Introduction
Т-лимфоциты являются важнейшими компонентами адаптивной иммунной системы. Т-клетки ответственны за не только непосредственно опосредовании защитные иммунные ответы к патогенам с помощью различных эффекторных механизмов, но и активно поддерживать иммунологическую аутотолерантность и направляя ответы других клеток в иммунной системе. Эти функции направлены через ряд интегрированных сигналов, в том числе Т-клеточного рецептора (TCR) лигирования, цитокинов и хемокинов, и метаболитов 1. Из этих сигналов, TCR имеет особое значение, так как она обеспечивает характерную специфичность, которая определяет роль Т-клеток в адаптивного иммунитета. TCR взаимодействует с линейными пептидных антигенов, представленных MHC (человек ортолог HLA) молекул (ПКИКЖ комплексов) в специфической и чувствительной манере, чтобы обеспечить сигналы, которые инициируют функцию клеток эффекторных Т. Биохимические параметры TCR взаимодействия с ПКИКЖ лигандов обеспечить не только специфику для Tклеточной активации, но также имеют качественную воздействие на последующее функции Т-клеток 2. Таким образом, изучение функции Т-клеток часто требуется рассмотрении ответов на клоновых Т-клеток с определенной антигенной специфичности.
Человек Т-клеток отсек, содержащий приблизительно 10 12 αβ Т-клеток, содержит примерно 10 7 - 10 8 различных αβTCRs 3-4. Это Разнообразный репертуар предоставляет возможность для признания огромного массива пептидов из потенциальных патогенов, что бы потребовать ответа Т-клеток для защитного иммунитета. Подсчитано, что частота Т-клеток в ответ на заданном чужеродного антигена, представленного себя MHC составляет порядка 10 -4 - 10 -7 при отсутствии предварительного иммунного ответа на этот антиген 5. Наивный Т-клеток репертуар формируется тимуса отбора, чтобы обеспечить способность распознавать собственного MHC представляя пептидные антигены и ограничения реагироватьivity против самостоятельных пептид антигенов, максимизации потенциальной полезности для посреднических защитный иммунитет 2. Тем не менее, в нарушение этого разработана реактивность, относительно большой частоты, 10 -3 - 10 -4, Т-клеток от иммунологически наивных лиц реагировать на стимуляцию с аллогенных клеток, признавая обе иностранные молекулы МНС, а также эндогенные пептиды они представляют 6. Признание аллогенных лигандов ПКИКЖ структурно похож на признании иностранных антигенов, представленных самостоятельной МНС; TCR имеет критические биохимические взаимодействия как с аллогенной молекулы МНС, а также представленного пептидом 7. Прочный характер ответа Т-клеток к аллогенных результатов стимуляции из разнообразия рМНС комплексы, присутствующие на поверхности аллогенных клеток 8. Подсчитано, что каждый представляет МНС примерно 2 х 10 4 различные эндогенные пептидные антигены 9. Это бreadth реакции на аллогенной стимуляции является существенным аспектом клинически соответствующей патологии, такие как отторжение аллотрансплантата или трансплантат против хозяина (РТПХ), в результате Т-клеток аллореактивность.
Изучение человека Т-клеток аллореактивными ответов традиционно полагались на рассмотрении поликлональные ответы наивных Т-клеток после стимуляции аллогенных клеток. Повторные стимуляции с одной и той же линии аллогенных клеток в сочетании с ограниченным разбавлением анализ способен генерировать клоновых Т-клеток с определенной признания аллогенной HLA 10. Тем не менее, этот подход является проблематичным для изучения ответов на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ, как большой и разнообразный репертуар эндогенного рМНС комплексы присутствует при заданном аллогенных HLA стимулирует широкий репертуар Т-клеток. Это возбуждение масса населения и ограничение подход потребует разбавления скрининг большого числа клонов, чтобы изолировать Т-клеток с желаемым реакционномVity против одного ПКИКЖ лиганда. Кроме того, частота Т-клеток, отвечающих на индивидуальной аллогенной ПКИКЖ лиганда является относительно низким среди наивных Т-клеточных популяций, который представляет собой барьер для эффективной генерации клонов Т-клеток человека, реагирующих на данному антигену.
Выявление и изоляция антиген-специфических Т-клеток из поликлональных популяций были включены по развитию флуорофорных меченных ПКИКЖ мультимерами 11. Этот подход использует определенные пептидные антигены загруженные в рекомбинантных растворимых биотинилированных молекул МНС, которые помечены путем связывания с стрептавидин-меченого флуорофора. Мультимеризации рМНС увеличивает алчность, компенсируя неразрывно низкий (мкм) сродства TCR для растворимых лигандов ПКИКЖ. Меченые клетки могут быть идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, этот подход все еще ограничено низкой частоты антиген-специфических Т-клеток среди населения наивных Т-клеток, которые, как правило,порядков меньше, чем предел точной идентификации и количественного определения на большинстве цитометров. Для решения этой ограничение, метод ПКИКЖ тетрамера маркировки и последующего обогащения магнитного бисера для тетрамерных-меченых клеток были разработаны 12. Этот метод показал, надежное обнаружение, перечисление, и выделение низкочастотных антиген-специфических Т-клеток.
Этот протокол описывает эффективный протокол для генерации клонов Т-клеток человека, которые специфически реагируют на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ. Протокол применяется ПКИКЖ (HLA) мультимера маркировки и обогащение для выделения Аллоантиген-специфический Т-клеток человека с проточной цитометрии сортировки клеток и надежный метод для культуры в пробирке человеческих Т-клеток, чтобы обеспечить выпуск клонов Т-клеток из отдельных отсортированных клеток ( Обзор на рисунке 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует использования периферической крови от добровольцев. Все исследования на людях должны быть рассмотрены и одобрены человека исследований Institutional Review Board в целях обеспечения соблюдения Хельсинкской декларации (2013 г.) и о медицинском страховании портативности и подотчетности Закон 1996 года.
1. Выделение Т-клеток из цельной крови
- Перед началом, нагреть градиент плотности среды до комнатной температуры. Алиготе 4 мл в градиенте плотности среды в 2-4 стерильные 15 мл конические пробирки для центрифугирования (1 трубка будет использоваться для каждого 10 мл общий объем разбавленной крови).
- Получить 10-20 мл крови в спрей гепарина 1-2 натрия с покрытием (зеленый-топ) венозные трубки забора крови. Сбор с человеческими образцами под надзором опытных людей, и в соответствии с Экспертным советом институциональных утвержден протокол.
- Протрите внешнюю трубок с 70% этанола. Осторожно снимите верхние части физаполненной сбора трубки и переливать кровь в стерильную 50 мл центрифужную пробирку.
- Добавить 10 мл стерильной фосфатно-буферным раствором (PBS) в каждую пробирку для сбора крови. Соберите PBS, добавить в декантированной цельной крови, и аккуратно перемешать.
- Добавить 25 мкл человеческого Т-клеточного обогащения Коктейль / 2 мл общий объем. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Использование 10 мл пипетки, слоя до 10 мл на 1: 1 разбавленной крови осторожно сверху на градиенте плотности среды. Будьте осторожны, чтобы не нарушить поверхность градиента плотности среды.
- Центрифуга слоистых крови и градиент плотности среда в 1200 мкг в течение 20 мин при 20 о С.
- Удалить труб из центрифуги, заботясь, чтобы не нарушить интерфейс между градиенте плотности среды и слоем лейкоцитов на границе раздела между градиенте плотности среды и разбавленной плазмы. Используя 5 мл пипетки, аккуратно собрать лейкоцитов слой и перейти на новую стерильную 50 мл коническую ваннойе.
- Добавить PBS, чтобы довести объем собранного PBL до 50 мл и осторожно перемешать.
- Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Слейте.
- Ресуспендируют клетки осаждали в 10 мл стерильной проточной цитометрии буфер (стерильно фильтруют ФБР, содержащим 1% BSA) сортировки. Образец 10 мкл клеточной суспензии, разбавленных 1:10 (добавить в избранное 90 мкл) трипановым синим рассчитывать клеток с использованием гемоцитометра (ожидается выход 1 - 4 х 10 6 клеток / трубка из цельной крови).
- Удалить 1 мл аликвоты, трансфер в 5 мл пробирку, и держать на льду для анализа Т-клеток не помеченных тетрамере. Хранить клеточной суспензии на льду.
2. Магнитный Обогащение Аллоантиген-специфических Т-клеток
- Развести аллоантиген ПКИКЖ тетрамером до 1: 100 в стерильном буфере сортировки.
- Центрифуга клеточной суспензии (9 мл из шага 1,11) при 600 х г в течение 5 мин при температуре 20 о С. Слейте.
