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Immunology and Infection

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52257
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pathology, University of California, San Diego

Introduction

T 림프구는 적응 면역 시스템의 중요한 구성 요소입니다. T 세포뿐만 아니라 직접 효과기 메카니즘을 통해 다양한 병원균에 보호 면역 반응을 매개 할뿐만 아니라 적극적으로 자기 면역 관용을 유지하고 면역 체계에서 다른 세포의 반응을 지시 할 책임이있다. 이러한 함수는 T 세포 수용체 (TCR) 결찰, 사이토 카인 및 케모카인, 및 대사 산물 일 포함한 집적 신호의 숫자를 통해 지향된다. 이 적응 면역으로 T 세포의 역할을 정의하는 특성 특이성을 제공하기 때문에 이러한 신호 중, TCR은 특히 중요하다. TCR은 T 세포의 이펙터 기능을 시작하는 신호를 제공하기 위해 민감도와 특이도가 매우 높은 방식으로 MHC (인간의 ortholog의 HLA) 분자 (pMHC 단지)에 의해 제시 선형 펩티드 항원과 상호 작용한다. pMHC 리간드와 TCR 상호 작용의 생화학 매개 변수 T에 대한 특이성뿐만 아니라 제공세포 활성화는 또한 후속하는 T 세포의 기능 (2)에 정 성적 영향을 미친다. 따라서 공부 T 세포의 기능은 종종 정의 항원 특이성 T 세포 클론의 응답을 검사하는 요구한다.

10 8 별개 αβTCRs 3-4 - 약 10 12 αβ의 T 세포를 함유하는 인간 T 세포 구획, 추정 된 107를 포함한다. 이 다양한 레퍼토리 보호 면역에 대한 T 세포 반응을 필요로 할 가능성이 병원균에서 펩타이드의 광대 한 배열의 인식을위한 기회를 제공한다. 그 항원 5 종래 면역 반응의 부재 10-7 - 이는 자기 MHC 제시 주어진 외래 항원에 대한 T 세포 응답의 주파수는 10-4 정도이다 것으로 추정된다. 나이브 T 세포 레퍼토리는 펩티드 항원 및 한계 반응 제시 자기 MHC 인식하는 능력을 보장하기 위해 흉선 선택에 의해 형성된다자기 항원에 대한 펩타이드의 ivity 보호 면역성이 중개 용 잠재 성을 극대화. 이 위반 반응성, 비교적 큰 주파수, 10-3 설계에서 그러나, - 면역 나이브 개체로부터 T 세포 10-4을, 외국인 MHC 분자뿐만 아니라 그들이 제시 내인성 펩티드를 모두 인식 동종 세포 자극에 반응 6. 동종 pMHC 리간드의 인식은 자기 MHC 제시 외국 항원의 인식과 구조적으로 유사하다; TCR은 동종 MHC 분자뿐만 아니라 펩티드 제시 7 모두 중요한 생화학 적 상호 작용을한다. pMHC의 다양성으로부터 동종 자극의 결과로 T 세포 반응의 강력한 특성상 동종 세포 (8)의 표면에 존재하는 복합체. 이것은 각각의 MHC 약 2 × 4 다른 내인성 펩티드 항원 제시 9 것으로 추정된다. 이 B동종 자극에 대한 응답의 readth은 T 세포 alloreactivity 인한, 이러한 숙주 질환 (GVHD) 대 동종 이식 거부 반응 또는 이식편과 같은 임상 적으로 관련 병리학의 중요한 측면이다.

