных локализаций партнеров взаимодействия 11,21 в количественном выражении 27. Сигнал, полученный с помощью этого теста (т.е. размер колонии на массивы колонии с высокой плотностью), таким образом, отражает количество белковых комплексов, образованных между приманки и добычей в клеточном среды почти эквивалентно одной из клеток дикого типа. Анализ основан на восстановлении репортерного фермента, участвующего в метаболизме фолиевой кислоты, дигидрофолатредуктазы (DHFR), в результате чего два дополнительных фрагменты DHFR, которые были присоединены к двум интерес белков приводят в непосредственной близости, когда эти два белка взаимодействуют, которые в свою очередь, приводит к обратимой восстановления активности фермента 11 и рост штамма на среде, содержащей метотрексат (МТХ; Рисунок 1). Это соединение ингибирует эндогенную DHFR фермента, но не мутантного, которая используется в анализе 28. Две коллекции штаммов СПС, один, содержащий ~ 4300 MATa штаммы с ORF слит с DHFR F [1,2] фрагмент и один, содержащий ~ 4800 MAT α штаммов с ORF слит с [3] фрагмента DHFR, можно приобрести в осуществить DHFR-PCA при малых или больших масштабах в любой лаборатории. Здесь мы опишем общую, но подробный протокол к экрану для ИПП между одним приманки белка и ~ 4800 жертв белков с использованием этого теста.
Protocol
1. Строительство / проверка Bait штаммов
- Если приманка штамм интерес доступна в MATa DHFR F [1,2] Коллекция, извлечь его из коллекции, как описано в шаге 1.1.1, в противном случае построить напряжение, как описано в шаге 1.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: протокол, описанный здесь использует ДГФР F [1,2] деформации в качестве приманки и DHFR F [3] коллекция как жертв, так как эта коллекция содержит больше штаммов, чем ДГФР F [1,2] коллекции. Тем не менее, можно выполнить экран наоборот, если штамм приманки доступна только в [3] коллекция DHFR F или в обоих направлениях, если требуется более высокий охват интерактома.- Оттепель глицерине пластину, содержащую приманку нагрузку на льду в течение одного часа. Стерилизацию алюминиевую фольгу, покрывающую пластину с помощью 95% этанола. Пирс фольги со стерильным наконечником, пипетки вверх и вниз для ресуспендирования клеток и разводов 2-3 мкл глицерина наличии на селективной дрожжевой экстракт пептондекстроза (YPD) + 100 мкг / мл Nourseothricin (NAT) для того, чтобы изолировать отдельные колонии. Инкубируют в течение двух дней при 30 ° С.
- Конструирование штамма приманки PCA (MATa DHFR F [1,2]).
- Использование высококачественного воспроизведения полимеразы и стандартный протокол ПЦР, усиливают ДГФР F [1,2] кассета из плазмиды pAG25-линкер-DHFR F [1,2] -ADHterm с использованием олигонуклеотидов с выступающие концы гомологичных последние 40 п.н. ORF-х 3'-конец за исключением стоп-кодона (прямой праймер) и в первые 40 пар оснований гена 3'-UTR (Обратный праймер) (рис 1А).
- Преобразование продукта ПЦР в компетентных клеток дрожжей (обычно в штамме BY4741) с использованием стандартных LiOAc / ПЭГ протокол трансформации дрожжей, как и в 29 (фиг.1А).
- Табличка на селективной YPD + Nat среды для выделения положительных трансформантов.
- Выполните диагностическую ПЦР колоний на изолированных колоний для подтверждения надлежащего ДГФР F [1,2] термоядерного синтеза. Используйте примеров отжига 1) в последовательности гена, кодирующего (вперед олиго) около 100 п.н. выше по течению от слияния DHFR и 2) в ADH терминатора кассеты (Reverse олиго) (Фигура 1В).
- Последовательность ПЦР-продукта Сангером последовательности, чтобы подтвердить правильность слияние генов.
- Архив подтвержденный приманки напряжение в 25% глицерине при -80 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: протокол может быть приостановлена на этом этапе.
2. Pin-инструмент стерилизации и печать Процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: стерилизация описано ниже была оптимизирована для ПИН-инструментов манипулировать BM3-BC (S & P роботов) роботизированной платформы, но может быть адаптирован для других платформ, а также. В этом разделе описываются процедуры стерилизации и печати ПИН-инструментов, которые используются для передачи ячеек из одной среды в другую для остальной части протокола. В доме-сценарии, используемые для выполнения этих процедур можно получить по запросу. Примечание Thaт все этапы могут быть выполнены без необходимости роботизированной платформы с использованием ручного инструмента пин-30.
- Установите соответствующий пин-инструмент на роботизированной платформе.
- Подготовка очистки и влажной станций следующим образом:
- Добавить 500 мл стерильной воды в водяной бане станции.
- Добавить 320 мл стерильной воды в щетки станции.
