Introduction
לימפוציטים מסוג T הם רכיבים קריטיים של המערכת החיסונית אדפטיבית. תאי T אחראים ללא רק ישירות תיווך תגובות חיסוניים הגנתיות לפתוגנים באמצעות מגוון רחב של מנגנוני מפעיל, אלא גם באופן פעיל שמירה על סובלנות עצמית חיסונית ומכוון את התגובות של תאים אחרים במערכת החיסונית. פונקציות אלה מופנות דרך מספר האותות משולבים, כולל קולטן תא T קשירה (TCR), ציטוקינים וכמוקינים, ומטבוליטים 1. האותות הללו, TCR הוא בעלת חשיבות מיוחדת, כפי שהוא מספק את הספציפיות האופייניות שמגדירה את התפקיד של תאי T בחסינות אדפטיבית. TCR אינטראקציה עם אנטיגנים פפטיד ליניארי שהוצגו על ידי MHC (HLA ortholog אדם) מולקולות (מתחמי pMHC) באופן ספציפי ורגיש מאוד לתת את האותות שליזום פונקצית מפעיל של תאי T. הפרמטרים ביוכימיים של אינטראקציות TCR עם הליגנדים pMHC לספק לא רק את הספציפיות לTהפעלת תא, אלא גם יש לו השפעה איכותית על תפקוד תאי T שלאחר מכן 2. כך, תפקוד התא T לומד לעתים קרובות דורש שבוחן את התגובות של תאי T המשובט עם סגוליות אנטיגני מוגדרות.
התא האנושי T התא, המכיל כ 10 12 תאי T αβ, מכיל 10 7 מוערך - 10 8 αβTCRs שונה 3-4. רפרטואר מגוון זה מספק הזדמנות להכרה במגוון הרחב של פפטידים מפתוגנים פוטנציאליים שיחייב תגובה של תאי T לחסינות. ההערכה היא כי התדירות של תאי T מגיבה לאנטיגן הזר נתון שהוצג על ידי עצמי MHC היא בסדר הגודל של 10 -4 - 10 -7 בהעדר תגובה חיסונית לפני אנטיגן כי 5. הרפרטואר של תאי T הנאיבי מעוצב על ידי בחירת הרתי כדי להבטיח את היכולת לזהות עצמי MHC הצגת אנטיגנים פפטיד ומגבלה להגיבivity נגד אנטיגנים עצמי פפטיד, למקסם את התועלת הפוטנציאלית לתיווכם חסינות 2. עם זאת, בניגוד לזו שנועד תגובתיות, תדירות גבוהה יחסית, 10 -3 - 10 -4, תאי T מאנשים מערכת חיסון נאיביים להגיב לגירוי עם תאים אלוגנאית, הכרת שתי מולקולות MHC הזרות, כמו גם פפטידים אנדוגני שהם מציגים 6. ההכרה של הליגנדים pMHC אלוגנאית דומה מבנית להכרה של אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי עצמי MHC; TCR עושה אינטראקציות ביוכימיים קריטיות עם שתי מולקולת MHC אלוגנאית, כמו גם את הפפטיד מוצג 7. הטבע חזק של התגובה של תאי T לתוצאות גירוי אלוגנאית מהמגוון של pMHC קומפלקסים קיימים על פני השטח של תאים אלוגנאית 8. הערכה היא כי כל MHC מציג כ 2 x 10 4 אנטיגנים פפטיד אנדוגני שונים 9. ב זהreadth של תגובה לגירוי אלוגנאית הוא היבט משמעותי של פתולוגיה הקלינית הרלוונטית, כגון דחיית שתל או שתל לעומת המחלה מארח (GVHD), כתוצאה מalloreactivity תא T.
