Introduction
Protein interaktionsnätverk (PIN) ger en låg upplösning karta över hur proteiner är funktionellt organiserade i cellen 1. Varje fysisk anslutning mellan två proteiner, eller protein-proteininteraktion (PPI), kan representera en förening som är stabil i tiden, såsom de som finns inom proteinkomplex och att bidra till den strukturella organisationen av cellen. Dessa anslutningar kan också representera transienta föreningar som reglerar verksamheten, stabilitet, lokalisering och interaktioner mellan de två parterna. Identifiera de fysiska interaktionspartner ett givet protein ger därför rik information om funktion och reglering av detta protein 2,3. Av dessa skäl har stora ansträngningar lagts mot kartläggning av koder i modellorganismer, inklusive Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, elegans Caenorhabditis 14 och Homo sapiens 15. Dessa studier har gett viktiga insikter i hur proteiner är organiserade i cellen och därmed viktig information om proteiner med tidigare okända funktioner.
Flera strategier har utvecklats under åren för att studera koder. Dessa tekniker kan grovt delas in i tre kategorier beroende på vilken typ av information de lämnar på protonpumpshämmare (ses över 16-18). Den första är baserad på jäst två-hybrid och dess derivat 19. Dessa tekniker ger information om det direkta sambandet mellan par av proteiner, vilket gör det möjligt att konstruera binära nätverk. Den andra familjen är baserad på affinitetsrening av betesproteiner och identifieringen av deras associerade partners, såsom affinitetsrening följt av masspektrometri 20. Dessa tillvägagångssätt identifiera grupper av proteiner som är direkteller indirekt associerad, i allmänhet på ett stabilt sätt, och är extremt kraftfulla för att identifiera proteinkomplex. Den tredje metoden är baserad på proteinfragment komplemente analyser (SoL) 11,21. Denna metod ger en medelnivå i upplösning mellan de två tidigare metoder, eftersom den tillåter att upptäcka direkta och proximala samband mellan proteiner. Varje teknik har sina egna styrkor och svagheter, som nyligen recenserade 18.
Bäst beskrivna eukaryota PIN är den i särklass en av den spirande jäst Saccharomyces cerevisiae, delvis eftersom dess proteomet är relativt mindre komplex än de andra modell eukaryoter och eftersom hög genomströmning analyser för att detektera PPI har först analyserats och är mer effektivt förs i denna modell organism 9-12. En särskilt kraftfull metod för jästsystemet är dihydrofolatreduktas proteinfragmentkompletteringsanalys (DHFR-PCA), en analys som har varitanvänds i olika sammanhang för att studera jästen PIN i standard och oroad villkor 11,22-26. Denna metod förlitar sig på en överlevnadsanalys som möjliggör detektion av direkta och nästan direkt PPI för ett givet bete protein vid båda endogena uttrycksnivåer och infödda subcellulära lokaliseringar av interaktionspartner 11,21 i ett kvantitativt sätt 27. Den signal som erhålls med hjälp av denna analys (dvs. kolonistorlek på hög densitet koloni arrayer) återspeglar således mängden proteinkomplex som bildas mellan betet och bytesdjur i en cellulär miljö nästan ekvivalent med en av vildtypceller. Analysen är baserad på beredning av en reporter enzymet involverat i folatmetabolism, dihydrofolatreduktas (DHFR), varvid två komplementära fragment av DHFR som är fusionerade till de två proteiner av intresse bringas i närhet när de två proteinerna interagerar, vilket i sin tur leder till reversibel beredning av enzymaktiviteten 11 och tillväxt av stammen på ett medium innehållande metotrexat (MTX; Figur 1). Denna förening inhiberar endogent DHFR-enzym, men inte den muterade en som används i analysen 28. Två samlingar av PCA-stammar, en som innehåller ~ 4300 MATa stammar med en ORF smält till DHFR F [1,2] fragment och en som innehåller ~ 4800 MAT α stammar med en ORF smält till DHFR [3] fragment, kan köpas till implementera DHFR-PCA på liten eller stor skala på alla laboratorier. Här beskriver vi en allmän men detaljerat protokoll till skärmen för PPI mellan en bete protein och ~ 4800 bytes proteiner med hjälp av denna analys.
Protocol
1. Konstruktion / verifiering av Bait Stammar
- Om betet stam av intresse finns i MATa DHFR F [1,2] samling, hämta det från samlingen som beskrivs i steg 1.1.1, annars konstruera stammen som beskrivs i steg 1.1.2.
OBS: Protokollet som beskrivs här använder en DHFR F [1,2] stam som bete och DHFR F [3] samling som bytesdjur, som denna samling innehåller fler stammar än DHFR F [1,2] samling. Det är dock möjligt att utföra skärmen tvärtom om betet stammen är endast tillgänglig i DHFR F [3] samling eller i båda riktningarna om man kräver högre täckning av interactome.- Tina glycerolmoderplatta som innehåller betet påfrestningar på is under en timme. Sterilisera aluminiumfolie täcker plattan med 95% etanol. Pierce folien med en steril spets, pipett upp och ner för att resuspendera cellerna och strimma 2-3 pl glycerol lager på selektiv jästextrakt peptondextros (YPD) + 100 | ig / ml Nourseothricin (Nat) för att isolera enstaka kolonier. Inkubera under två dagar vid 30 ° C.