- Добавить 380 мл 70% этанола в ультразвуком при репликации из чашки с агаром (86 х 128 мм omnitray, содержащий 35 мл отвержденной среде) в чашке с агаром, или 400 мл при репликации из микротитрационного планшета, содержащего жидкие культуры в чашке с агаром.
- Добавить 35 мл стерильной воды во влажном станции (состоящей из стерильной пустой omnitray).
- В начале каждого дня, что требует роботов платформу, стерилизовать PIN-инструменты пять раз в течение одного мин в ультразвуковом ванной. В то же время, включить УФ-лампы в течение пяти минут для стерилизации корпус робота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не требуется, если ограбитьOT расположен в стерильной крышкой. - Между каждым раундом репликации пин-инструмента, стерилизации пин-инструмент следующим образом:
- Замочите PIN-ИНСТРУМЕНТ пять раз в течение 10 сек на водяной бане станции, чтобы удалить скопления клеток.
- Замочите пин-инструмент дважды и обратно в кисти станции.
ПРИМЕЧАНИЕ: вращающаяся щетка удаляет остаточные клетки. - Замочите пин-инструмент дважды в течение 20 секунд в ультразвуковом станции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные ячейки на контактах будут удалены с помощью ультразвука или погибли от этанола. - Убедитесь, что глубина погружения штырей возрастает при каждом последующем ванной, чтобы обеспечить надлежащее стерилизации.
- Высушите пин-инструмент в воздух сушилки станции в течение 25 сек.
- Прежде чем принимать клеток от источника пластин, мокрый контакты на мокрой станции, которая содержит 35 мл стерильной воды в omnitray.
- Опустите штыри дважды в колониях из исходного пластины.
- Распечатать на свежеуложенный назначения пластины, прикоснувшись к AGAR поверхность в два раза (далее упоминается как акции "печати" массива).
3. Конденсация [3] коллекция DHFR F в 1536 массивами Использование роботизированная платформа
- Оттепели на льду [3] коллекция DHFR F (60 96-луночные планшеты) и дополнительный 96-луночный планшет заполнен L-DHFR F [3] контрольного штамма (фиг 1С), который содержит DHFR F [3] фрагмента и выше линкер выражено в покое в качестве отрицательного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: В принципе, этот фрагмент не должен взаимодействовать с любым DHFR-фрагмент слитого белка (см обсуждения деталей). - Центрифуга пластины (быстрый спин), перед удалением алюминиевую фольгу, чтобы избежать риска перекрестного загрязнения между скважинами.
- Уплотнить коллекцию на 16 массивах 384 штаммов (рис 2а). Чтобы сделать это, для каждого 384 массиве, печати, в четыре глицерина пластины на четырех квадрантах избирательного YPD + 250 мкг / мл гигромицину B (HygB) omnitray помощью тысе 96-контактный инструментом (здесь, массив 384 может быть разделена на четыре квадранта равной interspaced, каждый из которых состоит из 96 позиций в матрице макета в 2 х 2). Вставка четыре 96-луночных планшетах, содержащих [3] отрицательный контроль L-DHFR F между 60 другими пластинами, с тем чтобы получить конечную набор пластин 64, которые точно заполняют четыре 1536 массивов. Стерилизовать пин-инструмент между каждым циклом репликации, как описано в шаге 2.
Примечание: Вставьте L-DHFR F [3] пластины, чтобы иметь одну такую пластину на каждой из четырех конечных 1536 массивов. - Планшеты инкубируют в течение двух дней при 30 ° С. Примечание: На этом этапе, сбор DHFR могут быть сохранены в формате 384 при 4 ° С в течение одного месяца на чашках с агаром.
- Уплотните коллекцию в четырех массивов 1536 штаммов (рис 2а). Чтобы сделать это, для каждого массива 1536, печатать четыре массивов 384 штаммов на четырех квадрантах пластины той же среде, что и в стадии 3,2 с помощью пин-инструмент 384 (здесь, массив 1536 можно разделить на четыре еqually interspaced квадранта каждый из которых состоит из 384 позиций в матрице макета 2 х 2).
- Планшеты инкубируют в течение двух дней при 30 ° С. Примечание: На этом этапе, сбор DHFR могут быть сохранены в формате 1536 при 4 ° С в течение одного месяца на чашках с агаром.
- Реплицируйте четыре массива на той же среде, чтобы стандартизировать размеры колоний с использованием 1536 пин-инструмент.
- Планшеты инкубируют в течение двух дней при 30 ° C.
4. Высокая пропускная способность Порядок DHFR-PCA
- Посев культуры штамма приманки (DHFR F [1,2] плавка), полученного на стадии 1.1.1 или 1.1.2 в 20 мл жидкой YPD + Nat в 50 мл пробирку (фиг.2В).
- Инкубируют в течение двух дней при 30 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту, чтобы культура для достижения насыщения.