מחקר של תגובות תא אנושיות T alloreactive הסתמך באופן מסורתי על בחינת תגובות polyclonal של תאי T נאיביים בעקבות גירוי עם תאים אלוגנאית. גירוי חוזר ונשנה עם אותו קו התא אלוגנאית בשילוב עם הגבלת דילול מנתח הוא מסוגל לייצר תאי T משובטים עם הכרה מוגדרת של אלוגנאית HLA 10. עם זאת, גישה זו היא בעייתית לבחינת תגובות לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד, כרפרטואר הרחב והמגוון של pMHC אנדוגני קומפלקסים נוכחי לאלוגנאית נתון HLA מגרה רפרטואר רחב של תאי T. גירוי האוכלוסייה בתפוצה רחבה וגישת דילול מגבילה ידרשו הקרנה של מספר הגדול של שיבוטים לבודד תאי T עם Reacti הרצויvity נגד יגנד pMHC יחיד. בנוסף, התדירות של תאי T מגיבים ליגנד pMHC אלוגנאית בודד היא נמוכה יחסית בקרב אוכלוסיות נאיביות תא T, המציגה מחסום לדור יעיל של שיבוטים תא T אנושיים מגיבים לאנטיגן נתון.
זיהוי ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי מאוכלוסיות polyclonal שהופעלו על ידי הפיתוח של multimers pMHC fluorophore שכותרתו 11. גישה זו משתמשת אנטיגנים פפטיד ספציפיים נטענים לתוך מולקולות מסיסה רקומביננטי biotinylated MHC, שמסומנים על ידי ההיקשרות לfluorophore שכותרתו streptavidin. Multimerization של pMHC מגביר את הלהיטות, מפצה על זיקת מיסוד נמוך (מיקרומטר) של TCR להליגנדים pMHC מסיסים. ניתן לזהות תאים שכותרתו ומבודדים על ידי cytometry זרימה. עם זאת, גישה זו עדיין מוגבלת על ידי התדירות הנמוכה של תאי אנטיגן הספציפי T בין אוכלוסיות תאי T נאיביות, אשר בדרך כללסדרי הגודל פחות מהמגבלה של זיהוי וכימות מדויקים ברוב הזרימה cytometers. כדי לתת מענה למגבלה זו, שיטת תיוג pMHC tetramer והעשרת חרוז מגנטית שלאחר מכן לתאים שכותרתו tetramer פותחה 12. שיטה זו הוכיחה זיהוי אמין, ספירה, ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי בתדירות נמוכה.
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעיל לייצור השיבוטים תא T האנושיים שדווקא מגיבים לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד. הפרוטוקול חל pMHC (HLA) תיוג והעשרת multimer לבידוד של תאי T האנושיים alloantigen הספציפי עם cytometry זרימת תא מיון ושיטה חזקה לתרבות במבחנה של תאי T אנושיים כדי לאפשר ייצור של שיבוטים תא T מהתאים ממוינים אחת ( סקירה באיור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה דורש שימוש בדגימות דם היקפיים ממתנדבים אנושיים. כל המחקר עם בני אדם צריך להיבדק ואושר על ידי דירקטוריון סקירה מוסדית אדם מחקרים כדי להבטיח עמידה בהצהרת הלסינקי (2013) וביטוח בריאות טלטלות הדין והחשבון Act משנת 1996.
1. בידוד של תאי T מדם מלא
- לפני שמתחיל, לחמם את מדיום שיפוע הצפיפות לטמפרטורת חדר. Aliquot 4 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 2-4 15 מיליליטר סטרילי (צינור 1 ישמש לכל 10 מיליליטר נפח כולל של דם מדולל).
- להשיג 10-20 מיליליטר של דם בתרסיס הפרין 1-2 נתרן מצופה (ירוקה עליונה) צינורות איסוף דם ורידים. לאסוף דגימות אנושיות תחת הפיקוח של אנשים מאומנים ובהתאם למועצה לביקורת מוסדית פרוטוקול שאושר.
- נגב את החלק החיצוני של הצינורות עם 70% אתנול. מוציא בזהירות את החלק העליון של fiמלא צינורות איסוף ולמזוג את הדם לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי.
