Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation af human alloantigen-specifikke T-celler fra perifert blod

Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52257
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pathology, University of California, San Diego

Introduction

T-lymfocytter er kritiske komponenter i det adaptive immunsystem. T-celler er ansvarlige for ikke kun direkte mediere beskyttende immunrespons over for patogener gennem en række effektormekanismer, men også aktivt opretholde immunologisk selvtolerance og lede svarene fra andre celler i immunsystemet. Disse funktioner er rettet gennem en række integrerede signaler, herunder T-celle receptor (TCR) ligering, cytokiner og chemokiner, og metabolitter 1. Af disse signaler, TCR er af særlig betydning, da det giver den karakteristiske specificitet, der definerer T-celle rolle i adaptiv immunitet. TCR interagerer med lineære peptid-antigener præsenteret af MHC (human ortholog HLA) molekyler (pMHC komplekser) på en yderst specifik og følsom måde til at give de signaler, som initierer T-celle-effektorfunktion. De biokemiske parametre for TCR interaktioner med pMHC ligander giver ikke blot specificitet for Tcelle aktivering, men også har en kvalitativ indvirkning på den efterfølgende T-celle funktion 2. Således studerer T-celle funktion kræver ofte at undersøge svarene fra klonede T-celler med definerede antigenspecificitet.

Den humane T-celle rum, indeholdende ca. 10 12 αβ T-celler, der indeholder en anslået juli 10-august 10 forskellige αβTCRs 3-4. Denne forskelligartede repertoire giver mulighed for anerkendelse af det enorme opbud af peptider fra potentielle patogener, som ville kræve en T-celle respons for beskyttende immunitet. Det anslås, at hyppigheden af T-celler reagerer på en given fremmed antigen, der præsenteres ved selv-MHC er af størrelsesordenen 10 -4 - 10 -7 i fravær af respons på dette antigen 5 før immunrespons. Den naive T-celle-repertoire er formet af thymus udvælgelse for at sikre evnen til at genkende selv-MHC præsenterer peptidantigener og begrænse reagereske sammenhæng mod selvstændige peptidantigener maksimere den potentielle anvendelighed til at mediere beskyttende immunitet 2. Men i strid med dette formål reaktionsevne, en relativ stor frekvens, 10 -3 - 10 -4, af T-celler fra immunologisk naive individer reagere på stimulation med allogene celler, erkender både de fremmede MHC-molekyler samt de endogene peptider, de frembyder 6. Anerkendelsen af ​​allogene pMHC ligander er strukturelt ligner anerkendelse af fremmede antigener præsenteret af selv-MHC; TCR gør kritiske biokemiske interaktioner med både allogen MHC-molekyle samt præsenteret peptid 7. Den robuste karakter af reaktionen af T-celler til allogene stimulering resultater fra mangfoldigheden af pMHC komplekser til stede på overfladen af allogene celler 8. Det skønnes, at hver MHC viser ca. 2 x 10 4 forskellige endogene peptidantigener 9. Dette breadth respons på allogen stimulering er et væsentligt aspekt af den klinisk relevante patologi, såsom allograft-afstødning eller graft versus host-sygdom (GVHD), som følge af T-celle alloreactivity.

Undersøgelse af humane T-celle alloreaktive responser har traditionelt påberåbes undersøge polyklonale responser af naive T-celler efter stimulering med allogene celler. Gentagen stimulering med allogen samme cellelinie kombineret med begrænsende fortynding analyser er i stand til at generere klonale T-celler med definerede anerkendelse af allogen HLA 10. Men denne fremgangsmåde er problematisk for behandlingen svar på individuelle allogene pMHC ligander, som stort og varieret repertoire af endogen pMHC komplekser til stede for en given allogen HLA stimulerer et bredt repertoire af T-celler. Denne bulkpopulation stimulation og begrænsende fortynding fremgangsmåde vil kræve screening af store antal kloner til at isolere T-celler med den ønskede reactivity mod et enkelt pMHC ligand. Derudover er frekvensen af ​​T-celler reagerer på en individuel allogen pMHC ligand er relativt lav blandt naive T-cellepopulationer, som udgør en hindring for effektiv produktion af humane T-celle kloner, der reagerer på et givet antigen.