- После двух дней инкубации, плита 5 мл культуры на YPD + Nat omnitray. Пусть клетки адсорбируют на поверхности в течение 5-10 мин и удалить лишнюю жидкость (фиг.2В). Повторите тВайс сделать три повторности.
- Инкубируют в течение двух дней при 30 ° С.
- Распечатать приманки напряжение от шагов 4,3 и 4,4 на 12 YPD пластин (достаточно спаривания четыре пластины в ДГФР F [3] коллекция × трех повторов) с 1536 пин-инструмента с использованием каждой ячейки газон не более чем в четыре раза.
- Печать соответствующий массив [3] коллекции DHFR F в верхней части приманки клеток с использованием пин-1536 инструмент (фиг.2с).
- Пусть штаммы мат путем инкубации в течение двух дней при 30 ° С.
- Выберите диплоидных клеток путем печати колонии на omnitrays, содержащих YPD + HygB + NAT (рис 2С).
- Инкубируют в течение двух дней при 30 ° С.
- Повторите диплоидных выбор, как описано в шагах 4,8 и 4,9 (рис 2b).
- Подготовка пластин со средами, содержащими МТХ (МТХ среды) день до использования, выполните следующие действия 21 (Внимание:. Будьте осторожны при работе с метотрексатом, поскольку это токсичное соединение Всегда носите перчатки, защие очки и лаборатории пальто при обращении с ним) (рис 2С):
- Подготовка 10x -Lys / MET / ADE аминокислот отсева в деионизированной воде. Фильтр-стерилизовать отсева в стерильные бутылки, используя стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм или, при необходимости в больших количествах, 0,2 мкм бутылки верхнюю воронку фильтрации (таблица 1).
- Подготовка 10 мг / мл маточного раствора MTX в диметилсульфоксиде (ДМСО). Использование сразу после приготовления раствора и заморозить остаток при -20 ° С. Защитите его от света, как это светочувствительной. Не замораживать MTX снова после оттаивания его.
- Подготовка носителя следующим образом (средние величины ингредиенты и такие же, как те, которые используются в Тарасов и др. 11):
- Для одного литра среды, смешать в двух отдельных колб: 1) 6,69 г основания дрожжей азота без аминокислот и без сульфата аммония и 330 мл деионизированной воды; 2) 25 г агара и благородных 500 мл деионизированной воды.
- Автоклав колбы при 121 ° С в течение 20 мин.
- Равновесие температуры на водяной бане при 55 ° С в течение не менее одного часа.
- Смешайте две колбы вместе и добавить 50 мл стерильного 40% раствора глюкозы, 100 мл 10х стерильной отсева, и 20 мл MTX 10 мг / мл.
- Налейте 35 мл (см примечание ниже) среды в omnitrays. Пусть затвердеть в течение по крайней мере час-полтора. Защитных пластин от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, наливая 35 мл среды в omnitray имеет решающее значение для обеспечения одинаковой толщины пластины, что является важным для всех последующих стадиях.
- Image плиты из второго тура диплоидной отбора с роботизированной платформы или с обычной цифровой камерой с равномерной подсветкой пластины. Используйте эти фотографии, чтобы определить пустые позиции на массивах при выполнении вниз по течению анализа. Убедитесь, что параметры камеры всегда одинаковы и что робот свет включен.
- Распечатать диплоидных клеток на MTX СМИ УЗИН.Г. пин-инструмент 1536.
- Инкубируют в течение четырех дней при 30 ° С в полиэтиленовых пакетах, чтобы предотвратить высыхание.
- Приготовьте вторую партию omnitrays содержащих MTX среду, как описано выше в стадии 4,11.
- После четырех дней инкубации, изображения пластины с помощью роботизированной платформы или обычной цифровой камеры. Убедитесь, что параметры камеры всегда одинаковы и что робот свет включен.
- Выполните второй тур отбора MTX путем репликации клеток на вторую партию МТХ СМИ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит уменьшить фоновый рост штаммов СПС и увеличить количественный разрешение. - Инкубируют в течение четырех дней при 30 ° С в полиэтиленовых пакетах, чтобы предотвратить высыхание.
- Изображение пластины как описано в стадии 4,16.
5. Анализ изображения
- Анализ изображений колонии массивов с пользовательским ImageJ 31 сценариев или с использованием опубликованных программного обеспечения, таких как колонизатор, НТ анализатора колония сетки, сотовый Profiler, колония изображенияг, ScreenMill, YeastXtract и Gitter (составленный в 32). Анализ изображений должны Выход один или несколько таблиц, содержащих размеры колоний для каждой позиции каждого массива, использовать эти размеры колоний для всех последующих анализов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали скрипт на заказ ImageJ, описанной в Leducq и др 33 (см обсуждения раздел для более подробной информации)..