- Добавить 50 мкл разбавляют аллоантиген ПКИКЖ тетрамере к осаждаликлетки (до 10 7 клеток). Смешать, осторожно пипеткой. Трансфер в стерильную пробирку 5 мл. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 мл рода буфер. Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Слейте.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера сортировки. Добавить 10 мкл Биотин выбор коктейля и выдержать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавить 5 мкл магнитных наночастиц и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2,5 мл рода буфер и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Удалить 100 мкл аликвоты, трансфер в 5 мл пробирку, и держать на льду для анализа клеток предварительно обогащению.
- Поместите 5 мл пробирку, содержащую суспензию клеток в клеточной сепарации магнита. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно снимите крышку с трубы. Держа трубку и магнит вместе, переливать содержимое трубки в чистую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки вудалить последние капли жидкости.
- Извлеките трубку от магнита. Добавить 2 мл холодного буфера сортировки и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Образец 10 мкл клеточной суспензии, разбавленной 1: 2 (добавление 10 мкл) трипановым синим рассчитывать клеток с помощью гемоцитометра.
3. Подготовка Т-клеток для одноклеточные проточной цитометрии сортировки клеток
- Добавить холодного буфера сортировки во все пробирки клеток (тетрамер без маркировки, тетрамер-меченого не-обогащенный, и тетрамер-меченого обогащенный), чтобы довести объем до 3 мл.
- Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и переливать буфера для восстановления клеток.
- Ресуспендируют клетки осаждали в 25 мкл холодного буфера сортировки. Добавить 5 мкл человеческого блок Fc. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
- Подготовка антитела для проточной цитометрии сортировки. Смешайте 15 мкл буфера сортировки, 15 мкл анти-CD5, 15 мкл анти-CD14, и 15 мкл анти-CD19.
- Добавить 20 мкл смеси антител в каждую пробирку клеток. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
- Добавить 2 мл холодного буфера сортировки в каждую пробирку.
- Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и переливать буфера для восстановления клеток.
- Ресуспендируют клеток в концентрации 1 х 10 -2 6 клеток / мл в буфере сортировки.
- Аликвотные 100 мкл человеческой Т-клеточной культуральной среде Игла (DMEM Исков, дополненной 2 мМ GlutaMAX, 10 мМ HEPES, 50 мкг / мл гентамицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 10% инактивированной нагреванием человеческую АВ сыворотки, и 2,5 нг / мл рекомбинантного человеческого ИЛ-2) в каждую лунку 96-луночного культурального планшета круглого дна клетки. Держите на льду.
4. Выделение тетрамере меченных Т-клеток одноклеточными проточной цитометрии Сортировка
- Создание проточной цитометрии параметров литниковых для выявления аллоантиген-ПКИКЖ тетрамере меченых Т-клетки (рис 2.а). Используйте предварительно обогащение тетрамерное помечены фракцию установить гейт стратегии по ликвидации дублеты, ворота на лимфоцитах, исключить CD19 выражения В-клеток и CD14выражая моноциты, и определить Т-клеток путем экспрессии CD5. Используйте образец не помеченный тетрамере как флуоресценции минус одна контроля для установления гейтинг для идентификации тетрамерных связывания Т-клеток (с 0% CD5 + CD14 - CD19 - клетки из образца не помеченного тетрамере должны подпадать эти ворота) ,
Примечание: стробирования стратегий, которые не адекватно жесткими будет приводить к выделению не-Т-клеток или Т-клеток, которые не антиген-специфических, в то время как чрезмерно ограничивающие стратегии стробирования будет уменьшить количество Т-клеток, выделенных. - Программирование параметров пластина для одного вида клеток. Направьте сортировщик для размещения 1 CD5 + CD14 - CD19 - тетрамер + ячейку в каждую лунку. Направьте тарелку настроить, чтобы содержать 1 отрицательного контроля (клетки не сортируются в колодец) и 1 положительный контроль хорошо (100 CD5 + CD14 - CD19 - Тетрамер - клетки) в каждой строке (Рисунок 2.Тип
- Использование установленную проточной цитометрии стратегии стробирования и установки пластины, выделить индивидуальные тетрамер-связывающий Т-клеток непосредственно в 96-луночный планшет с использованием проточной цитометрии клеточного сортера.
5. Культура и расширение Аллоантиген-специфических клонов Т-клеток
- После завершения сортировки клеток, центрифуги пластины при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Место культуры пластины при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
- Вихревые стимулирующие микросферы анти-CD3 / анти-CD28 в течение 30 сек ресуспендировать бусы.
- Рассчитать объем активатора бусин, необходимых для стимуляции Т-клеток, собранных (0,5 мкл активатора микрогранул / лунку). Передача расчетный объем стимуляторов бусин в стерильную пробирку 5 мл. Добавить 1 мл человеческого среду культивирования Т-клеток и вихрь.
- Поместите трубку с микрогранулами суспензии в магните. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно удалитеколпачок с трубки. Держа трубку и магнит вместе, содержание переливать трубки в чистую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки.
- Извлеките трубку от магнита. Добавить человеческих Т клеточную культуральную среду (100 мкл среды / 0,5 мкл микросфер вначале добавлен).
- Аликвоты по 100 мкл активатор шарик суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета. Выдержите культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
- Монитор роста ежедневно микроскопического исследования клеток. Малые кластеры пролиферирующих клеток можно наблюдать под микроскопом после 5 - 7 дней культивирования (рис 3.а).
Примечание: Визуализация клеточных культурах T в этой точке может быть трудно, и отсутствие наблюдаемых кластеров клеток на этой стадии не может быть показателем отсутствия растущих Т-клеток. - На 14 дней после выделения клеток, кормовые культуры по тщательно удаляя 100 мкл СМИ офф в верхней части культуры и заменить 100 μ; Л свежей человеческой Т-клеток культуральную среду. Продолжить инкубации культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
- Монитор рост ежедневного микроскопическим исследованием и оценки цвета культуральной среды клеток. Большие кластеры клеток должно быть видно под микроскопом 2 - 3 дня после смены среды. Макроскопически клеточные осадки должны стать видимыми в течение 14 дней после смены среды.
- На 28 дней после изоляции клеток, определить растущие клоны под микроскопом. Передача объема 200 мкл роста-положительным 96-луночного планшета культуры в индивидуальных лунках 48-луночного культурального планшета, содержащего 200 мкл человеческого T клеточную культуральную среду.
- Добавить 100 мкл, содержащих 12,5 мкл стимулирующих анти-CD3 / анти-CD28 микрошариков (полученного, как описано в разделах 5.2 - 5.6). Выдержите культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
- Монитор роста ежедневно микроскопического экс культурыаминирование и оценка цвета культуральной среде. Когда Т клеточная культура достигает> 2x10 6 / мл (как правило, через 3-5 дней после повторной стимуляции, может быть оценена с каждым днем, который начинается СМИ поворота соломенно-желтого), трансфер культуру в лунку 24-луночного культурального планшета в и добавить 500 мкл человеческого Т-клеток среду.
- На 10-14 дней следовать повторное возбуждение, собрать 200 мкл Т клеточной культуры для оценки аллоантиген специфику помощью проточной цитометрии анализ ПКИКЖ тетрамере связывания (с помощью маркировки и стробирования стратегии, описанной в разделах 3 и 4.1).
6. Долгосрочная Re-стимуляция и культура клонов Т-клеток
- Непрерывно повторно стимулируют и расширить клоновых культур Т-клеток с требуемой специфичностью могут быть каждые 14 дней. Сбор культуры клеток Т в стерильную пробирку 5 мл на 14-й день после последнего анти-CD3 / CD28 микрогранулами стимуляции. Объединение нескольких скважин из одной и той же клона Т-клеток в одной пробирке, до объема 2,5 мл. Добавить среду довести конечный объем до 2,5 мл и аккуратно перемешать с помощью пипетки.
- Поместите 5 мл пробирку, содержащую культуру Т-клеток в клеточной сепарации магнита для удаления старых микрошарики из культуры. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно снимите крышку с трубы. Держа трубку и магнит вместе, декантируют клеточной суспензии в свежую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки для удаления последних капель жидкости.
- Добавить среду, чтобы довести до конечного объема 4 мл. Образец 10 мкл для подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
- Восстановление Т-клеток путем центрифугирования при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Слить супернатант. Ресуспендируйте Т-клетки на 10 6 клеток / мл клеточной культуральной среды человеческого T. Передача 1 мл аликвоты в каждую лунку тканевого культурального планшета 24-луночного.
- Повторно стимулировать Т-клетки посредством добавления 100 мкл среды, содержащей 12,5 мкл стимулирующего анти-CD3 / аNTI-CD28 микрошарики (как описано в разделах 5.2 - 5.6). Выдержите при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает генерацию культур Т-клеток клональный человека с определяется аллоантиген специфики через обогащения магнитной борта и потока одноклеточного цитометрии сортировки стратегию. Рисунок 1 приводится краткое описание процесса.