Identifikation og isolering af antigenspecifikke T-celler fra polyklonale populationer er blevet aktiveret af udviklingen af fluorofor-mærket pMHC multimerer 11. Denne fremgangsmåde udnytter specifikke peptidantigener indlæst i rekombinante opløselige biotinylerede MHC-molekyler, der er mærket ved binding til en streptavidin-mærket fluorofor. Multimerisering af pMHC øger aviditeten, som kompenserer for den iboende lav (uM) affinitet TCR for opløselige pMHC ligander. Mærkede celler kan identificeres og isoleres ved hjælp af flowcytometri. Imidlertid er denne fremgangsmåde stadig begrænset af den lave frekvens af antigen-specifikke T-celler blandt naive T-cellepopulationer, som typiskstørrelsesordener mindre end grænsen for præcis identifikation og kvantificering på de fleste flowcytometre. For at løse denne begrænsning, er en metode til pMHC tetramer mærkning og efterfølgende magnetisk perle berigelse for tetramer-mærkede celler blevet udviklet 12. Denne metode har vist pålidelig detektering, optælling, og isolering af lavfrekvente antigen-specifikke T-celler.

Denne protokol beskriver en effektiv protokol til generering af humane T-celle kloner, der specifikt reagerer på individuelle allogene pMHC ligander. Protokollen anvender pMHC (HLA) multimer mærkning og berigelse for isolering af alloantigen-specifikke humane T-celler med flowcytometri cellesortering og en robust fremgangsmåde til in vitro-dyrkning af humane T-celler til at muliggøre produktion af T-cellekloner fra enkelte sorterede celler ( oversigten i figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol kræver brug af perifere blodprøver fra frivillige forsøgspersoner. Al forskning med menneskelige forsøgspersoner skal gennemgås og godkendes af et menneske Studies Institutional Review Board at sikre overholdelse af Helsinki-deklarationen (2013) og Health Insurance Mobilitet og Accountability Act af 1996.

1. Isolering af T-celler fra fuldblod

  1. Før igangsættelse opvarme densitetsgradient medium til stuetemperatur. Alikvot 4 ml densitetsgradient medium i 2-4 sterile 15 ml koniske centrifugerør (1 tube vil blive anvendt til hver 10 ml samlede volumen af ​​fortyndet blod).
  2. Opnå 10-20 ml blod i 1-2 natriumheparin spray belagt (grøn top) venøse blodopsamlingsrør. Saml humane prøver under tilsyn af uddannede personer og i henhold til en Institutional Review Board godkendte protokol.
  3. Tør ydersiden af ​​rørene med 70% ethanol. Fjern forsigtigt toppen af ​​filled opsamlingsrør og dekanteres blod i et sterilt 50 ml centrifugerør.
  4. Tilsæt 10 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) til hver blodopsamlingsrør. Saml PBS, føje til dekanteres fuldblod, og bland forsigtigt.
  5. 25 pi Humane T-celleberigelse Cocktail / 2 ml totalvolumen. Der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter.
  6. Anvendelse af en 10 ml pipette, lag op til 10 ml af 1: 1 fortyndede blod forsigtigt på toppen af ​​densitetsgradient medium. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre overfladen af ​​densitetsgradient medium.
  7. Centrifuge lagdelt blod og densitetsgradient medium ved 1.200 xg i 20 minutter ved 20 o C.
  8. Fjern rørene fra centrifugen, idet man ikke forstyrre grænsefladen mellem densitetsgradient medium og laget af leukocytter på grænsefladen mellem densitetsgradient medium og fortyndet plasma. Ved hjælp af en 5 ml pipette forsigtigt indsamle leukocyt lag og overføres til en ny steril 50 ml konisk badekare.
  9. Tilføj PBS for at bringe volumenet af den indsamlede PBL til 50 ml og blandes forsigtigt.
  10. Centrifugeres ved 600 xg i 5 minutter ved 20 o C. Dekanteres.
  11. Resuspender celler pelleteret i 10 ml steril flowcytometri sortering buffer (sterilfiltreret PBS indeholdende 1% BSA). Prøve 10 pi cellesuspension, fortyndes 1:10 (føj til 90 pi) trypanblå at tælle celler, der bruger et hæmocytometer (forventet afkast med 1 - 4 x 10 6 celler / rør fuldblod).
    1. Fjern 1 ml prøve, overførsel til 5 ml rør, og holde på is til analyse af T-celler, der ikke er mærket med tetramer. Hold cellesuspension på is.