Анализ 6. Данные
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа изображений могут быть обработаны в табуляторе, таких как Excel или с помощью языка сценариев, например R 34. Следующие шаги описывают процедуру с использованием пользовательского ImageJ 31 сценарий.
- Использование пользовательского сценария, объединить выходные файлы из анализа изображений и комментировать каждую строку с пластиной и напрягать информацию в дополнительную таблицу 1.
- Войти 2 преобразования значения размера колонии (интегральная плотность или колонии область, здесь колонку "IntDenBackSub & #8221; из дополнительных таблице 1 был использован).
ПРИМЕЧАНИЕ: распределение значений будет выглядеть, как на рисунке 3А. - Нормализация этих значений путем вычитания среднего значения каждой пластины.
Примечание: Этот шаг управления для смещения пластины, которые могут возникнуть в результате неравного количества средств массовой информации или изменения автоматической регистрации изображения, и снижает между REPLICATE дисперсию (рис 3б). - Убедитесь, что повтора коррелируют друг с другом (рис 3C) для оценки воспроизводимости экспериментов.
- Чтобы дифференцировать взаимодействия с невзаимодействующих пар приманки-жертва, установить с высокой вероятностью порог, соответствующий 95-й процентиль распределения L-DHFR F [3] Controls.
Примечание: В этом эксперименте, это соответствует 3,39 (рисунок и 3D). Кроме того, пороговое значение на основе перекрытия с известными физическими interactors таких как сообщается в BioGRID 35 может быть использован.См обсуждение для более подробной информации. - Для любого приманки, фильтр жертв идентифицированы как участие в ложных положительных взаимодействий в экранах DHFR-PCA (см обсуждения для более подробной информации) и внесены в дополнительную таблицу 2 (определяется как "1" в колонке "фильтруют").
- Среднее значение на log2 размеры нормализуется колонии трех повторах каждого взаимодействия (колонка "Средний балл" в дополнительную таблицу 2).
7. Проверка физической Interactors Использование небольших экспериментов
Примечание: Все ИПП особый интерес, имеющего счет выше или близко к прикладной порога может быть проверена с использованием анализа DHFR-PCA в малой эксперимента с использованием анализа роста на твердой или жидкой среды с метотрексатом. Перечисленные ниже шаги показывают процедуру вручную построить диплоидных штаммов СПС и выполнять выборочные анализы на MTX среды. Экспериментатор должен выполнять эти шаги для всех вместить достаточноеу управления (Bait-DHFR F [1,2] х L-DHFR F [3], Zipper-линкер-DHFR диплоидные штаммы и линкер-DHFR диплоидный штамм).
- Plate 2-3 мкл глицерина акций приманки деформации, генерируемого в 1.1.2.6), L-DHFR F [3] контрольный штамм, молнию-мостик-ДГФР и линкер-ДГФР диплоидные штаммы на YPD + NAT, YPD + HygB и дважды YPD + Nat + HygB массовой информации, соответственно.
- Получить добычу интереса к [3] коллекция DHFR F и следуйте инструкциям в шаге 1.1.1, но полоса нагрузку на YPD + HygB среды вместо YPD + Nat среды.
- Выполните диагностическую ПЦР, как в 1.1.2.4, чтобы подтвердить ДГФР F [3] слияние в добычу локуса и последовательности продукта.
- Привить 1 мл жидкой YPD среде с гаплоидных штаммов к спариванию (Bait х добычу, Bait х L-DHFR F [3] контроль) и вырасти как минимум два дня при 30 ° С, чтобы позволить диплоиды в форме.
- Выберите диплоиды по полос 4-5 мкл культуры, в 7,4 на твердом YPD + HygB + Nat среды. Выращивают два дня при 30 ° С.
- Селецт один изолированный колонией и расти в течение ночи в жидкой культуре (1 мл), чтобы выполнить анализ роста.
- Подготовка MTX и ДМСО (те же ингредиенты, как МТХ среду, но без МТХ) Плиты день перед использованием. См шаг 4,11 для более подробной информации.
- Выполните анализ роста путем выявления серийные разведения различных культур на контроле (ДМСО) и выбор пластин (МТХ).
- Развести Предкультуры для OD = 1.
- Выполните пять-кратного разведения (до коэффициент разбавления 625) в стерильной 96-луночного планшета.
- Пятно 4 мкл каждого разбавления в PCA сред (ДМСО, и МТХ).
- Инкубируют при 30 ° С в полиэтиленовых пакетах, чтобы предотвратить высыхание.
- Image плиты из дней с 1 по 7 инкубации с использованием роботизированной платформы или обычный цифровой фотоаппарат.
Representative Results
Дополнительное Таблица 2 представляет собой пример репрезентативные результаты получены с использованием дрожжей белок Nup82 слитый с DHFR F [1,2] фрагмента в качестве приманки. Порог определяется с L-DHFR F [3] средства управления могут быть использованы в качестве эмпирического порога для определения высокой степенью уверенности ударов (данные 3D и 3E). Кроме того, оценка ранжирования может быть использован для выполнения гена Онтология обогащение или другой функциональный анализ на основе 36 золотых стандартов 37. Известные физические interactors приманки могут быть получены из баз данных, таких как BioGRID 35 и накладывается на данных (фиг 3E & 3F). В этом примере, пять из восьми высокое доверие хиты сообщалось ранее, как Nup82 interactors и два являются частью подкомплекса Nup82, Nup116 и Nup159 (рис 3F и 3G). Другой член комплекса, NSP1, не проявляет никакого Interacния в нашем эксперименте. Два добычей, Ade17 и Tef2 (на рисунке не показаны 3F), имели баллы выше жесткого порога применяется, но это, вероятно, будет ложных срабатываний, как они взаимодействуют практически с любым приманки белка в СПС экранов проведенных нами (неопубликованные результаты). С другой стороны, Pex30 может представлять собой новый физический Interactor из Nup82 и мы смогли подтвердить это взаимодействие, используя DHFR-PCA при низкой пропускной (рис 3G). Pex30 является пероксисомальной мембранный белок и несколько прямых взаимодействий были зарегистрированы между ядерной поры комплекса (НПК), и это органеллы. Двухгибридная экран были определены два других белка NPC, Nup53 и Asm4 (Nup59), как физические interactors в Pex30 38 и генетического взаимодействия между Pex30 и Nup170 сообщалось 39. Два других партнеров по взаимодействию обнаружено, Nup120 и Nup85 (рис 3F и 3G), не являются частью Nup82 суб-комплекса, иллюстрирующий способностьв ДГФР-PCA для обнаружения взаимодействия внутри и между подкомплексов в больших комплексах 11.
Рисунок 1:. Штаммы дрожжей Техника для высокой пропускной DHFR-PCA (. Рис взято из Leducq и др 2012 33) () Строительство гаплоидных Мата и MAT α штаммов предохранитель Gene1 (G1) и Gene2 (G2) с ДГФР F [1,2] -NatMX и DHFR F [3] -HPH кассеты, соответственно. Кассеты амплифицировали из плазмиды pAG25-DHFR F [1,2] и pAG32-DHFR F [3] с прямых праймеров G1-5 'и' G2-5 и обратного праймеров G1-3 'и G2-3 ", а затем вставлена в геном на 3 'конце гена-мишени путем гомологичной рекомбинации. Полученные белки, P1 и P2, соответственно, слитый с DHFR F [1,2] фрагмент (MATa) и [3] Фрагмент DHFR F (MATα) с помощью гибкого линкера. (B) Проверка конструкции в (А) выполняется путем секвенирования переходе между Gene1, и ОРС Gene2 и кассеты DHFR. Построенные штаммы PCA противоположных типов спаривания затем в паре с образованием диплоидной. Диплоидные штаммы растут на среде с метотрексатом, если два дополнительных фрагментов DHFR приводятся в непосредственной близости от взаимодействия между P1 и P2, которые восстанавливает активность фермента DHFR. (С) Конструирование управления диплоидных штаммов РСА для экранов DHFR-PCA. Негативные управления (L-DHFR) построены путем преобразования отдельно гаплоидных штаммов Мата и MATα плазмидами p41-линкер-DHFR F [1,2] и p41-мостик-DHFR F [3] 11, соответственно. Два штамма соединяются в результате отрицательного контроля диплоидной штамма, в котором фрагменты DHFR не в состояниичтобы дополнять друг друга (сверху). Положительные контроли построены используя тот же подход, что и для отрицательных контролей, но плазмиды превращается в гаплоидных штаммов (p41-молния линкер-DHFR F [1,2] (P41-ZL-DHFR F [1,2]) и p41 -zipper-линкер-DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) содержат два Gcn4 параллельно лейцин молнии фрагменты, слитые с комплементарными фрагментами DHFR, что приводит к сильному и учредительного взаимодействия, восстанавливает DHFR активности (внизу ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Высокая пропускная процедура DHFR-PCA (рис взято из Leducq и др 33.) () MAT α ДГФР F [3] коллекции. конденсируется в формате 1536 через два последовательных циклов конденсации. Во-первых, запаса глицерина пластины в сочетании с группами по четыре на селективной YPD + HygB среды в формате 384, используя пин-инструмент 96. Во-вторых, 384 массивы в сочетании с группами по четыре на селективной YPD + HygB среды в формате 1536 с использованием пин-инструмент 384. (B) Сотовые газонов приманки штамма MATa PCA получают путем выращивания насыщенный культуру штамма приманки в селективный YPD + Nat средних и покрытие культуры на YPD + Nat omnitray. (С) Эти газоны используются для спаривания приманки напряжение с [3] коллекция DHFR F на YPD среды. Клетки последовательно дважды переносили на YPD + HygB + Nat среде, чтобы выбрать для диплоидов и дважды на МТХ среду для выполнения СПС. Рост будет наблюдаться только на MTX среды, если фрагменты DHFR дополняют друг друга после проведения взаимодействия приманки и добычу белков.e.