- Byggandet av ett bete PCA stam (MATa DHFR F [1,2]).
- Använda hifi-polymeras och en standard-PCR-protokoll, förstärka DHFR F [1,2] kassetten från plasmiden pAG25-linker-DHFR F [1,2] -ADHterm användning av oligonukleotider med överhängande ändar homolog till den sista 40 bp av ORF: s 3'-änden exklusive stoppkodonet (Forward primer) och till den första 40 bp av genens 3'-UTR (omvänd primer) (Figur 1A).
- Omvandla PCR-produkten in i kompetenta jästceller (vanligen i en BY4741 stam) med standard LiOAc / PEG jästtransformationsprotokoll som i 29 (Figur 1A).
- Plate på selektiv YPD + Nat medium för att isolera positiva trans.
- Utför en diagnostisk koloni PCR på isolerade kolonier för att bekräfta rätt DHFR F [1,2] fusion. Använd primers glödgning 1) i genen kodande sekvens (Forward oligo) ca 100 bp uppströms DHFR fusion och 2) i ADH terminatorn kassettens (Omvänd oligo) (Figur 1B).
- Sekvensera PCR-produkten av Sånger sekvense att bekräfta korrekt genfusionen.
- Arkivera det bekräftade bete töjningen i 25% glycerol vid -80 ° C.
OBS: Protokollet kan pausas i detta steg.
2. Pin-verktygs Sterilisering och skriva Rutiner
OBS: Steriliseringsförfarande som beskrivs nedan var optimerad för stiftverktyg manipulerade av BM3-BC (S & P Robotics) robotplattform, men kan anpassas till andra plattformar också. Detta avsnitt beskriver de Pin-verktygs sterilisering och tryckförfaranden som används för att överföra celler från ett medium till ett annat för resten av protokollet. In-house-skript som används för att utföra dessa rutiner kan fås på begäran. Obs that alla steg kan utföras utan behov av en robotplattform med hjälp av en manuell pin-verktyget 30.
- Montera lämplig pin-verktyget på robotplattform.
- Förbered rengöring och våta stationer enligt följande:
- Lägg 500 ml sterilt vatten i vattenbadet stationen.
- Lägg 320 ml sterilt vatten i borststationen.
- Lägg 380 ml 70% etanol i sonikator vid replikering från agarplatta (86 x 128 mm omnitray, innehållande 35 ml stelnat medium) till agarplatta, eller 400 ml vid replikering från en mikrotiterplatta innehållande vätskekulturer till en agarplatta.
- Lägg 35 ml sterilt vatten i den våta stationen (bestående av en steril tom omnitray).
- Vid början av varje dag som kräver robotplattform, sterilisera pin-verktyg fem gånger under en min i sonikator badet. Under tiden, slå på UV-lampa under fem minuter för att sterilisera roboten inneslutningen.
OBS: Detta är inte om rob krävsot är inrymt i en steril huva. - Mellan varje stift-verktygs replikering runda, sterilisera pin-verktyget som följer:
- Blöt stiftet-verktyget fem gånger för 10 sekunder i vattenbadet stationen för att ta bort cellklumpar.
- Blöt den stiftverktyget två gånger fram och tillbaka i borststationen.
OBS: Den roterande borsten tar bort kvarvarande celler. - Blöt stiftet-verktyget två gånger under 20 sekunder i sonicator stationen.
OBS: Återstående celler på stiften kommer att tas bort genom ultraljudsbehandling eller dödas av etanol. - Kontrollera att doppdjup av stiften ökar vid varje efterföljande bad för att säkerställa korrekt sterilisering.
- Torka den stiftverktyget i lufttorkstation för 25 sek.
- Innan celler på källplattorna, blöta stiften i den våta stationen, som innehåller 35 ml sterilt vatten i en omnitray.
- Doppa pinnarna två gånger i kolonierna från källplattan.
- Skriv ut på en nyligen hällde destinationsplatta genom att peka på agar ytan två gånger (nedan kallat verkan av "utskrift" en array).
3. Kondensation av DHFR F [3] Collection i 1536 arrayer Använda en automatiserad Robotic Platform
- Thaw på is DHFR F [3] samling (60 96-brunnars plattor) och en ytterligare 96-brunnar fylls med L-DHFR F [3] kontrollstammen (Figur 1C), som innehåller DHFR F [3] fragmentet och uppströms linker uttrycktes ensamt som en negativ kontroll.
OBS: I princip detta fragment bör inte interagera med någon DHFR-fragment fusionsprotein (se diskussion för detaljer). - Centrifug plattor (snabb spinn) innan du tar bort aluminiumfolie för att undvika risken för korskontaminering mellan brunnar.
- Kondensera samlingen på 16 uppsättningar av 384 stammar (Figur 2A). För att göra detta, för varje 384 array, print fyra glycerolplattor på de fyra kvadranter i ett selektivt YPD + 250 mikrogram / ml Hygromycin B (hygB) omnitray använder the 96 pin-verktyg (här, en 384 matris kan delas i fyra lika mellanrum kvadranter, vardera bestående av 96 positioner i en 2 x 2 matris layout). Sätt i fyra 96-hålsplattor som innehåller L-DHFR F [3] negativ kontroll mellan de 60 andra plattor för att få en slutlig uppsättning av 64 plattor som exakt fyller fyra 1536 arrayer. Sterilisera den stiftverktyget mellan varje replikationscykeln som beskrivs i steg 2.