2. Magnetisk Berigelse af alloantigen-specifikke T-celler

  1. Fortynd alloantigen pMHC tetramer til 1: 100 i steril slags buffer.
  2. Centrifuge cellesuspension (9 ml fra trin 1.11) ved 600 xg i 5 minutter ved 20 o C. Dekanteres.
  3. Tilsæt 50 pi fortyndet alloantigen pMHC tetramer til pelleteretceller (op til 10 7 celler). Bland ved forsigtig pipettering. Overførsel til en steril 5 ml rør. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilsæt 2 ml slags buffer. Centrifugeres ved 600 xg i 5 minutter ved 20 o C. Dekanteres.
  5. Resuspender celler i 100 pi slags buffer. Tilsættes 10 pi Biotin Selection Cocktail og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  6. Tilsæt 5 pi Magnetic Nanopartikler og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
  7. Tilføj 2,5 ml slags buffer og bland forsigtigt ved pipettering. Fjern 100 ul aliquot, overførsel til 5 ml rør, og holde på is til analyse af præ-berigelse celler.
  8. Placer 5 ml rør indeholdende cellesuspensionen i cellen separation magnet. Hætten bør være løst oven på røret. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Fjern forsigtigt hætten fra røret. Holder røret og magnet sammen, dekanteres rørets indhold i et frisk 5 ml rør. Må ikke trykke eller ryste tuben indhold tilfjerne de sidste dråber af væske.
  10. Glasset fjernes fra magneten. Tilsæt 2 ml kold slags buffer og bland forsigtigt ved pipettering. Prøve 10 pi cellesuspension fortyndes 1: 2 (føj til 10 pi) trypanblåt til at tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.

3. Fremstilling af T-celler til Single-celle flowcytometri Cell Sorting

  1. Tilføj kold slags buffer til alle rør af celler (tetramer umærket, tetramer-mærket un beriget, og tetramer-mærket beriget) for at bringe volumen til 3 ml.
  2. Centrifugeres ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekantere buffer at inddrive celler.
  3. Resuspender pelleterede celler i 25 pi kold slags buffer. Tilsæt 5 pi human Fc blok. Inkuber på is i 20 min.
  4. Forbered antistoffer til flowcytometri sortering. Bland 15 pi slags buffer, 15 pi anti-CD5, 15 pi anti-CD14, og 15 pi anti-CD19.
  5. Tilsættes 20 pi antistof blanding til hvert rør af celler. Inkuber på is i 20 min.
  6. Tilsæt 2 ml kold slags buffer til hvert rør.
  7. Centrifugeres ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekantere buffer at inddrive celler.
  8. Resuspender celler i en koncentration på 1 -2 x 10 6 celler / ml i slags buffer.
  9. Portion 100 pi human T-celle dyrkningsmedium (Iscoves DMEM suppleret med 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 pg / ml gentamycin, 50 uM 2-mercaptoethanol, 10% varmeinaktiveret humant AB serum, og 2,5 ng / ml rekombinant human IL-2) til hver brønd i en 96-brønds rundbundet celledyrkningsplade. Hold på is.