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3:.. Анализ данных по всем шагам нормализации, определении значимости порога и идентификации положительных взаимодействий (а) распределение плотности размер колонии на каждой пластине (войти 2) (B) Нормализация по медиане каждого изображения корректирует предубеждений связаны с пластины на печатную эффектов. (C) Тепловая карта показывает коэффициент корреляции Спирмена между пластинами, подтверждающие воспроизводимость процедуры. (D) Распределение баллов для испытуемых ИПП и L-DHFR F [3] управления. Трудно порог может быть установлен на 95-й процентиль в L-DHFR F [3] Оборудование для идентификации с высокой вероятностью ИЦП (в лице вертикальная пунктирнаяРаспределение линия). (E) Звание Упорядочить среднего балла каждого добычи. Ранее сообщалось, физические партнеры взаимодействие Nup82p в BioGRID 35 обозначены кругами, и те, в этом исследовании обозначены красными точками. Порог определено в (D) показан в виде пунктирной линии. (F) Сеть показывая высокого доверия ИЦП, указанные в данном исследовании. Синие края обладают ранее сообщили, физические interactors (BioGRID 35) и желтыми краями показать ранее неучтенного взаимодействие с Pex30. (G) Пятно разведение анализ СПС диплоидных штаммов с участием Nup82-DHFR F [1,2] и жертва-DHFR F [3 ] пар определены как физические interactors в Nup82p в настоящем исследовании. Анализ роста проводили в среде ДМСО (МТХ растворителя, слева) и метотрексатом среды (правая панель). Отрицательные контроли, состоящие из Nup82-DHFR F [1,2] - линкер-DHFR F [3] и линкер-DHFR F [1,2] - линкер-DHFR F [3] и положительный контроль, состоящий из тон сильное взаимодействие между двумя лейцин молнии фрагментов (молния-DHFR F [1,2] - молния DHFR F [3]) были включены. Рост клеток превосходит отрицательных контролей в МТХ среды следует интерпретировать как физическое взаимодействие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Аминокислота | Количество (г) |
| Аденин сульфата * | 0,2 |
| L-триптофан | 0,4 |
| L-тирозин | 0,3 |
| L-Фенилаланин | 0,5 |
| L-глутаминовая кислота (мононатриевой соли) | 1,0 |
| L-аспарагин | 1,0 |
| L-валин | 1,5 |
| L-Треонин | 2,0 |
| L-серин | 3,75 |
| Uracile | 0,2 |
| L-гистидин HCl | 0,2 |
| L-аргинин HCl | 0,2 |
| L-метионин * | 0,2 |
| L-лизин * | 0,2 |
| L-лейцин | 0,6 |
| * Снят при выполнении стандартной СПС (как в данном протоколе), но могут быть добавлены для других целей. | |
Таблица 1:. Состав 10х -Lys / MET / ADE отсева в среде с метотрексатом Количества одного литра 10-кратным отсева. Звездочки обозначают соединения, которые должны быть выведены на стандартной среде с метотрексатом, но которые могут быть добавлены для других целей.
Дополнительное Таблица 1:. Комбинированные данные из 12 испытаний пластин Таблица 1 содержит сцепленный DAта из анализа ImageJ проводили с использованием пользовательского сценария ImageJ с каждой строкой, соответствующей одной позиции на каждом массиве 1536. Кроме того, каждая строка была аннотированный с информацией о файле изображения, DHFR сбора пластины, репликации, ORF и имя белка.
Дополнительное Таблица 2:. Средняя нормированная рост на штамм Таблица 2 содержит среднее Войти 2 нормированный роста для каждого штамма коллекции наряду с стандартного отклонения. Фильтры добычей, хиты и известные физические interactors определены в отдельных столбцах.
Discussion
Мы опишем протокол, основанный на анализе DHFR-PCA благоприятной систематическое определение физических interactors для любой приманки белка в высокой пропускной способности. Этот протокол может быть адаптирован путем скрининга более приманок, и это в любом желаемом уровне репликации. Мы демонстрируем надежность этого протокола идентификации физических партнеров по взаимодействию для приманки белка, участвующего в сложных ядерных пор: Nup82. Наш анализ позволил найти пять ранее сообщалось interactors и один ранее не сообщалось Interactor (Рисунки 3F и 3G), подчеркивая способность метода для изучения дрожжи белка интерактомные.