- להוסיף 10 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על צינור אחד איסוף דם. לאסוף את PBS, להוסיף לכל הדם יצק, ומערבבים בעדינות.
- הוסף 25 μl קוקטייל / 2 מיליליטר העשרת תא T האנושי נפח כולל. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
- בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, שכבה של עד 10 מיליליטר של 1: הדם המדולל 1 בעדינות על גבי מדיום שיפוע צפיפות. להיות זהיר כדי לא לשבש את פני השטח של מדיום שיפוע צפיפות.
- דם צנטריפוגה שכבתי ובינוני שיפוע צפיפות של 1,200 XG במשך 20 דקות ב -20 מעלות צלסיוס
- הסר את הצינורות בצנטריפוגה, נזהר שלא לשבש את הממשק בין מדיום שיפוע צפיפות והשכבה של לויקוציטים בממשק שבין מדיום שיפוע צפיפות והפלזמה בדילול מלא. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, לאסוף בזהירות את השכבה לויקוציטים ולהעביר לאמבטית סטרילי חדשה 50 מיליליטר חרוטידואר.
- להוסיף PBS להביא את הנפח של PBL נאסף 50 מ"ל ומערבבים בעדינות.
- צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג.
- Resuspend pelleted תאים בזרימת סטרילי 10 מיליליטר cytometry מיון חיץ (PBS-מסונן סטרילי המכיל 1% BSA). לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 01:10 (להוסיף 90 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer (תשואה צפויה 1 - 4 x 10 6 תאים / צינור של דם מלא).
- הסר aliquot 1 מיליליטר, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאי T לא מסומנים על ידי tetramer. שמור השעיה תא על קרח.
2. העשרה מגנטית של תאי T Alloantigen הספציפיים
- לדלל tetramer pMHC alloantigen עד 1: 100 במאגר מסוג סטרילי.
- השעיה תא צנטריפוגה (9 מיליליטר מצעד 1.11) ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג.
- הוסף 50 μl של דילול alloantigen tetramer pMHC לpelletedתאים (עד 10 7 תאים). מערבבים על ידי pipetting העדין. מעביר צינור 5 מיליליטר סטרילי. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 2 מיליליטר סוג חיץ. צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג.
- תאים גלולים ב100 חיץ סוג μl. הוסף 10 μl קוקטייל יוטין בחירה ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 5 μl חלקיקים מגנטיים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
- להוסיף 2.5 מיליליטר סוג החיץ ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. הסר 100 aliquot μl, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאים טרום-העשרה.
- מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל את ההשעיה התא במגנט הפרדת תאים. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את תוכן הצינור לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור ללהסיר את הטיפות האחרונות של נוזל.
- הסר את הצינור מהמגנט. הוסף 2 מיליליטר חיץ סוג קר ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 1: 2 (להוסיף עד 10 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer.
3. הכנת תאי T לתא בודד מיון תא cytometry הזרימה
- הוסף חוצץ סוג קר לכל הצינורות של תאים (tetramer ללא תווית, מועשר האו"ם, ומועשר שכותרתו tetramer שכותרתו tetramer) כדי להביא את נפח 3 מיליליטר.
- צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים.
- Resuspend תאי pelleted ב -25 חיץ סוג קר μl. הוסף 5 μl בלוק Fc אנושי. לדגור על קרח למשך 20 דקות.
- הכן נוגדנים למיון cytometry הזרימה. מערבבים 15 חיץ μl סוג, 15 μl אנטי-CD5, 15 μl אנטי CD14, ו -15 μl אנטי-CD19.
- הוסף 20 μl של תערובת נוגדנים על צינור אחד של תאים. לדגור על קרח למשך 20 דקות.
- הוסף 2 מיליליטר של חיץ סוג קר על צינור אחד.
- צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים.
- Resuspend תאים בריכוז של x 1 -2 10 6 תאים / מיליליטר במאגר כזה.