인간 T 세포 alloreactive 반응 연구는 전통적으로 동종 세포 자극 이후 나이브 T 세포의 클론 반응 검사에 의존하고있다. 한계 희석 조합 같은 동종 세포주 반복 자극은 동종의 HLA (10)의 정의와 인식 클론 T 세포를 생성 할 수있다 분석한다. 내인성 pMHC의 크고 다양한 HLA 레퍼토리는 T 세포의 광범위한 레퍼토리를 자극 주어​​진 동종위한 본 복합체 그러나,이 접근법은, 개별 pMHC 동종 리간드에 대한 반응을 검사하는 문제가있다. 이 벌크 인구 자극 제한 희석 방법은 원하는를 Reacti와 T 세포를 분리하기 위해 다수의 클론의 스크리닝을 필요하나의 pMHC 리간드에 대한 vity. 또한, 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 T 세포의 빈도는 소정의 항원에 응답하여 인간 T 세포 클론의 효율적인 생성에 대한 장벽을 제공 나이브 T 세포 집단 중에서 비교적 낮다.

식별 및 클론 집단에서 항원 특이 적 T 세포의 분리는 형광 표지 된 pMHC의 다량 체 (11)의 현상에 의해 활성화되었습니다. 이 접근 방법은 스트렙 타비 딘 - 표지 된 형광 물질에 결합함으로써 표시되어 재조합 가용성 바이오틴 MHC 분자에로드 특정 펩타이드 항원을 이용한다. pMHC의 Multimerization 수용성 pMHC 리간드 TCR의 본질적 낮은 (μM)의 친 화성을 보상 결합력을 증가시킨다. 표지 된 세포를 식별하고 유동 세포 계측법에 의해 단리 할 수​​있다. 그러나,이 접근은 아직 일반적이다 나이브 T 세포 집단 중 항원 특이 적 T 세포의 낮은 주파수에 의해 제한된다대부분의 유동 세포 계측기에 대한 정확한 확인 및 정량 한계 이하의 크기 순서. 이러한 한계를 해결하기 위해, 테트라 - 표지 된 세포 pMHC 량체 라벨 및 후속 자성 비드 농축 방법 (12)을 개발되었다. 이 방법은 신뢰할 수있는 검출, 열거 및 저주파수 항원 특이 적 T 세포의 분리를 보여 주었다.

이 프로토콜은 특별히 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 인간 T 세포 클론의 생성을위한 유효 프로토콜을 설명한다. 프로토콜은 단일 정렬 세포로부터 T 세포 클론의 생산 (활성화 세포 분류 유세포 인간 T 세포의 생체 외 배양을위한 견고한 방법 alloantigen 특정 인간 T 세포의 분리를 위해 합체 라벨링 및 농축 pMHC (HLA)을 적용 그림 1의 개요).

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Protocol

참고 :이 프로토콜은 인간의 자원 봉사자 말초 혈액 샘플의 사용이 필요합니다. 인간을 대상으로 모든 연구를 검토하고 헬싱키 선언 (2013)과 건강 보험 양도 및 1996 년 책임에 관한 법안을 준수하기 위해 인간 연구 윤리 심의위원회의 승인을 받아야한다.

전혈에서 T 세포의 분리 1.