OBS: Sätt i L-DHFR F [3] plattor för att få en sådan platta på var och en av de fyra sista 1.536 arrayer. - Inkubera plattorna under två dagar vid 30 ° C. OBS: I det här skedet kan DHFR samlingen förvaras i en 384-format vid 4 C i upp till en månad på agarplattor.
- Kondensera samlingen i fyra kedjor av 1.536 stammar (Figur 2A). För att göra detta, för varje 1.536 array, skriva ut fyra kedjor av 384 påfrestningar på de fyra kvadranter en platta av samma medium som i steg 3.2 använder 384 stifts-verktyg (här kan en 1.536 array delas i fyra equally mellanrum kvadranter vardera bestående av 384 positioner i en 2 x 2 matris layout).
- Inkubera plattorna under två dagar vid 30 ° C. OBS: I det här skedet kan DHFR samlingen förvaras i ett 1.536-format vid 4 C i upp till en månad på agarplattor.
- Replikera fyra arrayer på samma medium för att standardisera kolonistorlek med hjälp av en 1.536 pin-verktyg.
- Inkubera plattorna under två dagar vid 30 C.
4. Med hög kapacitet DHFR-PCA Tillvägagångssätt
- Inokulera en kultur av betet stam (DHFR F [1,2] fusion) erhållen från steg 1.1.1 eller 1.1.2 i 20 ml flytande YPD + Nat i ett 50 ml rör (Figur 2B).
- Inkubera under två dagar vid 30 ° C med skakning vid 250 rpm för att låta kulturen för att nå mättnad.
- Efter två dagars inkubation, tallrik 5 ml av kulturen på en YPD + Nat omnitray. Låt celler adsorberas på ytan under 5-10 minuter och avlägsna överskott av vätska (Figur 2B). Upprepa tWice göra tre replikat.
- Inkubera under två dagar vid 30 ° C.
- Skriv betet stam från steg 4.3 och 4.4 på 12 YPD-plattor (tillräckligt för att para fyra plattor av DHFR F [3] insamlings × tre replikat) med en 1.536 pin-verktyget använder varje cell gräsmatta inte mer än fyra gånger.
- Skriv lämplig matris av DHFR F [3] samling ovanpå betet celler med 1536 stift-verktyget (figur 2C).
- Låt stammarna mate genom inkubering under två dagar vid 30 ° C.
- Välj diploida celler genom att skriva kolonier på omnitrays innehåller YPD + hygB + Nat (figur 2C).
- Inkubera under två dagar vid 30 ° C.
- Upprepa diploid urval som beskrivs i steg 4.8 och 4.9 (figur 2B).
- Förbered plattor med media innehållande MTX (MTX-medium) en dag före användning följande steg 21 (OBS:. Vara försiktig när du arbetar med MTX eftersom det är en giftig förening alltid handskar, protection glasögon och en labbrock vid hantering det) (Figur 2C):
- Förbered 10x Lys / träffade / ade aminosyra avhopp i avjoniserat vatten. Filter-sterilisera avhopp i en steril flaska med hjälp av en 0,2 ìm steril spruta filter eller, om det behövs i stora mängder, en 0,2 pm flaska toppfiltreringstratt (tabell 1).
- Bered en 10 mg / ml MTX stamlösning i dimetylsulfoxid (DMSO). Används omedelbart efter beredning av lösningen och frysa resten vid -20 ° C. Skydda mot ljus som den är ljuskänslig. Frys inte MTX igen efter upptining det.
- Förbered media enligt följande (medel ingredienser och kvantiteter är desamma som de som används i Tarassov m.fl. 11.):
- För en liter medium, blanda i två separata kolvar: 1) 6,69 g jästkvävebas utan aminosyror och utan ammoniumsulfat och 330 ml avjoniserat vatten; 2) 25 g ädelagar och 500 ml avjoniserat vatten.
- Autoklav kolvar vid 121 ° C under 20 min.
- Jämvikta temperatur i ett vattenbad vid 55 ° C under minst en timme.
- Blanda de två kolvarna tillsammans och tillsätt 50 ml steril 40% glukos, 100 ml av 10x sterilt avhopp, och 20 ml av MTX 10 mg / ml.
- Häll 35 ml (se not nedan) av medium i omnitrays. Låt stelna i minst en och en halv timme. Shield plattor från ljus.
OBS: Här, hälla 35 ml medium per omnitray är avgörande för att säkerställa lika plåttjocklek, vilket är viktigt för alla steg nedströms.
- Bildplattor från den andra omgången av diploida val med robotplattform eller med en vanlig digitalkamera med jämn platta belysning. Använd dessa bilder för att identifiera tomma positioner på de matriser vid utförande nedströms analys. Se till att de parametrar för kameran är alltid samma och att roboten ljuset slås på.
- Skriv diploida celler på MTX media using av 1.536 pin-verktyg.
- Inkubera under fyra dagar vid 30 ° C i plastpåsar för att förhindra torkning.
- Förbered en andra sats av omnitrays innehåller MTX-medium som beskrivs i steg 4.11.
- Efter fyra dagars inkubering, bildplattor med hjälp av robotplattform eller vanlig digitalkamera. Se till att de parametrar för kameran är alltid samma och att roboten ljuset slås på.
- Utför en andra omgång av MTX val genom att replikera cellerna på den andra satsen av MTX medier.
NOTERA: Detta kommer att minska bakgrundstillväxt av PCA-stammar och att den kvantitativa upplösningen. - Inkubera under fyra dagar vid 30 ° C i plastpåsar för att förhindra torkning.
- Bildplattor som beskrivs i steg 4.16.
5. Bildanalys
- Analysera bilder av koloni arrayer med anpassade ImageJ 31 skript eller använda publicerade programvaror såsom kolonisatör, Ht koloni rutnät analysator, Cell profiler, Colony Bildr, ScreenMill, YeastXtract och Gitter (sammanställts i 32). Bildanalys bör utgång ett eller flera kalkylblad som innehåller kolonistorlekar för varje position i varje array använder dessa kolonistorlekar för alla efterföljande analyser.
OBS: I denna studie använde vi en anpassad ImageJ skript som beskrivs i Leducq et al 33 (se diskussion avsnitt för mer information)..
6. Dataanalys
OBS: Resultat från bildanalys kan bearbetas i en tabulator som Excel eller använda ett skriptspråk som R 34. Följande steg beskriver proceduren med en anpassad ImageJ 31 manus.
- Med hjälp av en anpassad manus, sammanfoga utdatafiler från bildanalys och kommentera varje rad med plattan och sila informationen enligt kompletterande tabell 1.
- Log 2 omvandla koloni storleksvärden (Integrerad täthet eller koloniområde, här, kolumnen "IntDenBackSub & #8221; från Kompletterande Tabell 1 användes).
OBS: Värde distributionen kommer att se ut som i figur 3A. - Normalisera dessa värden genom att subtrahera medianvärdet för varje platta.
OBS: Detta alternativ styr steg för platt partiskhet som kan bli följden av ojämlik medier kvantitet eller variation i automatisk bildtagning, och minskar inter replikera varians (Figur 3B). - Kontrollera att replikat korrelerar med varandra (figur 3C) för att bedöma reproducerbarhet av experimenten.
- För att skilja interagera från icke-interagerande bete-rov par, satt en hög förtroende tröskelvärde som motsvarar de 95: e percentilen av fördelningen av L-DHFR F [3] kontroller.
OBS: I detta försök motsvarar detta 3,39 (Figur 3D). Alternativt kan ett tröskelvärde baserat på överlappning med kända fysiska Interactmedlemmar såsom de redovisas i BioGRID 35 användas.Se diskussionen för mer information. - För något bete, bytesorganismer filter identifierats som involverade i falskt positiva interaktioner i DHFR-PCA skärmar (se diskussion för mer information) och som anges i kompletterande tabell 2 (identifierad som "1" i kolumnen "filtrerad").
- Medelvärdet log2 normaliserade koloni storleken på de tre replikat av varje interaktion (kolumn "Fördelning" i kompletterande tabell 2).
7. Utvärdering av fysisk Interactmedlemmar Använda Småskaliga Experiment
OBS: Alla PPI av särskilt intresse att ha en poäng ovanför eller nära den tillämpade tröskeln kan valideras med hjälp av DHFR-PCA-analysen i en småskalig experimentell design med hjälp av en tillväxtanalys på fast eller flytande MTX mediet. Stegen nedan visar proceduren att manuellt konstruera diploida PCA stammar och utföra stickprovsanalyser på MTX-medium. Försöksledaren ska utföra de här stegen för alla Necessäry kontroller (Agn-DHFR F [1,2] xL-DHFR F [3], Zipper-linker-DHFR diploida stammar och linker-DHFR diploida stammen).
- Plate 2-3 ìl av glycerol lager av betet stammen genereras i 1.1.2.6), L-DHFR F [3] kontrollstammen, den Zipper-länk-DHFR och länk-DHFR diploida stammar på YPD + Nat, YPD + hygB och två gånger YPD + Nat + hygB media, respektive.
- Hämta bytet av intresse för DHFR F [3] insamling och följ instruktionerna i steg 1.1.1, men strimma belastningen på YPD + hygB medel istället för YPD + Nat medium.
- Utför en diagnostisk PCR som i 1.1.2.4 för att bekräfta DHFR F [3] fusion vid bytet locus och sekvens produkten.
- Ympa 1 ml flytande YPD medium med de haploida stammar att para (Bait x Prey, Bait x L-DHFR F [3] kontrollen) och växa minst två dagar vid 30 ° C för att låta de diploider att bilda.
- Välj diploider genom strimmor 4-5 pl av kultur i 7,4 på fast YPD + hygB + Nat medium. Grow två dagar vid 30 ° C.
- Select en isolerad koloni och växa över natten i flytande kultur (1 ml) för att utföra tillväxtanalys.
- Förbered MTX och DMSO (samma ingredienser som MTX-medium, men utan MTX) plattor om dagen före användning. Se steg 4.11 för mer information.
- Utför tillväxtanalys genom att fläcka serieutspädningar av de olika kulturerna på kontroll (DMSO) och selektionsplattor (MTX).
- Späd förkulturer till OD = 1.
- Utför fem-faldiga utspädningar (upp till en utspädningsfaktor av 625) i en steril 96-brunnars platta.
- Spot 4 il av varje utspädning på PCA media (DMSO och MTX).
- Inkubera vid 30 ° C i plastpåsar för att förhindra torkning.
- Bildplattor från dag 1 till 7 i inkubation använder robotplattform eller en vanlig digitalkamera.
Representative Results
Kompletterande tabell 2 är ett exempel på representativa resultat erhållna med användning av jästproteinet Nup82 smält till DHFR F [1,2] fragmentet såsom ett bete. Tröskeln definieras med L-DHFR F [3] kontroller kan användas som en empirisk tröskel för att bestämma höga förtroende hits (figur 3D & 3E). Alternativt kan den värdering rankning användas för att utföra Gene Ontology anrik eller annan funktionell analyser 36 baserat på guldstandarder 37. De kända fysiska interactmedlemmar av betet kan hämtas från databaser som BioGRID 35 och överlagras på data (figurerna 3E & 3F). I detta exempel har fem av åtta höga förtroende hits tidigare rapporterats som Nup82 Interactmedlemmar och två är en del av Nup82 underkomplex, Nup116 och Nup159 (Figur 3F & 3G). Den andra medlemmen av komplexet, Nsp1, inte visar någon interaction i vårt experiment. Två bytesorganismer, Ade17 och Tef2 (visas i figur 3F), hade poäng ovanför den hårda tröskelvärde som tillämpas, men dessa är sannolikt falska positiva när de interagerar med nästan alla bete protein i PCA-skärmar vi har utfört (opublicerade resultat). Å andra sidan kan Pex30 representera en ny fysisk påverkare i Nup82 och vi kunde bekräfta detta samspel med hjälp DHFR-PCA vid låg genomströmning (figur 3G). Pex30 är en peroxisomal membranprotein och några direkta interaktioner har rapporterats mellan kärn por komplex (NPC) och denna organell. Ett två-hybrid skärm identifierades två andra NPC-protein, Nup53 och Asm4 (Nup59), som fysiska interactmedlemmar av Pex30 38, och en genetisk interaktion mellan Pex30 och Nup170 har rapporterats 39. Två andra interaktionspartners upptäcks Nup120 och Nup85 (Figur 3F & 3G), är inte en del av Nup82 sub-komplex, som visar förmåganav DHFR-PCA att upptäcka interaktioner inom och mellan subcomplexes i större komplex 11.
Figur 1:. Engineering jäststammar för hög genomströmning DHFR-PCA (. Siffra anpassad från Leducq et al 2012 33) (A) Konstruktion av haploida Mata och MAT α stammar att smälta Gene1 (G1) och Gene2 (G2) med DHFR F [1,2] -NatMX och DHFR F [3] -HPH kassetter, respektive. Kassetter amplifieras från plasmider pAG25-DHFR F [1,2] och pAG32-DHFR F [3] med framåtriktade primrar G1-5 'och G2-5 ", och bakåtriktade primrar G1-3' och G2-3", och sedan införd i genomet vid 3'-änden av mål-genen genom homolog rekombination. De erhållna proteinerna, P1 och P2, är respektive sammansmält med DHFR F [1,2] fragment (MATa) och DHFR F [3] fragment (MATa) via en flexibel linker. (B) Kontroll av konstruktion i (A) utförs genom sekvense korsningar mellan Gene1 s och Gene2 s ORF och DHFR kassetter. De konstruerade PCA stammar av motsatta parningstyper därefter paras för att bilda en diploid. Diploida stammar växer på MTX medium om de två komplementära DHFR-fragment bringas i närhet av en interaktion mellan P1 och P2, som rekonstituerar aktiviteten hos DHFR-enzym. (C) Konstruktion av kontroll diploid PCA stammar för DHFR-PCA skärmar. De negativa kontroller (L-DHFR) konstrueras genom att omvandla separat haploida Mata och MATa stammar med plasmider p41-linker-DHFR F [1,2] och p41-linker-DHFR F [3] 11, respektive. De två stammarna paras vilket resulterar i en negativ kontroll diploid stam i vilken DHFR-fragmenten är oförmögnaatt komplettera varandra (överst). Positiva kontroller är konstruerade med samma tillvägagångssätt som för de negativa kontrollerna, men de plasmider omvandlas i haploida stammar (p41-blixtlås-linker-DHFR F [1,2] (p41-ZL-DHFR F [1,2]) och p41 -zipper-linker-DHFR F [3] (p41-ZL-DHFR F [3])) innehålla två GCN4 parallell leucinzipper fragmenten fuserade till de komplementära DHFR-fragment, vilket leder till en stark och konstitutiv interaktion som rekonstituerar DHFR-aktivitet (nedre ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Med hög kapacitet DHFR-PCA förfarande (figur anpassad från Leducq m.fl. 33.) (A) MAT α DHFR F [3] samling. kondenseras i en 1536-format genom två på varandra följande rundor av kondens. Först är glycerol lagerplattor kombinerat med grupper om fyra om selektiv YPD + hygB medium i en 384-format med hjälp av 96 pin-verktyg. För det andra, är 384 matriser kombineras med grupper om fyra om selektiv YPD + hygB medium i en 1536-format med hjälp av 384 pin-verktyget. (B) Cell gräsmattor i MATa PCA bete stam bereds genom att odla en mättad kultur av betet stammen i selektiv YPD + Nat medium och plätering kulturen på en YPD + Nat omnitray. (C) Dessa gräsmattor används för att para sig betet stam med DHFR F [3] samling på YPD medium. Celler successivt överförs två gånger på YPD + hygB + Nat medium för att selektera för diploider och två gånger på MTX-medium för att utföra PCA. Tillväxten kommer endast observeras på MTX medium om DHFR fragmenten kompletterar varandra efter en interaktion mellan betet och bytesproteinerna.e.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:.. Dataanalyser genom stegen för normalisering, fastställande av en signifikanströskel och identifiering av positiva interaktioner (A) Densitet fördelning av kolonistorlek på varje platta (log 2) (B) Normalisering av medianen av varje bild korrigerar för fördomar förknippas med platt-to-platta effekter. (C) Heatmap visar Spearman korrelationskoefficienten bland plattorna, vilket bekräftar reproducerbarheten av förfarandet. (D) Fördelning av poäng för de testade PPI och L-DHFR F [3] kontroller. En hård tröskel kan ställas in på de 95: e percentilen av L-DHFR F [3] distributionen att identifiera hög förtroende PPI (representerad av en streckad vertikallinje). (E) Rank ordning fördelning av Medelpoängen för varje byte. Tidigare rapporterade fysiska interaktionspartner Nup82p i BioGRID 35 identifieras av cirklar och de som redovisas i denna studie identifieras med röda prickar. Tröskeln definieras i (D) visas som en streckad linje. (F) Nätverks visar hög förtroende PPI identifierats i denna studie. Blå kanter visar tidigare rapporterade fysiska Interactmedlemmar (BioGRID 35) och gula kanter visar en tidigare orapporterade interaktion med Pex30. (G) Spot-späd analys av PCA diploida stammar involverar Nup82-DHFR F [1,2] och bytesdjur-DHFR F [3 ] par identifierats som fysiska interactmedlemmar av Nup82p i föreliggande studie. Tillväxtanalysen utfördes i DMSO-medium (MTX lösningsmedel, vänster panel) och MTX-medium (höger panel). Negativa kontroller består av Nup82-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] och Linker-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] och en positiv kontrollgrupp bestående av than stark växelverkan mellan två leucinblixtlås delar (blixtlås-DHFR F [1,2] - blixtlås-DHFR F [3]) var inkluderade. Celltillväxt överlägsen de negativa kontrollerna i MTX-medium ska tolkas som en fysisk interaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Aminosyra | Mängd (g) |
| Adeninsulfat * | 0,2 |
| L-Tryptophan | 0,4 |
| L-tyrosin | 0,3 |
| L-Fenylalanin | 0,5 |
| L-glutaminsyra (mononatriumsalt) | 1,0 |
| L-asparagin | 1,0 |
| L-valin | 1,5 |
| L-Treonin | 2,0 |
| L-serin | 3,75 |
| Uracil | 0,2 |
| L-histidin HCI | 0,2 |
| L-arginin HCI | 0,2 |
| L-metionin * | 0,2 |
| L-Lysin * | 0,2 |
| L-leucin | 0,6 |
| * Indragna samband med en standard PCA (som i detta protokoll) men kan tillsättas för andra ändamål. | |
Tabell 1:. Sammansättning av 10X Lys / träffade / ade avhopp i MTX-medium Mängderna är för en liter 10x drop-out. Asterisker betecknar föreningarna som skall dras tillbaka för standarden MTX mediet, men som kan tillsättas för andra ändamål.
Kompletterande Tabell 1:. Kombinerade data från de 12 testplattorna Tabell 1 innehåller konkatenerade data från ImageJ analys utförd med en anpassad ImageJ manus med varje rad motsvarar en enda position på varje 1.536 array. Dessutom har varje rad blivit kommenterad med information om bildfilen, DHFR samling tallrik, replikera, ORF och proteinnamn.
Kompletterande Tabell 2:. Genomsnittlig normaliserad ökning per stam Tabell 2 innehåller den genomsnittliga Log 2 normaliserade tillväxt för varje stam av samlingen tillsammans med standardavvikelsen. Filtrerade bytesorganismer, hits och kända fysiska Interactmedlemmar identifieras i separata kolumner.
Discussion
Vi beskriver ett protokoll baserat på DHFR-PCA-analysen möjliggör systematisk identifiering av fysiska interactmedlemmar för varje given bete protein vid hög genomströmning. Detta protokoll kan anpassas genom att screena efter fler beten, och detta vid varje önskad nivå av replikation. Vi visar tillförlitligheten detta protokoll genom identifiering av fysiska interaktionspartner för ett bete protein involverat i Kärnpor Complex: Nup82. Vår analys aktiverat för att hitta fem tidigare rapporterade Interactmedlemmar och en tidigare orapporterade Interactor (figurerna 3F & 3G), belyser förmågan av metoden för att studera jästproteinet interactome.
Protokollet som beskrivs här innehåller flera kritiska steg som försöksledaren bör uppmärksamma. Vi rekommenderar att 1) Se till att betet DHFR F [1,2] fusion är korrekt (Figur 1B); detta kan uppnås genom sekvensering av konstruktionen och measuring korrekt proteinuttryck med användning av en anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR-F [3] antikropp; 2) Före början skärmen, rekommenderas att kontrollera om någon bete av intresse uppvisar promiskuösa interaktioner i PCA-skärmar. Detta kan göras genom att utföra kontrollskärmar med beten korsade med den lämpliga L-DHFR kontroll eller genom att manuellt hoppass betet med den lämpliga L-DHFR kontroll och utförande av en tillväxtanalys i MTX-medium. 3) Plattorna bör hällas dagen innan de används, så att fukt är optimalt för cellvidhäftning på agarytan under tryckprocessen; 4) Källa plattor bör inte användas mer än fyra gånger för att överföra tillräckligt med celler på destinationsskylten. Att öka antalet kopior av destinationsplattan kan göras genom successiva steg i expansionen (t.ex. fyra exemplar -> 16 kopior -> 64 kopior). Alternativt kan celler plockas vid olika positioner på gräsmattor eller i kolonin mellan olika rundor av replikering; 5) Om flera positions saknas efter den diploida val (s), se till att käll plattorna inte användes för många gånger i parningssteget (steg 4,5-4,7); 6) Se till att MTX mediet innehåller alla viktiga ingredienser vid rätt koncentrationer. Faktum är att om ingen tillväxt alls observeras på MTX-medium, kan det vara antingen för att ingen interaktion är detekterbar med PCA för proteiner av intresse eller på grund av MTX-medium var inte beredd på rätt sätt. För att säkerställa att mediet tillåter tillväxten av stammar som visar DHFR-fragment komplemente, kan en konstitutiv interaktion sättas vid tomma positioner i samlingen och användes som en positiv kontroll, såsom DHFR-fragment fuserade till leucinblixtlås delar 33 (figur 1C). Parallella tester med de länk-DHFR fragment eller blixtlås-linker-DHFR fragment kommer att tillåta att skilja mellan villkor som gör att alla celler att växa (lågt MTX koncentration eller bete protein som tenderar att göra falska positiva interaktioner, som described nedan) och villkor som förhindrar tillväxten av alla stammar (MTX koncentration för hög eller viktig ingrediens saknas i mediet); 7) Med tanke på att PCA sker genom successiva replika från ett medium till ett annat, kan korskontaminering mellan stammarna mellan olika plattor inträffa om, till exempel, är stiftet-verktyget inte steriliseras ordentligt mellan replikerings rundor och / eller det sista vattnet bath (dvs våt station) i steriliseringsförfarandet är förorenad av kolonier av tidigare replikering rundor. Flera positioner på de arrayer är tomma och kan således användas som kontroll positioner där ingen tillväxt bör följas för att upptäcka korskontamination.
Bildanalys kan utföras med flera publicerade mjukvaror (se avsnitt 5 i protokollet) eller alla anpassade skript. I denna studie, exekverar den anpassade skriptet följande steg: 1) Skriptet drar ifrån pixelvärdena för en tom tallrik att pixelvärdena för varje platta för att samverkarrect för belysning fördomar. 2) Skriptet omvandlar varje bakgrundskorrigerad bild till binära använder ett pixelvärde tröskel på 10. 3) För varje 1536 positionerna för varje platta, bestäms genom att lägga en rektangel på kant kolonierna, körs skriptet ImageJ "Analysera partiklar ... "-funktion i en cirkulär markering. Den cirkulära, ställs in med en radie som är lika med intervallet mellan två positioner minus 10 pixlar. 4) Skriptet väljer närmaste partikeln från mitten av markeringen och bekräftar det som en koloni om dess plats är inte mer än halva intervallet mellan två kolonier bort från mitten av markeringen. 5) Skriptet mäter pixelvärden för den valda partikeln på bakgrunden-korrigerade bilden. 6) För att ytterligare korrigera eventuella kvar bakgrundsbelysning fördomar, skriptet subtraherar medelvärdet för alla pixlar från den cirkulära val som inte var en del av en partikel till pixelvärdena i kolonin. Summan av dessa korrigerade pixelvärdear, som är lagrade i kolumnen "IntDenBackSub" av Kompletterande tabell 1, används som ett mått på kolonistorlek.
Ett kritiskt steg inom analysdelen är valet av tröskel betydelse. Här valde vi ett tröskelvärde baserat på fördelningen av den negativa L-DHFR F [3] kontroller, men beroende på målet på skärmen, kan ett sådant tröskelvärde vara för stränga. Faktum L-DHFR F [3] kontroller överuttryckt (stark TEF promotor) så att de komplementära fragmenten spontant kan komplettera varandra och dessa är således inte representativa för uttrycket av de flesta proteiner. Detta understryks av det faktum att fördelningen av L-DHFR F [3] kontrollerna är högre än genomsnittet i bakgrunden tillväxt (figur 3D). Således kan interaktioner med poäng under denna stränga tröskel men det är helt klart utanför bakgrundstillväxten fördelningen kan betraktas som förmodade hits som kan representera, till exempel, övergående eller svag interåtgärder. Dessa kan studeras närmare och kors valideras om, till exempel, är de två proteinerna uttrycks inte på nivåer som kan tillåta den spontana komplettering av DHFR fragmenten som de L-DHFR kontroller. Som ett alternativ, kan man ställa in en signifikans tröskelvärde baserat på andelen överlappning med rapporterade fysiska interactmedlemmar i databaser som BioGRID 35 för att maximera andelen sant positiva över falska positiva. Men till skillnad från användningen av L-DHFR distribution, detta alternativ kan inte alltid vara möjlig om, till exempel, är antalet kända fysiska Interactmedlemmar inte tillräckligt hög. Dessutom valet av tröskeln betydelse påverkar andelen falska positiva och falska negativa i den slutliga datamängden. Faktiskt, liksom alla andra analys PPI upptäckt, kan falska positiva resultat av ospecifik interaktion av ett protein med DHFR-fusionsprotein om, till exempel, är det protein mycket riklig som tidigare nämnts. Dettaexemplifieras av det faktum att vissa bytesdjur systematiskt interagera med alla betes proteiner i PCA skärmar och därmed måste tas bort från analysen 11 (t.ex. Tef2 och Ade17 och kompletterande tabell 2). För att kringgå detta problem, en kontroll PCA skärm av de två samlingarna mot lämplig L-DHFR styrning (F [1,2] eller F [3]) för att identifiera beten och bytesdjur som uppvisar spontan DHFR fragment komplettering kan utföras i de särskilda villkoren på varje skärm. Dessutom kan utföra en Gene Ontology anrikning analys öka förtroendet i data om funktionen av en viss bete är känd. Å andra sidan, kan DHFR-PCA ger upphov till falska negativa resultat av flera skäl: 1) inte alla proteiner kan fuseras till DHFR-fragment, eftersom dessa kan destabilisera proteinerna eller modifiera deras lokalisering om, till exempel, den DHFR-fusion till C-terminalen interfererar med en lokaliseringssignal; 2) DHFR rekonstitution i vissa cellulära avdelningar may inte producerar folat om, till exempel, är inte tillgänglig en nödvändig förutsättning för folat syntes; 3) C-terminaler behov att vara inom ett avstånd av 8 nm för DHFR komplemente inträffa 11. Således kan en välkänd interaktion inte upptäckas om deras C-terminaler inte tillräckligt nära i rymden. Detta exemplifieras här av det faktum att en stor del av Nup82 fysiska interaktioner rapporterats i databaser, varav de flesta är indirekt, inte registreras i vårt test. På samma sätt kommer interaktioner mellan membranproteiner som C-terminalerna är i trans i förhållande till membranet inte leda till DHFR fragment komplettering och kommer inte att upptäckas 11. Begränsningar 1) och 3) kan kringgås relativt enkelt genom att smälta DHFR-fragmentet till N-terminalen av proteinet. Detta kan förhindra att störa en lokaliseringssignal nära C-terminaler och kan tillåta att upptäcka en interaktion mellan membranproteiner vars N och C-terminalen är i cis släktingtill membranet.
Flera utmaningar återstår i studien av PIN-koder (över i 2,3). De kartor över PIN hittills producerats har till stor del beskrivs i ett enda försöks förutsättning för varje art och därmed erbjuda en enda ögonblicksbild av hur proteinnätverk kan organiseras. Det finns därför ett behov av att utforska andra experimentella betingelser för att se hur PIN-koder kan omorganiseras som svar på miljöförändringar, specifika stimuli, över utveckling eller följande mutationer. Dessa utmaningar kommer att övervinnas genom utveckling av ny teknik för förhör PPI i realtid, i levande celler och genom att anpassa nuvarande tekniker så att de kan användas av en större gemenskap av laboratorier. Som en kvantitativ teknik som kan upptäcka förändringar i mängden DHFR komplemente komplex 27, kan DHFR-PCA anpassas för att övervinna dessa utmaningar och har använts för att studera hur PPI påverkas av ett DNA-skadande medel 22 25, gen strykningar 23,26 eller i andra jästarter och hybrider 33. Exploring dessa nya dimensioner kommer att bli allt viktigare för att avslöja den dynamiska av PIN.
Disclosures
En del av de öppna tillgång publiceringsavgifter för denna artikel betalades av S & P Robotics.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Canadian Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 och 324.265, en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Discovery bidrag och en Human Frontier Science Program bidrag till CRL. CRL är en CIHR New utredare. Guillaume Diss stöds av en Proteo gemenskap. Samuel Rochette stöds av NSERC och FRQNT gemenskaper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
| 96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
| 384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
| 1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
| Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
| Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
| Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
| Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
| Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
| Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
| Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
- Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
- Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
- Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96 (2009).
- Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
- Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
- Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
- Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
- Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
- Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
- Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
- Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
- Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
- Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
- Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).
- Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
- Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
- Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
- Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).
- Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
- Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
- Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5 (2013).
- Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