- של מדיום תרבות תא האנושי T Aliquot 100 μl (DMEM של Iscove בתוספת 2 מ"מ Glutamax, 10 HEPES מ"מ, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 10% סרום AB אנושי חום מומת, ואדם 2.5 ng / ml רקומביננטי IL-2) היטב בכל צלחת תרבות 96 גם עגולה תא תחתון. שמור על קרח.
4. בידוד של תאי T שכותרתו tetramer ידי תא בודד cytometry זרימת מיון
- להקים cytometry זרימת הפרמטרים gating כדי לזהות תאי tetramer alloantigen-pMHC שכותרתו T (איור 2 א). השתמש בחלק tetramer מראש ההעשרה שכותרתו להקים gating אסטרטגיות לחסל כפילויות, שער על הלימפוציטים, להוציא CD19 להביע תאי B וCD14להביע מונוציטים, ולזהות תאי T על ידי ביטוי CD5. השתמש במדגם לא שכותרתו עם tetramer כקרינת מינוס שליטה מי שיקים את gating לזיהוי תאי T מחייב tetramer (עם 0% מCD5 + CD14 - CD19 - תאים מהמדגם לא מסומן על ידי tetramer צריכים ליפול בתוך השער הזה) .
הערה: gating אסטרטגיות שאינן הולם מחמירים יגרום בידוד של תאים שאינם-T או תאי T שאינם אנטיגן ספציפי, ואילו אסטרטגיות gating מדי מגבילות תפחית את מספר תאי T המבודדים. - לתכנת את הפרמטרים צלחת לסוג התא הבודד. כוון את סדרן למקום 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + תא בכל טוב. כוון את הצלחת להגדיר להכיל בקרה 1 שלילית גם (לא תאים ממוינים לתוך הבאר) ו -1 ביקורת חיובית גם (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - תאים) בכל שורה (איור 2.ב
- שימוש בזרימה הוקמה cytometry אסטרטגית gating והתקנת צלחת, בודד תאי T מחייב tetramer בודדים ישירות לתוך הצלחת 96-היטב באמצעות סדרן תא cytometric זרימה.
5. תרבות והרחבת שיבוטים תא T Alloantigen ספציפי
- לאחר השלמת מיון תא, צלחת צנטריפוגות ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס צלחת מקום התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור.
- microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי מערבולת למשך 30 שניות כדי resuspend חרוזים.
- לחשב נפח של חרוזים activator הנדרשים לגירוי של תאי T שנאספו (0.5 μl של microbeads activator / טוב). העבר את הנפח מחושב של חרוזים ממריץ לצינור 5 מיליליטר סטרילי. הוסף 1 מיליליטר בינוני אנושי תא T תרבות ומערבולת.
- הנח צינור עם תליוני microbead במגנט. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת חדר.
- להסיר בעדינותהכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט יחד, תוכן צינור למזוג לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור.
- הסר את הצינור מהמגנט. הוסף בינוני תרבית תאים אנושית T (100 בינוני μl / 0.5 μl של microbeads בתחילה הוסיף).
- Aliquot של השעיה חרוז activator 100 μl היטב בכל הצלחת 96-היטב. דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור.
- צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה מיקרוסקופית. אשכולות קטנים של תאים מתרבים אפשר לראות במיקרוסקופ לאחר 5 - 7 ימים של התרבות (איור 3.A).
הערה: ויזואליזציה של תרביות תאי T בשלב זה יכול להיות קשה, והעדרו של צבירי תאים נצפים בשלב זה לא יכול להיות אינדיקציה לחוסר בתא T גדל. - בגיל 14 ימים לאחר בידוד תא, תרבויות הזנה על ידי הסרת זהירות של תקשורת 100 μl הנחה של חלקו העליון של התרבות ולהחליף עם 100 μ; בינוני טרי l T האנושי תרבית תאים. המשך דוגרים צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור.
- צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה והערכה של הצבע של מדיום התרבות מיקרוסקופית. צבירי תאים גדולים צריכים להיות גלויים מיקרוסקופי 2 - 3 ימים לאחר השינוי הבינוני. Macroscopically, כדורי תא צריכים להיות גלויים במהלך 14 הימים שלאחר השינוי הבינוני.
- בגיל 28 ימים שלאחר בידוד תא, לזהות שיבוטים גדלו בבדיקה מיקרוסקופית. העבר את 200 μl הנפח של תרבויות צלחת 96-היטב צמיחה חיובית לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמת 48-היטב המכילה 200 מדיום תרבות תא μl אנושי T.
- הוספת 100 μl מכיל 12.5 μl של microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי (שהוכן כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור.
- לפקח על צמיחת התרבות יומית על ידי לשעבר מיקרוסקופיamination והערכה של הצבע של מדיום התרבות. כאשר תרבית תאי T מגיעה> 2x10 מיליליטר 6 / (בדרך כלל 3-5 ימים לאחר מחדש גירוי, יכול להיות מוערך על ידי ביום שהתקשורת מתחילה להפוך קש צהוב), תרבות העברה גם צלחת תרבות 24 גם רקמה ולהוסיף 500 מדיום סלולארי μl אנושי T.
- ב10-14 ימי מעקב מחדש גירוי, לאסוף 200 μl של תרבית תאי T להעריך alloantigen ספציפי על ידי cytometry זרימת ניתוח tetramer pMHC מחייב (באמצעות אסטרטגית התיוג וgating המתוארת בסעיפי 3 ו 4.1).
6. לטווח ארוך מחדש גירוי והתרבות של שיבוטים תא T
- ללא הרף מחדש לעורר ולהרחיב תרביות תאי T משובטים עם סגוליות הרצויות יכול להיות בכל 14 ימים. לאסוף תרביות תאי T לתוך צינור 5 מיליליטר סטרילי ביום 14 הבא גירוי microbead אנטי CD3 / CD28 האחרון. לשלב בארות מרובות של אותו שיבוט תאי T בצינור אחד, עד נפח של 2.5 מיליליטר. הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי של 2.5 מ"ל ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.
- מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל תרבית תאי T לתוך מגנט הפרדת תא כדי להסיר microbeads הישן מהתרבות. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את ההשעיה התא לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור כדי להסיר את הטיפות האחרונות של נוזל.
- הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי 4 מיליליטר. לדוגמא 10 μl לספור תאים באמצעות hemocytometer.
- לשחזר תאי T על ידי צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- supernatant למזוג. תאי Resuspend T ב 10 6 תאים / בינוני תרבית תאי T האנושי מיליליטר. העברת 1 מיליליטר aliquots היטב בכל צלחת תרבית רקמת 24 גם.
- מחדש לעורר תאי T על ידי הוספת 100 מדיה μl מכילה 12.5 μl של אנטי CD3 / גירויmicrobeads NTI-CD28 (כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב-6% CO 2 באינקובטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרביות תאי T אנושיות משובט עם מוגדר alloantigen ספציפי באמצעות העשרה מגנטית חרוז וזרימת תא בודד cytometry מיון אסטרטגיה. איור 1 מספק קווי המתאר של התהליך.
איור 1: סקירת פרוטוקול הפרוטוקול מתואר כאן מספק שיטה אמינה לייצור של שיבוטים של תאי T האנושיים alloantigen ספציפי מהדם היקפי.. התהליך של בידוד תא T בודד והקמת תא התרבות צפוי להימשך כ -4.5 שעות. הרחבת השיבוטים תא T דורשת מספר סיבובים של גירוי לא ספציפי של תאי T והתרבות, כל 14 ימים לוקחים. תרבויות משובטים יכולות להיבדק על הספציפיות alloantigen 28 ימים לאחר הבידוד, ותרבויות ניתן להרחיב עוד יותר לבדיקה נוספת על ידי roun חוזר ונשנהDS של גירוי.
התשואה הצפויה של תאי T alloantigen הספציפי תהיה תלויה בתורם, alloantigen משמש, והתדירות המתאימה של תאי T מגיבים בתורם. תורם בריא ממוצע יהיה 4.5-10.0 x 10 6 לויקוציטים / מיליליטר של דם, עם לימפוציטים מסוג T כ -20% איור 2 מדגים את התוצאות של מדידה המחייבת של תאי T מHLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. תורם) -שלילי לalloantigen ספציפי, שאריות חומצת אמינו 30-48 של חלבון HLA-A2 (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48) שהוצג על ידי הכיתה השנייה המולקולה HLA-DR4 13.
איור 2: Cytometry זרימת המיון של alloantigen שכותרתו תאי tetramer ליצירת תרביות תאים בודדות. זיהוי א תזרים cytometric ובידוד של 30-48 / tetrame HLA-A2 DR4r-שכותרתו תאי T מתורם HLA-DR4-שלילי. תאי T מועשרים בתאים שכותרתו tetramer ידי בחירת חרוז מגנטית מסודרים על ידי cytometry זרימה, gating על גופיית CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + לימפוציטים כפי שמודגם. תאים-ללא תווית tetramer שמשו מינוס הקרינה שליטה מי שיקים gating לתאי tetramer +. תאי B. tetramer + T מוינו לתוך צלחת תרבית רקמת 96, גם מסביב לתחתית המכילה 100 מדיום תרבות תא T האנושי μl. הגדרת הצלחת כללה בארות בקרה חיוביות ושליליות כפי שצוינה.
ממספר ההתחלתי של 2.0 x 10 7 לויקוציטים מצאנו תדירות של תאי alloantigen הספציפי של 1/4776 תאי T:
1.1x10 6 תאים מועשרים tetramer x 0.992 (singlets) x 0.744 (לימפוציטים) x 0.477 (CD5 + CD14 - CD19 -) x 0.0034 (+ תאי T tetramer) / 2.0 x10 7 לויקוציטים דם ההיקפי x 0.314 (לפני ההעשרה CD3 +)
מ7 לויקוציטים 2.0x10 מתחיל הצלחנו לבודד את 88 תאי T שכותרתו tetramer פרט לתרבות. לאחר 2 סיבובים של גירוי microbead אנטי CD3 / CD28 ותרבות כפי שתואר זיהינו 2 תרבויות צמיחה חיובית בבדיקה מיקרוסקופית (דוגמא מייצגת של צמיחה 10 ימים לאחר בידוד תא בודד ותרבות שמוצג באיור 3.A). תרבויות משובטים הורחבו ל 1 מיליליטר כפי שתוארו, וספציפיות alloantigen הוערכה על ידי בחינה מחייבת של A2 30-48 / tetramer HLA-DR4 (איור 3 ').
איור 3. הערכה של תרביות תאי T. בדיקה מיקרוסקופית א של תרביות תאי T 96-גם צלחת. דוגמא מייצגת של תרבית תאי T 10ימים לאחר הבידוד של תאי T מסוימים על-ידי זרימת cytometry מיון. תאים היו מגורה עם microbeads 0.5 μl אנטי CD3 / CD28 / טוב (דוגמאות שצוין על ידי ראש חץ) בהיקף של 200 מדיום תרבות תא T האנושי μl. סגוליות alloantigen תא B. T של תרביות תאים משובטים T הוערכו על ידי ניתוח תזרים cytometry של pMHC תיוג tetramer. תרביות תאי T משובטים של זרימת cytometry CD5 מבודד + CD14 - CD19 - A2 30-48 / ימפוציטים tetramer + HLA-DR4 נבדקו לA2 30-48 / tetramer HLA-DR4 מחייב לאחר 4 שבועות של תרבות במבחנה. תאים-ללא תווית tetramer שמשו מינוס הקרינה שליטה מי שיקים gating לתאי tetramer +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