  1. 시작에 앞서, 실온 밀도 구배 매질을 따뜻하게. 나누어 2-4 멸균 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 밀도 구배 배지 4 ㎖ (1 관 각각 10 ml의 희석 된 혈액의 총량에 대해 사용된다).
  2. 1-2 나트륨 헤파린 스프레이 혈액의 10 ~ 20 ml의 코팅 (녹색 위) 정맥 혈액 수집 튜브를 얻습니다. 교육을받은 사람의 감독하에 인간의 표본을 수집하고 심사위원회 (Institutional Review Board)에 따라 프로토콜을 승인했다.
  3. 70 % 에탄올로 튜브의 외부를 닦으십시오. 조심스럽게 Fi의 꼭대기를 제거수집 튜브를 채워하고 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 혈액을 가만히 따르다.
  4. 각각의 혈액 수집 튜브에 10 ㎖의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 첨가. , PBS를 수집 경사 전체 혈액에 넣어 천천히 섞는다.
  5. 25 μL 인간 T 세포 농축 칵테일 / 2 ml의 전체 볼륨을 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션.
  6. 부드럽게 밀도 구배 배지 위에 한 혈액 희석 : 10 ㎖를 피펫을 사용하여, (1) 10 ㎖까지 층. 밀도 기울기 매체의 표면을 방해하지 않도록주의하십시오.
  7. 20 오 C. 원심 분리기 계층화 혈액 및 밀도 구배 매체를 20 분 동안 1,200 XG에
  8. 밀도 구배 매질 및 밀도 구배 매체 희석 플라즈마 사이의 계면에서 백혈구의 층 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하면서, 원심 분리기에서 튜브를 제거한다. 5 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 백혈구 층을 수집하고 새로운 무균 50 ㎖ 원뿔형 욕조로 전송할전자.
  9. 50ml로 수집 된 PBL의 볼륨을 가지고 부드럽게 섞어 PBS를 추가합니다.
  10. 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다.
  11. 이 재현 탁 완충액 (PBS 멸균 여과는 1 % BSA 함유) 정렬 계측법 10 ㎖의 멸균 유동 세포를 펠렛 화. 샘플 세포 현탁액 10 μL, 1:10 희석는 혈구 세포를 사용하는 계산 트리 판 블루 (90 μL에 추가) (예상 수익률을 1-4 × 10 6 세포 전체 혈액의 / 튜브).
    1. 5 ML 튜브로 전송, 1 ml의 나누어지는 제거, 사량으로 표시하지 T 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.

Alloantigen 특정 T 세포의 2 마그네틱 심화

  1. 1 alloantigen pMHC의 사량을 희석 : (100)를 멸균 종류의 버퍼에.
  2. 원심 분리기에서 세포 현탁액 20 오 C.에서 5 분 동안 600 XG에 (단계 1.11 9 ml) 중 가만히 따르다.
  3. 펠렛에 pMHC 량체 alloantigen 희석의 50 μl를 추가세포 (10 7 세포까지). 부드러운 피펫 팅으로 섞는다. 멸균 5 ML 튜브로 전송합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
  4. 일종의 버퍼 2 ML을 추가합니다. 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다.
  5. 100 μL 종류의 버퍼에 재현 탁 세포. 10 μL 비오틴 선택 칵테일을 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다.
  6. 5 ㎕의 자성 나노 입자를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다.
  7. 2.5 ml의 정렬 버퍼와 피펫으로 부드럽게 혼합 추가합니다. 5 ML 튜브로 전송, 100 μL 나누어지는 제거 및 사전 농축 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오.
  8. 세포 분리 자석에 세포 현탁액을 함유하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
  9. 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브로 튜브의 내용을 가만히 따르다. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오액체의 마지막 방울을 제거합니다.
  10. 자석에서 튜브를 제거합니다. 2 ml의에게 차가운 종류의 버퍼를 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 이 혈구를 사용하여 세포를 계산하는 트리 판 블루 (10 μL에 추가) : 샘플 세포 현탁액 10 μL은, (1) 희석.

단일 셀 유동 세포 계측법 셀 정렬에 대한 T 세포의 3. 준비

  1. 세포의 모든 튜브에 차가운 종류의 버퍼를 추가 (사량 레이블, 사량 표지 농축 - 유엔, 사량 표지 농축) 3 ㎖에 볼륨을 가지고.
  2. 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다.
  3. 25 μl의 차가운 종류의 버퍼에 펠렛 세포를 재현 탁. 5 μL 인간의 Fc 블록을 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어.
  4. 유동 세포 계측법 정렬에 대한 항체를 준비합니다. 15 μL 정렬 버퍼, 15 μL 안티 CD5, 15 μL 항 CD14, 15 μL 항 CD19를 섞는다.
  5. 세포의 각 튜브에 항체 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어.
  6. 각각의 튜브에 차가운 종류의 버퍼의 2 ML을 추가합니다.
  7. 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다.
  8. 정렬 버퍼에 1~2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁.
  9. 인간 T 세포 배양 배지의 분취 량 100 ㎕를가 (Iscove의 DMEM 2 mM의 루타, 10 mM의 HEPES, 50 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 10 % 열 - 불 활성화 된 인간 AB 혈청, 2.5 NG / ml의 재조합 인간 보충 IL-2)를 96 웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에. 얼음에 보관하십시오.