Протокол, описанный здесь, включает в себя несколько важных шагов, на которые экспериментатор должен обратить внимание. Мы рекомендуем 1) Убедитесь, что приманка DHFR F [1,2] слияние правильно (рис 1B); это может быть достигнуто путем секвенирования по строительству и измчисле надлежащее экспрессию белка с помощью анти-DHFR F [1,2] или анти-DHFR F [3] антитело; 2) Перед началом экрана, рекомендуется проверить, если какой-либо приманки интерес проявляет беспорядочную взаимодействия на экранах СПС. Это может быть сделано путем выполнения экраны управления с приманки скрещенных с соответствующим контролем L-DHFR или вручную спаривания приманку с соответствующим контролем L-DHFR и выполнения анализа роста в среде с метотрексатом. 3) Пластины должны быть выливают в день, прежде чем они будут использованы таким образом, что влага является оптимальным для присоединения клеток на поверхность агара в процессе печати; 4) Источник пластины не должны использоваться более чем в четыре раза, чтобы передать достаточное количество клеток на целевом пластины. Увеличение количества копий назначения пластины может быть сделано путем последовательных шагов разложения (например, 4-х экземплярах -> 16 копий -> 64 копий). Кроме того, клетки могут быть собраны в различных позициях на газонах или в колонии между различными раундов репликации; 5) Если несколько рositions не хватает после диплоидной отбора (ов), убедитесь, что источник знаки не используются слишком много раз на стадии спаривания (шаги 4,5 до 4,7); 6) Убедитесь, что среда MTX содержит все существенные ингредиенты на правой концентрациях. Действительно, если никакого роста вообще не наблюдается на среде с метотрексатом, это может быть либо потому, что никакое взаимодействие не может быть обнаружено с помощью СПС для белков, представляющих интерес, или потому, что среда МТХ не был подготовлен должным образом. Чтобы гарантировать, что среда позволяет рост штаммов, показывающих DHFR фрагментов комплементации, конститутивный взаимодействие может быть добавлен в пустых позиций сбора и использовали в качестве положительного контроля, такие как DHFR-фрагментов слитых с лейциновой молнии фрагментов 33 (фиг 1с). Параллельные испытания с использованием фрагментов линкер-ДГФР или фрагменты молния линкер-ДГФР позволит различать условия, которые позволят всем клеткам расти (низкой концентрации метотрексата или приманки белка, который, как правило, делают ложные положительные взаимодействия, как DESCRibed ниже) и условия, которые препятствуют росту всех штаммов (концентрация MTX слишком высокой или существенным компонентом отсутствует в среде); 7) Учитывая, что РСА выполняется путем последовательных циклов повторений из одной среды в другую, перекрестное загрязнение между штаммами между различными плитами может возникнуть, если, например, штырь-инструмент не стерилизуют образом между раундами репликации и / или последнего воде ванна (т.е. влажный станция), в порядке стерилизации загрязнена колоний предыдущих раундов репликации. Несколько позиций на массивах пусты и, таким образом, может быть использован в качестве контрольных позиций, где никакого роста не должны наблюдаться для выявления перекрестного загрязнения.
Анализ изображений может быть выполнена с использованием нескольких опубликованных программного обеспечения (см раздел 5 протокола) или любой пользовательский сценарий. В этом исследовании, пользовательский сценарий выполняет следующие действия: 1) скрипт вычитает значения пикселей пустой тарелкой со значениями пикселов каждой пластины в целях координациидый правильный для освещения предубеждений. 2) скрипт преобразует каждый фон с поправкой на картинку, чтобы двоичный, с помощью значения пиксела, порог 10. 3) Для каждого 1536 позиций каждой пластины, определяемых путем наложения прямоугольник на краю колонии, скрипт запускается ImageJ "Анализ частиц ... "функция в круглое выделение. Круглое выделение устанавливается с радиусом, равным интервалу между двумя позициями минус 10 пикселей. 4) Сценарий выбирает наиболее частицы от центра отбора и подтверждает его в качестве колонии, если его расположение не более половины интервал между двумя колоний от центра отбора. 5) Сценарий измеряет значения пикселей в выбранной частицы на фоне коррекцией изображения. 6) Для дальнейшего исправить любые оставшиеся фоновой подсветки предубеждения, сценарий вычитает среднее значение всех пикселей с круговой отбора, которые не были частью частицы со значениями пикселов колонии. Сумма этих скорректированное значение пикселясек, хранящиеся в столбце "IntDenBackSub" Дополнительного таблице 1, используются как мера размера колонии.
Важным шагом в рамках анализа части является выбор порога значимости. Здесь мы выбрали порог на основании распределения отрицательного L-DHFR F [3] управления, но в зависимости от цели экрана, такой порог может быть слишком жесткими. В самом деле, L-DHFR F [3] управления сверхэкспрессируются (сильный TEF промоутер), что дополнительные фрагменты могут спонтанно дополняют друг друга, и они, таким образом, не является представителем выражения большинства белков. Это подтверждается тем, что распределение L-DHFR F [3] Определяет, выше, чем в среднем по росту фоне (рис 3D). Таким образом, некоторые взаимодействия, имеющие показатели ниже этого порога, но жестким, что, очевидно, вне распределения роста фоне можно рассматривать как предполагаемых ударов, которые могут представлять, например, временной или слабого Interдействия. Они могут быть дополнительно изучены и перекрестной проверки, если, например, эти два белка не выражены в количествах, которые могут позволить спонтанное комплементации фрагментов DHFR как управления L-DHFR. В качестве альтернативы, можно установить значимость порог на основе доли перекрытия с сообщениями о физическом interactors в базах данных, таких как BioGRID 35 для того, чтобы максимизировать долю истинных положительных над ложных срабатываний. Тем не менее, в отличие от использования распределения L-DHFR, эта альтернатива не всегда может быть возможным, если, например, число известных физических interactors недостаточно высока. Кроме того, выбор порога значимости имеет влияние на количество ложных срабатываний и ложных негативов в конечном наборе данных. В самом деле, как и любой другой реакции на обнаружение ИПП, ложных срабатываний может быть результатом неспецифического взаимодействия белка с белком DHFR-слитого, если, например, белок является очень обильным, как упоминалось ранее. ЭтоПримером может служить тот факт, что некоторые охотится систематически взаимодействовать со всеми приманки белков на экранах СПС и, таким образом, должны быть исключены из анализа 11 (например, Tef2 и Ade17 и дополнительную таблицу 2). Чтобы обойти эту проблему, экран управления PCA двух сборников по соответствующим контролем L-DHFR (F [1,2] или F [3]), чтобы определить приманки и добычу, проявляющие спонтанное DHFR фрагментов комплементации может быть выполнена в конкретных условиях каждого экрана. Кроме того, выполняя анализ по обогащению Джин онтология может увеличить уверенность в данных, если функция данного приманки известны. С другой стороны, DHFR-PCA может привести к ложноотрицательных по нескольким причинам: 1) не все белки могут быть слиты с фрагментами DHFR, поскольку они могут дестабилизировать белки или изменять их локализации, если, например, слитый с DHFR С-конец мешает сигнала локализации; 2) ДГФР восстановление в некоторых клеточных компартментов мAY не производит фолиевую кислоту, если, например, необходима для синтеза предшественника фолиевой кислоты не доступен; 3) С-концы нужно быть на расстоянии 8 нм для DHFR комплементации происходить 11. Таким образом, хорошо известно взаимодействие не может быть обнаружен, если их C-концах не достаточно близко в пространстве. Примером этого может служить здесь в том, что большая часть Nup82 физических взаимодействий, представленных в базах данных, большинство из которых косвенным, не были обнаружены в нашем анализе. Аналогичным образом, взаимодействие между мембранными белками, для которых С-концы находятся в транс по отношению к мембране, не приведет к DHFR фрагментов комплементации и не будет обнаружен 11. Ограничения 1) и 3) можно обойти относительно просто путем сплавления DHFR фрагмент в N-концах белков. Это может привести к вмешиваться с сигналом локализации вблизи С-концов и может позволить обнаружить взаимодействие между мембраной белков, N и С-конца в странах СНГ относительнос мембраной.
Несколько проблемы остаются в исследовании ПИН (обзор 2,3). Карты штырей, полученных до сих пор в основном были описаны в одной экспериментальной состоянии для каждого вида и, таким образом, предлагает единый снимок, как белковые сети могут быть организованы. Существует, следовательно, потребность в освоении других экспериментальных условиях, чтобы увидеть, как PIN-коды могут быть реорганизованы в ответ на изменения окружающей среды, специфические стимулы, по всей развития или следующих мутаций. Эти проблемы будут преодолены благодаря развитию новых технологий для допроса ИЦП в режиме реального времени, в живых клетках и адаптации нынешних методов, так что они могут быть использованы в более широком сообществе лабораторий. Как количественный метод, который может обнаружить изменения в размере ДГФР дополнения комплексы 27, DHFR-PCA может быть адаптирована для решения этих проблем и была использована для изучения того, как ИПП зависит от ДНК повреждающим агентом 22 25, ген удаления 23,26 или других видов дрожжей и их гибриды 33. Изучение этих новых явлений будет становиться все более и более важным, чтобы выявить динамику PIN-кода.
Disclosures
Часть из открытых таксы доступа для этой статьи были оплачены S & P Robotics.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) предоставляет 191597, 299432 и 324265, естественных наук и инженерным исследованиям Совета гранта Канада Discovery и грантовой программы Human Frontier Science в CRL. CRL является CIHR Новый следователь. Гийом Diss поддерживается общение Proteo. Samuel Рошетт поддерживается NSERC и FRQNT стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
| 96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
| 384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
| 1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
| Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
| Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
| Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
| Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
| Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
| Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
| Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
- Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
- Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
- Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96 (2009).
- Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
- Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
- Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
- Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
- Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
- Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
- Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
- Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
- Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
- Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
- Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).
- Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
- Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
- Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
- Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).
- Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
- Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
- Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5 (2013).
- Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