4. Isolering af tetramer-mærkede T-celler ved encellede Flowcytometri Sortering

  1. Etablere flowcytometri gating parametre at identificere alloantigen-pMHC tetramer mærkede T-celler (Figur 2.A). Brug pre-berigelse tetramer mærket fraktion at etablere gating strategier til at fjerne dubletter, gate på lymfocytter udelukke CD19 udtrykker B-celler og CD14udtrykker monocytter, og identificere T-celler ved CD5-ekspression. Brug prøven ikke er mærket med tetramer som fluorescens minus en kontrol for at fastslå gating til identifikation af tetramer-bindende T-celler (med 0% af CD5 + CD14 - CD19 - celler fra prøven ikke er mærket af tetramer skal falde inden for denne port) .
    BEMÆRK: gating strategier, der ikke er tilstrækkeligt strenge vil resultere i isolation af ikke-T-celler eller T-celler, der ikke er antigen-specifik, mens alt for restriktive gating strategier vil reducere antallet af T-celler isoleret.
  2. Programmere plade parametre for enkelt celle slags. Ret sorteringsanlæg til at placere 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + celle i hver brønd. Ret pladen sat op til at indeholde 1 negativ kontrol godt (ingen celler sorteres i brønden) og 1 positiv kontrol godt (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - celler) i hver række (figur 2.B
  3. Anvendelse af de etablerede flowcytometri gating strategi og plade setup, isolere individuelle tetramer-bindende T-celler direkte i 96-brønds plade under anvendelse af en flowcytometrisk cellesorteringsapparat.

5. Kultur og Udvidelse af alloantigen-specifikke T-cellekloner

  1. Efter afslutning af cellesortering, centrifuge plade ved 600 xg i 5 minutter ved 20 o C. Sted kultur plade ved 37 ° C i en 6% CO 2-inkubator.
  2. Vortex stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 mikroperler i 30 sek for at resuspendere perlerne.
  3. Beregn mængden af ​​aktivator perler er nødvendige for stimulering af indsamlede T-celler (0,5 pi aktivator mikroperler / brønd). Overfør beregnede mængde stimulatorceller perler til et sterilt 5 ml rør. Tilsæt 1 ml human T-celle dyrkningsmedium og vortex.
  4. Placer røret med mikroperlesuspensionen magnet. Hætten bør være løst oven på røret. Der inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
  5. Fjern forsigtigthætten fra røret. Holder røret og magnet sammen, dekanter indholdet rør ind i en frisk 5 ml rør. Må ikke trykke eller ryste rørets indhold.
  6. Glasset fjernes fra magneten. Tilføj human T-celle dyrkningsmedium (100 pi medium / 0,5 pi mikroperler oprindeligt tilsat).
  7. Portion 100 pi aktivator perlesuspension til hver brønd af 96-brønds plade. Inkuber kulturen plade ved 37 ° C i en 6% CO 2-inkubator.
  8. Overvåg cellevækst dagligt ved mikroskopisk undersøgelse. Små klynger af prolifererende celler kan observeres mikroskopisk efter 5-7 dages dyrkning (Figur 3.A).
    BEMÆRK: Visualisering af T-celle-kulturer på dette tidspunkt kan være svært, og fraværet af observerbare celleklynger på dette stadium ikke nødvendigvis tegn på manglende voksende T-celler.
  9. 14 dage efter celleisolering, foder kulturer ved omhyggeligt at fjerne 100 pi medier ud af toppen af ​​kulturen og erstat med 100 μ; L frisk humant T-celle-dyrkningsmediet. Fortsæt inkubation dyrkningsplade ved 37 ° C i en 6% CO 2-inkubator.
  10. Overvåge cellevækst dagligt ved mikroskopisk undersøgelse og evaluering af farven af ​​dyrkningsmediet. Store celleklynger skal være synlig mikroskopisk 2 - 3 dage efter udskiftning af mediet. Makroskopisk bør cellepellets bliver synlige i løbet af de 14 dage efter udskiftning af mediet.
  11. Efter 28 dage efter celle isolation, identificere voksende kloner ved mikroskopisk undersøgelse. Overfør 200 ul volumen af ​​den vækst-positive 96-brønds plade kulturer til individuelle brønde i en 48-brønds vævskulturplade indeholdende 200 pi human T-celle-dyrkningsmediet.
  12. Tilsættes 100 pi indeholdende 12,5 pi stimulatoriske anti-CD3 / anti-CD28 mikroperler (fremstillet som beskrevet i afsnit 5,2-5,6). Inkuber kulturen plade ved 37 ° C i en 6% CO 2-inkubator.
  13. Overvåg vækst kultur dagligt ved mikroskopisk examinering og evaluering af farven af ​​dyrkningsmediet. Da T-celle kulturen når> 2x10 6 / ml (typisk 3-5 dage efter re-stimulering, kan estimeres ved den dag, at medierne begynder at dreje strågul), overførsel kultur til en brønd i en 24-brønds vævskulturplade og tilsæt 500 ul human T-celle-medium.
  14. Følge på 10-14 dage re-stimulering, indsamle 200 pi T-celle kultur at vurdere allogenantigen specificitet ved flowcytometri analyse af pMHC tetramer binding (ved hjælp af mærkning og gating-strategi beskrevet i punkt 3 og 4.1).