단일 셀 유동 세포 계측법 정렬하여 테트라 머 표지 T 세포 4. 분리

  1. alloantigen-pMHC 량체 표시된 T 세포 (그림 2.A)를 식별하는 게이팅 매개 변수 유동 세포 계측법을 설정합니다. B 세포와 CD14를 발현하는 CD19를 제외, 림프구에 이중선, 게이트를 제거하는 전략을 게이팅 설정하기 위해 사전 농축 사량 표시된 부분을 사용하여단핵구를 발현하고, CD5 식에 의해 T 세포를 식별. (사량으로 표시하지 샘플에서 세포가이 게이트 내에해야한다 - - CD19 CD5 + CD14의 0 %로) 사량 결합 T 세포의 식별을위한 게이팅을 설정하는 형광으로 사량을 뺀 컨트롤을 표시하지 샘플을 사용 .
    NOTE : 지나치게 제한 게이팅 전략 절연 T 세포의 수를 줄이는 반면, 특정 항원되지 않은 T 세포 또는 T 세포의 분리 될 것이다 충분히 엄격한 아닌 전략을 게이팅.
  2. 단일 세포 종류의 플레이트 매개 변수를 프로그래밍합니다. CD19 - - 각 웰의 사량 + 셀 (1) CD5 + CD14을 배치 할 분류기을 지시. 각 행의 (그림 2.B 잘 (세포 - CD19 - - 사량 100 CD5 + CD14)을 잘 한 음성 대조군 (어떤 세포가 우물에 분류 없음)과 1 개의 긍정적 인 제어를 포함하도록 설정 판을 직접
  3. 게이팅 전략 및 플레이트 셋업 계측법 확립 흐름을 사용하여, 직접 유세포 셀 소터를 사용하여 96 웰 플레이트에 각각의 사량 체 - 결합 T 세포를 분리.

5. 문화 및 Alloantigen 특정 T 세포 클론의 확장

  1. 20 O ℃에서 세포 분류, 5 분 600 XG에 원심 분리기 판의 완료 후 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 개최 배양 플레이트.
  2. 30 초 동안 소용돌이 자극 항 CD3 / 안티 CD28 마이크로 비드는 구슬을 재현 탁합니다.
  3. 수집 된 T 세포의 자극에 필요한 활성제 비드 부피 (활성제 마이크로 비드 / 웰의 0.5 μl를) 계산한다. 멸균 5 ML 튜브에 자극 구슬의 계산 된 볼륨을 전송합니다. 1 ml의에게 인간 T 세포 배양 배지와 소용돌이를 추가합니다.
  4. 자석의 마이크로 비드 서스펜션 튜브를 놓습니다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 2 분 동안 인큐베이션.
  5. 부드럽게 제거튜브의 캡. 신선한 5 ML 튜브에 함께 캔트 튜브의 내용을 튜브와 자석을 들고. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오.
  6. 자석에서 튜브를 제거합니다. 인간 T 세포 배양 배지를 추가 (마이크로 비드 100 ㎕ 매체 / 0.5 μL는 처음에 추가).
  7. 나누어 96 웰 플레이트의 각 웰에 활성제 비드 현탁액 100 ㎕. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어.
  8. 현미경 검사에 의해 매일 세포의 성장을 모니터링합니다. 문화의 7 일 (그림 3.A) - 증식하는 세포의 작은 클러스터는 5 후 현미경으로 관찰 할 수있다.
    NOTE :이 시점에서 T 세포 배양의 시각화가 어려울 수 있으며,이 단계에서 관찰 가능한 셀 클러스터의 부재가 성장하는 T 세포의 결여를 지시하지 않을 수있다.
  9. 세포 격리 후 십사일에서 조심스럽게 문화의 상단 오프 미디어 100 μl를 제거하여 피드 문화 100 μ로 교체고 l 신선한 인간 T 세포 배양 배지. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 배양 계속합니다.
  10. 현미경 검사 및 배지의 색의 평가에 의해 매일 세포 성장을 모니터링. 3 일 매체 변경 후 - 대형 전지 클러스터는 현미경 2 볼 수 있어야합니다. 거시적으로, 세포 펠렛은 매체 변화에 따른 14 일 동안 볼 수있게해야합니다.
  11. 세포 격리를 다음 이십팔일에서 현미경 검사로 성장하는 클론을 식별합니다. 200 μl의 인간 T 세포 배양 배지를 함유하는 48 웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 성장 양성 96- 웰 플레이트의 배양을 200㎕ 부피를 전송합니다.
  12. 항 CD3 자극 / 항 CD28 마이크로 비드 12.5 μl를 함유하는 100 μl를 추가 (- 5.6 섹션 5.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어.
  13. 현미경 전 매일 문화의 성장을 모니터링민화 및 배지의 색의 평가. T 세포 배양은> 2 × 6 / ㎖에 도달 할 때 (일반적 3-5일 재 자극 후, 미디어 시작되는 날에 의해 추정 될 수 지푸라기 황변)를 24- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에, 전사 문화 500 μl의 인간 T 세포 배지를 추가한다.
  14. 10~14일에서 pMHC 량체의 분석 바인딩 (섹션 3, 4.1에 기술 된 라벨 및 게이트 전략을 사용하고 있습니다) 유동 세포 계측법에 의해 alloantigen 특이성을 평가하기 위해 T 세포 배양 200 μl를 수집, 재 자극 따릅니다.