Рисунок 1: Обзор Протокол Протокол описано здесь обеспечивает надежный метод для генерации аллоантиген конкретных клонов Т-клеток человеческого из периферической крови.. Процесс выделения одного Т-клеток и создания культуры клеток, как ожидается, займет около 4,5 ч. Расширение клеточных клонов Т требует проведения множества раундов неспецифической стимуляции Т-клеток и культуры, каждый из которых принимает 14 дней. Клональные культуры могут быть проверены на аллоантигена специфики 28 дней после изоляции, и культуры могут быть дополнительно расширены за дополнительного тестирования путем многократного вокруг вас купитьDS стимулирования.
Ожидается выход Аллоантиген-специфических Т-клеток будет зависеть от донора, в аллоантигена используется, и соответствующей частоте реактивных Т-клеток у донора. Средняя здоровый донор будет 4,5 - 10,0 х 10 6 лейкоцитов / мл крови, с примерно 20% Т-лимфоцитов Рисунок 2 иллюстрирует результаты измерения связывание Т-клеток из HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) -отрицательное донором конкретного аллоантигена, аминокислотные остатки 30-48 белка HLA-A2 (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, А2 30-48), представленного класса II молекул HLA-DR4 13.
Рисунок 2: проточной цитометрии сортировки аллоантигена тетрамерных-меченых клеток для создания культур одиночных клеток. А. Цитометрический выявление и изоляция A2 30-48 / HLA-DR4 tetrameR-Т-клетки помечены с HLA-DR4-отрицательного донора. Т-клетки, обогащенные для тетрамерных-меченых клеток путем подбора магнитного борта были отсортированы с помощью проточной цитометрии, гейт на синглетного CD5 + CD14 - CD19 - тетрамере + лимфоцитов, как показано на рисунке. Тетрамера-немеченого клетки использовали в качестве флуоресцентного-минус одна контроля для установления стробирования для тетрамер + клеток. Б. тетрамеров + Т-клетки были отсортированы в 96-луночный с круглым дном планшета для культуры ткани, содержащей 100 мкл культуральной среды клеток человеческой Т. Пластина настройки включены положительные и отрицательные контрольные лунки, как указано.
Из исходного количества 2,0 х 10 7 лейкоцитов мы нашли частоту Аллоантиген конкретных клетках 1/4776 Т-клеток:
1.1x10 6 тетрамерные обогащенного клетки х 0,992 (фуфайки) х 0,744 (лимфоциты) х 0,477 (CD5 + CD14 - CD19 -) X 0,0034 (тетрамерные + Т-клеток) / 2,0 х10 7 лейкоциты периферической крови х 0,314 (предварительно обогащение CD3 +)
Из исходных 2.0x10 7 лейкоцитов мы смогли изолировать 88 индивидуальных тетрамере меченных Т-клетки для культуры. Через 2 раундов анти-CD3 / CD28 микрогранулами стимуляции и культуры, как описано мы определили два роста, положительная культур под микроскопом (типичного примера роста через 10 дней после изоляции одного клеток и культуры, показанной на рисунке 3.а). Клональные культуры были расширены до 1 мл, как описано, и аллоантиген специфичность оценивали путем анализа связывания А2 30-48 / HLA-DR4 тетрамера (рис 3.B).
Рисунок 3. Оценка клеточных культурах Т. А. Микроскопическое исследование плиты культур 96-Т-клеток. Типичный пример T клеточной культуре 10дней после выделения индивидуальных Т-клеток с помощью проточной цитометрии сортировки. Клетки стимулировали 0,5 мкл анти-CD3 / CD28 микрогранул / а (примеры указанных стрелкой) в объеме 200 мкл клеточной культуральной среды человеческих Т. Б. Т-клеток Аллоантиген специфичность клональных культур Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии анализа рМНС Тетрамер маркировки. Клональные Т-клеточные культуры проточной цитометрии изолированных CD5 + CD14 - CD19 - А2 30-48 / HLA-DR4 тетрамерные + лимфоциты были исследованы на А2 30-48 / HLA-DR4 тетрамером связывания после 4 недель культуры в пробирке. Тетрамера-немеченого клетки использовали в качестве флуоресцентного-минус одна контроля для установления стробирования для тетрамер + клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