6. Langsigtet Re-stimulering og Kultur af T-celle-kloner

  1. Konstant re-stimulere og udvide klonale T cellekulturer med den ønskede specificitet kan være hver 14 dage. Saml T cellekulturer i en steril 5 ml rør på dag 14 efter den sidste anti-CD3 / CD28 mikroperle stimulation. Kombinere flere brønde i den samme T-celle-klon i et enkelt rør, op til et volumen på 2,5 ml. Tilføj medie til at bringe det endelige volumen til 2,5 ml og bland forsigtigt ved pipettering.
  2. Placer 5 ml rør indeholdende T-celle-kultur i cellen separation magnet til at fjerne gamle mikroperler fra kulturen. Hætten bør være løst oven på røret. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Fjern forsigtigt hætten fra røret. Holder røret og magnet sammen dekanteres cellesuspensionen i en frisk 5 ml rør. Må ikke trykke eller ryste rørets indhold for at fjerne de sidste dråber af væske.
  4. Tilføj medium for at bringe det endelige volumen til 4 ml. Prøve 10 pi at tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
  5. Recover T-celler ved centrifugering ved 600 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
  6. Dekantere supernatant. Resuspender T-celler ved 10 6 celler / ml human T-celle-dyrkningsmediet. Overfør 1 ml aliquoter til hver brønd i en 24-brønds vævskulturplade.
  7. Re-stimulere T-celler ved tilsætning af 100 pi medium indeholdende 12,5 pi stimulerende anti-CD3 / aNTI-CD28 mikroperler (som beskrevet i afsnit 5,2-5,6). Der inkuberes ved 37 ° C i en 6% CO 2-inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver dannelsen af klonal humane T-cellekulturer med defineret alloantigen specificitet via en magnetisk perle berigelse og encellede flowcytometri sortering strategi. Figur 1 giver en oversigt over processen.

Figur 1
Figur 1: Protokol overblik protokollen beskrevet her tilvejebringer en pålidelig metode til generering af alloantigen-specifikke humane T-celle-kloner fra perifert blod.. Processen med enkelt T-celle-isolation og opsætning af cellekultur forventes at tage ca. 4,5 timer. Udvidelse af T-cellekloner kræver flere runder af ikke-specifik T-celle-stimulering og kultur, der hver tager 14 dage. Klonale kulturer kan testes for alloantigen specificitet 28 dage efter isolation, og kulturer kan udvides yderligere til yderligere forsøg ved gentagen rounds for stimulation.