6. 장기 다시 자극 및 문화 T 세포 클론의

  1. 지속적으로 14 일마다 할 수 있습니다 원하는 특이 클론 T 세포 배양을 다시 자극하고 확장합니다. 마지막 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드 자극 다음 14 일에서 멸균 5 ML 튜브에 T 세포 배양를 수집합니다. 2.5 ml의 부피로, 하나의 튜브에서 동일한 T 세포 클론의 여러 웰을 결합. 2.5 ml의에 최종 볼륨을 가져오고 피펫으로 부드럽게 혼합 매체를 추가합니다.
  2. 배양 물로부터 이전 마이크로 비드를 제거하기 위해 세포 분리 자석으로 T​​ 세포 배양을 포함하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
  3. 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브에 세포 현탁액을 가만히 따르다. 누르거나 액체의 마지막 방울을 제거하기 위해 튜브의 내용을 흔들지 마십시오.
  4. 4 ml의 최종 볼륨을 가지고 매체를 추가합니다. 샘플 10 μL은 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
  5. 실온에서 5 분 동안 600 XG에서 원심 분리하여 T 세포 복구.
  6. 가만히 따르다 뜨는. 10 106 세포 / ml의 인간 T 세포 배양 배지에 재현 탁 T 세포. 전송 한 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분취 량.
  7. 자극 항 CD3 / 12.5 μl를 함유하는 100 ㎕의 미디어를 추가하여 T 세포를 자극 재NTI-CD28 마이크로 비드 (- 5.6로 섹션 5.2 참조). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 품어.

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Representative Results

전략 정렬 계측법 자성 비드 농축 및 단일 셀을 통해 유동 특이성 alloantigen 정의와이 프로토콜은 클론 인간 T 세포 배양의 생성을 설명한다. (1)가 처리의 개요를 제공하는 도표.

그림 1
그림 1 : 프로토콜 개요 프로토콜은 여기에 설명 된 말초 혈액에서 alloantigen 특정 인간 T 세포 클론의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다.. 하나의 T 세포의 분리 및 배양 세포를 셋업하는 과정은 약 4.5 시간이 걸릴 것으로 예상된다. T 세포 클론 확장 비특이적 T 세포 자극 배양 각 복용 14 일에 여러 라운드를 필요로한다. 클론 문화 이십팔일 차단 후 alloantigen 특이성을 테스트 할 수 있고, 문화는 더 반복 roun에 의한 추가 테스트를 위해 확장 될 수있다자극의 DS.

alloantigen 특정 T 세포의 예상 수율은 도너 사용 alloantigen 및 도너 반응성 T 세포의 해당 주파수에 의존 할 것이다. 평균 건강한 기증자 것이다 4.5-10.0 × 106 백혈구 약 20 % T 림프구와 혈액 / ㎖, 2 * HLA-DR4 (HLA-DRB1에서 04 T 세포의 결합을 측정 한 결과를 도시한다 : 01. 특정 행 alloantigen) -negative 공여체 아미노산 잔기 클래스 II 분자 HLA-DR4 (13)에 의해 제시된 HLA-A2 단백질 (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48)의 30-48.

그림 2
그림 2 : 하나의 세포 배양을 생성 alloantigen 사량 표지 세포를 정렬 유동 세포 계측법. A2 30-48 / HLA-DR4의 tetrame의 A. 유세포 식별 및 분리HLA-DR4 음성 기증자 T 세포를 R 표지. 그림과 같이 사량 + 림프구 - CD19 - 자기 비드 선택에 의해 사량 표지 세포 농축 T 세포는 단일 항 CD5 + CD14에 게이팅, 유동 세포 계측법으로 분류되었다. 테트라 - 표지되지 않은 세포는 테트라 머 + 세포 게이팅 확립 형광 뺀 대조군으로 사용 하였다. B. 테트라 머 + T 세포를 100 μl의 인간 T 세포 배양 배지를 함유하는 96 웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트로 정렬되었다. 나타낸 바와 같이, 플레이트 셋업은 양성 및 음성 대조군 웰을 포함했다.

2.0 × 10 7 백혈구 시작 번호에서 우리 4천7백76분의 1 T 세포의 alloantigen 특정 세포의 빈도를 발견 :

(- CD19 - CD5 + CD14) × 0.0034 (사량 + T 세포) / 2.0 × 1.1 × 6을 사량 풍부한 세포 X 0.992 (단봉)는 0.744 (림프구)가 0.477을 X X10 7 말초 혈액 백혈구 (사전 농축 CD3 +) 0.314을 X

시작 2.0x10 7 백혈구에서 우리는 문화에 대한 88 개인 사량 표지 T 세포를 분리 할 수 있었다. 기술로 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드 자극과 문화의 2 라운드 후 우리는 현미경 검사 (십일 그림 3.A에 표시된 단일 세포 분리 및 배양 후 성장의 대표적인 예)에 의해 2 성장 긍정적 인 문화를 확인했다. 클론 배양 기술로 1 ml를 확대하고, alloantigen 특이성은 A2 30-48 / HLA-DR4의 사량 (그림 3.B)의 결합을 검사하여 평가 하였다.

그림 3
T 세포 배양의 그림 3. 평가. 96- 웰 플레이트 T 세포 배양 A. 현미경 검사. T 세포 배양 (10)의 대표적인 예정렬 유동 세포 계측법에 의한 개별 T 세포의 분리 후 일. 세포를 200 μl의 인간 T 세포 배양 배지의 부피 (화살표로 나타낸 예) / 웰 0.5 ㎕의 항 CD3은 / CD28 마이크로 비드로 자극 하였다. pMHC 분석 유세포 평가 클론 성 T 세포 배양의 B. T 세포 alloantigen 특이성 사량 라벨. CD19 - - 고립 CD5 + CD14 유동 세포 계측법의 클론 T 세포 배양 A2 30-48은 / HLA-DR4 테트라 + 림프구 체외 배양 4 주 후에 바인딩 A2 30-48 / HLA-DR4의 사량 조사 하였다. 테트라 - 표지되지 않은 세포는 테트라 머 + 세포 게이팅 확립 형광 뺀 대조군으로 사용 하였다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10 g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

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References

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면역학 문제 93 T 세포 면역학 인간의 세포 배양 이식 유동 세포 계측법 alloreactivity
말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성
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Jama, B. P., Morris, G. P.… More

Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

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