Det forventede udbytte af alloantigen-specifikke T-celler vil afhænge af donor alloantigen brugt, og den tilsvarende hyppighed af reaktive T-celler i donoren. En gennemsnitlig rask donor vil have 4,5-10,0 x 10 6 leukocytter / ml blod, med ca. 20% T-lymfocytter Figur 2 illustrerer resultaterne af måling af bindingen af T-celler fra en HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) -negativ donor til en specifik alloantigen aminosyreresterne 30-48 af HLA-A2 protein (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48), af klasse II-molekyle HLA-DR4 13.

Figur 2
Figur 2: Flowcytometri sortering af alloantigen tetramer-mærkede celler til generering af enkelte cellekulturer. A. Flow cytometrisk identificering og isolering af A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer-mærkede T-celler fra en HLA-DR4-negativ donor. T-celler beriget for tetramer-mærkede celler ved magnetisk perle-selektion, sorteret ved hjælp af flowcytometri, gating på singlet CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + lymfocytter som illustreret. Tetramer-umærket celler blev anvendt som en fluorescens-minus en kontrol for at fastslå gating for tetramer + celler. B. Tetramer + T-celler blev sorteret i en 96-brønds rundbundet vævskulturplade indeholdende 100 pi human T-celle-dyrkningsmediet. Pladen set-up inkluderet positive og negative kontrolbrønde som angivet.

Fra et startnummer på 2,0 x 10 7 leukocytter vi fandt en frekvens på alloantigen-specifikke celler af 1/4776 T-celler:

1.1x10 6 tetramer-berigede celler x 0,992 (slåbrokker) x 0,744 (lymfocytter) x 0,477 (CD5 + CD14 - CD19 -) x 0,0034 (tetramer + T-celler) / 2,0 x10 7 leukocytter fra perifert blod x 0,314 (pre-berigelse CD3 +)

Fra startpunktet 2.0x10 7 leukocytter vi var i stand til at isolere 88 individuelle tetramer-mærkede T-celler til kulturen. Efter 2 runder af anti-CD3 / CD28 mikroperle stimulation og kultur som beskrevet identificerede vi 2 vækst-positive kulturer ved mikroskopisk undersøgelse (repræsentativt eksempel på vækst 10 dage efter enkelt celle isolation og kultur vist i figur 3.A). Klonale kulturer blev ekspanderet til 1 ml, som beskrevet, og alloantigen specificitet blev vurderet ved at undersøge binding af A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer (Figur 3.B).

Figur 3
Figur 3. Evaluering af T-cellekulturer. A. Mikroskopisk undersøgelse af 96-brønds plade T cellekulturer. Repræsentativt eksempel på T-celle-kultur 10dage efter isolering af de enkelte T-celler ved flowcytometri sortering. Celler blev stimuleret med 0,5 pi anti-CD3 / CD28 mikroperler / brønd (eksempler angivet med pilespids) i et volumen på 200 pi human T-celle-dyrkningsmediet. B. T-celle alloantigen specificitet klonale T cellekulturer evalueret ved flowcytometri analyse af pMHC tetramer mærkning. Klonale T cellekulturer af flowcytometri isoleret CD5 + CD14 - CD19 - A2 30-48 / HLA-DR4-tetramer + lymfocytter blev undersøgt for A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer binding efter 4 ugers in vitro kultur. Tetramer-umærket celler blev anvendt som en fluorescens-minus en kontrol for at fastslå gating for tetramer + celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10 g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
  2. Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
  3. Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
  4. Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
  5. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
  6. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  7. Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
  8. Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
  9. Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
  10. Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
  11. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  12. Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  13. Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
  14. Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
  15. Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
  16. Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
  17. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).

Tags

Immunologi T-celle immunologi human cellekultur transplantation flowcytometri alloreactivity
Generation af human alloantigen-specifikke T-celler fra perifert blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jama, B. P., Morris, G. P.… More

Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter