Introduction
T-lymfocyter är kritiska komponenter i det adaptiva immunsystemet. T-celler är ansvariga för inte bara direkt medla skyddande immunsvar mot patogener genom olika effektormekanismer, utan också aktivt upprätthålla immunologisk själv tolerans och rikta svaren från andra celler i immunsystemet. Dessa funktioner är riktade genom ett antal av integrerade signaler, inklusive T-cellreceptor (TCR) ligering, cytokiner och kemokiner, och metaboliter 1. Av dessa signaler, är TCR av särskild betydelse, eftersom det ger den karakteristiska specificitet som definierar den T-cell: s roll i adaptiv immunitet. En TCR interagerar med linjära peptidantigener som presenteras av MHC (human ortolog HLA) molekyler (pMHC komplex) på ett mycket specifikt och känsligt sätt att ge de signaler som initierar T-cells effektorfunktionen. De biokemiska parametrar för TCR interaktioner med pMHC ligander ger inte bara specificitet för Tcellsaktivering, men har också en kvalitativ inverkan på efterföljande T-cellsfunktion 2. Således måste studera T-cellsfunktion ofta granska svaren från klonade T-celler med definierad antigenspecificitet.
Den humana T-cell fack, innehållande ungefär 10 12 αβ T-celler, innehåller uppskattningsvis 10 juli - 10 augusti distinkta αβTCRs 3-4. Denna mångsidiga repertoar ger möjlighet till erkännande av den stora förekomsten av peptider från potentiella patogener som skulle kräva en T-cellsvar för skyddande immunitet. Det uppskattas att frekvensen av T-celler svarar på en given främmande antigen presenteras av själv MHC är i storleksordningen 10 -4 - 10 -7 i avsaknad av tidigare immunsvar mot detta antigen 5. Den naiva T-cellsrepertoar formas av tymisk val för att säkerställa förmågan att känna igen egna MHC presenterar peptidantigener och begränsa reagerarivity mot självpeptidantigener, maximera den potentiella nyttan för förmedling av skyddande immunitet 2. Men i strid med detta utformade reaktivitet, en relativt stor frekvens, 10 -3 - 10 -4, av T-celler från immunologiskt naiva individer svarar på stimulering med allogena celler, erkänner både de utländska MHC-molekyler samt de endogena peptider de utgör 6. Erkännandet av allogena pMHC ligander liknar strukturellt erkännande av främmande antigener presenteras av själv-MHC; TCR gör viktiga biokemiska interaktioner med både allogen MHC-molekylen och den presenterade peptiden 7. Den robusta natur svaret av T-celler av allogen stimulering resultat från olika pMHC komplex på ytan av allogena celler 8. Det beräknas att varje MHC presen ca 2 x 10 4 olika endogena peptidantigener 9. Detta breadth av svar på allogen stimulering är en viktig aspekt av kliniskt relevant patologi, såsom allograftavstötning eller graft versus host disease (GVHD), följd av T-cell alloreaktivitet.
Studie av humana T-cellsalloreaktiva reaktioner har traditionellt åberopas undersöka polyklonala svar naiva T-celler efter stimulering med allogena celler. Upprepad stimulering med samma allogena cellinje kombineras med begränsande utspädning analyser är i stånd att alstra klonala T-celler med definierad erkännande av allogen HLA 10. Dock är denna metod problematisk för att pröva lösningar på enskilda allogena pMHC ligander, som den stora och varierande repertoar av endogen pMHC komplex närvarande för en given allogen HLA stimulerar en bred repertoar av T-celler. Detta bulk befolkningsstimulering och begränsa utspädningen strategi skulle kräva screening av ett stort antal kloner för att isolera T-celler med önskad Reactivitet mot en enda pMHC ligand. Dessutom är frekvensen av T-celler som svarade på en enskild allogen pMHC ligand relativt låg bland naiva T-cellpopulationer, som presenterar en barriär för effektiv generering av humana T-cellkloner som svarar på ett givet antigen.
Identifiering och isolering av antigenspecifika T-celler från polyklonala populationer har aktiverats genom utvecklingen av fluoroformärkta pMHC multimererna 11. Detta tillvägagångssätt utnyttjar specifika peptidantigener som lastas i rekombinanta lösliga biotinylerade MHC-molekyler, som är märkta genom att binda till en streptavidin-märkta fluorofor. Multimerise av pMHC ökar affinitet och kompensera för den egen låg (M) affinitet TCR för lösliga pMHC ligander. Märkta celler kan identifieras och isoleras genom flödescytometri. Emellertid är denna metod fortfarande begränsas av den låga frekvensen av antigenspecifika T-celler hos naiva T-cellpopulationer, vilka typisktstorleksordningar mindre än gränsen för korrekt identifiering och kvantifiering på de flesta flödescytometrar. För att lösa denna begränsning, har en metod för pMHC tetramer märkning och efterföljande magnetiska pärla anrikning för tetramer-märkta celler utvecklats 12. Denna metod har visat pålitlig detektering, uppräkning, och isolering av lågfrekventa antigenspecifika T-celler.
Detta protokoll beskriver ett effektivt protokoll för generering av humana T-cellskloner som specifikt svarar på enskilda allogena pMHC ligander. Protokollet gäller pMHC (HLA) multimer märkning och berikande för isolering av alloantigen specifika humana T-celler med flödescytometri cellsortering och en robust metod för in vitro-odling av humana T-celler för att möjliggöra produktion av T-cellkloner från enstaka sorterade celler ( översikten i figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll kräver användning av perifert blod från frivilliga försökspersoner. All forskning med mänskliga ämnen bör granskas och godkännas av en Human Studies Institutional Review Board för att säkerställa överensstämmelse med Helsingforsdeklarationen (2013) och Health Insurance Bärbarhet och Accountability Act från 1996.
1. Isolering av T-celler från helblod
- Före start, värm densitetsgradient-medium till rumstemperatur. Alikvotera 4 ml densitetsgradient mediet i 2-4 sterila 15 ml koniska centrifugrör (1 tub kommer att användas för varje 10 ml totala volymen utspädd blod).
- Skaffa 10-20 ml blod i 1-2 natriumheparinsprutbelagda (grön-top) venösa blodprovtagningsrör. Samla prover från människa under övervakning av utbildade personer och enligt en Institutional Review Board godkänt protokoll.
- Torka av utsidan av rören med 70% etanol. Ta försiktigt bort de toppar av filled uppsamlingsrör och dekan blodet i en steril 50 ml centrifugrör.
- Tillsätt 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till varje bloduppsamlingsrör. Samla PBS, lägg till den dekanterade helblod, och blanda försiktigt.
- Lägg 25 | il human T-cell anrikningscocktail / 2 ml total volym. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
- Med användning av en 10 ml pipett, lager upp till 10 ml av den 1: 1 utspädda blodet försiktigt på toppen av densitetsgradient-medium. Var noga med att inte störa ytan av densitetsgradient-medium.
- Centrifugera skiktad blod och densitetsgradient-medium vid 1200 xg under 20 minuter vid 20 ° C.
- Ta bort rören från centrifugen, var noga med att inte störa gränsytan mellan densitetsgradient-medium och skiktet av leukocyter vid gränsytan mellan den densitetsgradient-medium och den utspädda plasman. Med hjälp av en 5 ml pipett försiktigt samla leukocyt skiktet och överför till en ny steril 50 ml koniska tube.
- Lägg PBS för att få volymen av den insamlade PBL till 50 ml och blanda försiktigt.
- Centrifugera vid 600 xg under 5 minuter vid 20 ° C. Dekantera.
- Resuspendera pelleterat celler i 10 ml steril flödescytometri sorteringsbuffert (sterilfiltrerad PBS innehållande 1% BSA). Prov 10 pl cellsuspension, späd 1:10 (lägg till 90 l) trypanblått att räkna celler med hjälp av en hemocytometer (förväntad avkastning 1-4 x 10 6 celler / rör helblod).
- Ta 1 ml alikvot, transfer till 5 ml tub, och hålla på is för analys av T-celler som inte är märkta med tetramer. Håll cellsuspensionen på is.
2. Magnet Anrikning av alloantigenspecifika T-celler
- Späd alloantigen pMHC tetramer till 1: 100 i steril sorteringsbuffert.
- Centrifugera cellsuspensionen (9 ml från steg 1,11) vid 600 xg under 5 min vid 20 ° C. Dekantera.
- Lägg 50 pl utspätt alloantigen pMHC tetramer till pelletceller (upp till 10 7-celler). Blanda genom försiktig pipettering. Överför till en steril 5 ml tub. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 ml sorts buffert. Centrifugera vid 600 xg under 5 minuter vid 20 ° C. Dekantera.
- Resuspendera cellerna i 100 l sorteringsbuffert. Addera 10 pl Biotin Val Cocktail och inkubera under 15 min vid rumstemperatur.
- Lägg 5 pl magnetiska nanopartiklar och inkubera under 10 min vid rumstemperatur.
- Lägg 2,5 ml sorterar buffert och blanda försiktigt genom att pipettera. Ta bort 100 pl alikvot, transfer till 5 ml tub, och hålla på is för analys av pre-anrikning celler.
- Placera 5 ml rör innehållande cellsuspensionen i cellseparationsmagneten. Locket ska vara löst ovanpå röret. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort locket från tuben. Håll röret och magneten tillsammans, häll rörinnehållen i en ny 5 ml tub. Knacka inte eller skaka röret innehåll tillavlägsna de sista dropparna av vätska.
- Ta bort röret från magneten. Tillsätt 2 ml kall sorteringsbuffert och blanda försiktigt genom att pipettera. Prov 10 ul av cellsuspensionen, utspädd 1: 2 (lägg till 10 | il) trypanblått för att räkna celler med användning av en hemocytometer.
3. Beredning av T-celler för encelliga flödescytometri cellsortering
- Tillsätt kallt sorteringsbuffert till alla rör av celler (tetramer omärkt, tetramer-märkt un-anrikad och tetramer-märkt anrikad) för att bringa volymen till 3 ml.
- Centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C och dekantera bufferten för att återvinna cellerna.
- Resuspendera pelleterade cellerna i 25 | il kall sorteringsbuffert. Tillsätt 5 l human Fc blocket. Inkubera på is under 20 min.
- Bereda antikroppar för flödescytometri sortering. Blanda 15 l sorteringsbuffert, 15 pl anti-CD5, 15 pl anti-CD14, och 15 pl anti-CD19.
- Addera 20 pl av antikroppsblandningen till varje rör av celler. Inkubera på is under 20 min.
- Tillsätt 2 ml kall sorteringsbuffert till varje rör.
- Centrifugera vid 600 xg under 5 min vid 4 ° C och dekantera bufferten för att återvinna cellerna.
- Resuspendera cellerna i en koncentration av 1 -2 x 10 6 celler / ml i sorteringsbufferten.
- Alikvota 100 ul av human T-cell-odlingsmedium (Iscoves DMEM kompletterat med 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 | ig / ml gentamycin, 50 pM 2-merkaptoetanol, 10% värmeinaktiverat humant AB-serum, och 2,5 ng / ml rekombinant humant IL-2) till varje brunn i en 96-brunnars rundbottnad cellodlingsplatta. Håll på is.
4. Isolering av tetramer-märkta T-celler genom encelliga flödescytometri Sortering
- Upprätta flödescytometri grind parametrar för att identifiera alloantigen-pMHC tetramer märkta T-celler (Figur 2.a). Använd föranrikning tetramer märkt fraktion att etablera slussning strategier för att eliminera dubbletter, gate på lymfocyter, utesluta CD19 som uttrycker B-celler och CD14uttrycka monocyter, och identifiera T-celler från CD5 uttryck. Använd provet inte är märkt med tetramer som fluorescens minus en kontroll för att fastställa gating för identifiering av tetramer bindande T-celler (med 0% av CD5 + CD14 - CD19 - celler från provet inte är märkt genom tetramer bör falla inom denna grind) .
ANMÄRKNING: Gating strategier som inte är adekvat stringenta kommer att resultera i isolering av icke-T-celler eller T-celler som inte är antigenspecifik, medan alltför restriktiva grindningsstrategier kommer att minska antalet av T-celler som isolerats. - Programmera plåt parametrar för enskild cell sortering. Rikta sorterare att placera 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + celler i varje brunn. Rikta plattan som inrättats för att innehålla 1 negativ kontroll väl (inga celler sorteras i brunnen) och 1 positiva kontrollbrunnen (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - celler) i varje rad (Figur 2 B
- Med hjälp av etablerade flödescytometri grindstrategi och platt setup, isolera enskilda tetramer bindande T-celler direkt in i 96-brunnar med hjälp av en flödescytometrisk cellsorterare.
5. Kultur och Expansion av Alloantigen-specifika T-cellkloner
- Efter fullbordande av cellsortering, centrifugera plattan vid 600 xg under 5 minuter vid 20 ° C. Placera odlingsplatta vid 37 ° C i en 6% CO2 inkubator.
- Vortex stimulerande anti-CD3 / anti-CD28 mikropärlor för 30 sekunder för att resuspendera pärlor.
- Beräkna volymen av aktivator-pärlor som krävs för stimulering av insamlade T-celler (0,5 | il av aktivator-mikropärlor / brunn). Överför beräknade volymen av stimulatorn pärlor till en steril 5 ml tub. Lägg 1 ml humant T-cell-odlingsmedium och vortexa.
- Placera röret med mikrokorn suspension i magneten. Locket ska vara löst ovanpå röret. Inkubera under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bortlocket från tuben. Håll röret och magneten tillsammans, dekantera röret innehåll i ett nytt 5 ml tub. Knacka inte eller skaka rörinnehållen.
- Ta bort röret från magneten. Lägg human T-cell odlingsmedium (100 pl medium / 0,5 pl mikrokorn ursprungligen tillsatta).
- Alikvot 100 pl av aktivator pärlsuspension till varje brunn i 96-brunnsplatta. Inkubera odlingsplatta vid 37 ° C i en 6% CO2 inkubator.
- Övervaka celltillväxt dagligen av mikroskopisk undersökning. Små kluster av prolifererande celler kan observeras mikroskopiskt efter 5-7 dagars odling (Figur 3 A).
OBS: Visualisering av T-cellkulturer vid denna punkt kan vara svårt, och frånvaron av observerbara cellkluster i detta skede kan inte vara indikativ för en brist på växande T-celler. - Vid 14 dagar efter cellisolering, foderodlingar genom att försiktigt avlägsna 100 pl av mediet bort från den övre delen av kulturen och ersätt med 100 μ; L färsk human T-cell-odlingsmedium. Fortsätta att inkubera odlingsplatta vid 37 ° C i en 6% CO2 inkubator.
- Övervaka celltillväxt dagligen genom mikroskopisk undersökning och utvärdering av färgen på odlingsmediet. Stora cellkluster bör synas mikroskopiskt 2-3 dagar efter byte av medium. Makroskopiskt bör cellpellets blir synliga under de 14 dagar efter byte av medium.
- Vid 28 dagar efter cellisolering, identifiera växande kloner genom mikroskopisk undersökning. Överför 200 | il volym av tillväxtpositiva 96-brunnars plattkulturer till enskilda brunnar i en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande 200 | il human T-cell-odlingsmedium.
- Addera 100 pl innehållande 12,5 | il av stimulatoriska anti-CD3 / anti-CD28-mikropärlor (framställda såsom beskrivits i avsnitten 5,2-5,6). Inkubera odlingsplatta vid 37 ° C i en 6% CO2 inkubator.
- Övervaka kulturtillväxt dagligen av mikroskopisk examinering och utvärdering av färgen på odlingsmediet. När T cellodling når> 2x10 6 / ml (normalt 3-5 dagar efter återstimulering, kan uppskattas av dagen att media börjar vrida halmgul), överföring kultur till en brunn på en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta och tillsätt 500 | il human-T-cellmedium.
- Vid 10-14 dagar följer re-stimulering, samla 200 l av T-cellkultur för att bedöma alloantigen specificitet genom flödescytometri analys av pMHC tetramer bindning (med hjälp av märkning och grindstrategi som beskrivs i avsnitt 3 och 4.1).
6. Långsiktig Åter stimulans och kultur av T-cellskloner
- Ständigt åter stimulera och expandera klonala T cellkulturer med den önskade specificiteten kan vara var 14 dagar. Samla T-cellkulturer i en steril 5 ml rör på dag 14 efter den sista anti-CD3 / CD28 mikrokorn stimulering. Kombinera flera brunnar i samma T-cellklon i ett enda rör, upp till en volym av 2,5 ml. Lägg mediet att bringa den slutliga volymen till 2,5 ml och blanda försiktigt genom pipettering.
- Placera 5 ml rör innehållande T-cellkultur i cellseparationsmagneten för att avlägsna gamla mikrokulor från kulturen. Locket ska vara löst ovanpå röret. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort locket från tuben. Fasthållning av röret och magneten tillsammans, dekantera cellsuspension i en färsk 5 ml rör. Knacka inte eller skaka rörinnehållen att ta bort de sista dropparna av vätska.
- Lägg mediet att bringa den slutliga volymen till 4 ml. Prov 10 ^ il för att räkna celler med användning av en hemocytometer.
- Recover T-celler genom centrifugering vid 600 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten. Resuspendera T-celler vid 10 6 celler / ml human T-cell-odlingsmedium. Överföring 1 ml alikvoter till varje brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Åter stimulera T-celler genom att tillsätta 100 pl medium innehållande 12,5 pl stimulerande anti-CD3 / aNTI-CD28 mikropärlor (som beskrivs i avsnitt 5,2-5,6). Inkubera vid 37 ° C i en 6% CO2 inkubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver generering av klon humana T-cellkulturer med definierade alloantigen specificitet via en magnetisk pärla anrikning och encelliga flödescytometri sorteringsstrategi. Figur 1 ger en översikt över processen.
Figur 1: Protokoll översikt Protokollet som beskrivs här ger en tillförlitlig metod för generering av alloantigen specifika humana T-cellkloner från perifert blod.. Processen med enstaka T-cell isolering och inrätta cellkulturen beräknas ta ca 4,5 tim. Expansion av de T-cellklonerna kräver flera omgångar av icke-specifik T-cellstimulering och kultur, vardera tar 14 dagar. Klonala kulturer kan testas för alloantigen specificitet 28 dagar efter isolering och kulturer kan utökas ytterligare till ytterligare försök med upprepad rounds av stimulering.
Den förväntade avkastningen på alloantigen-specifika T-celler beror på givaren, den alloantigen som används, och motsvarande förekomst av reaktiva T-celler i givaren. En genomsnittlig frisk givare kommer att ha 4,5 till 10,0 x 10 6 leukocyter / ml blod, varav ca 20% T-lymfocyter Figur 2 illustrerar resultaten av mätning av bindningen av T-celler från en HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) -negativ donator till en specifik alloantigen, aminosyraresterna 30-48 av HLA-A2-protein (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48) presenteras av klass II-molekylen HLA-DR4 13.
Figur 2: Flödescytometri sortering av alloantigen tetramer-märkta celler för att generera enstaka cellkulturer. A. Flödescytometrisk identifiering och isolering av A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer-märkta T-celler från en HLA-DR4-negativ donator. T-celler anrikade på tetramer-märkta celler genom magnetisk pärla val sorterade flödescytometri, gating på sing CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + lymfocyter som bilden visar. Tetramer-omärkta celler användes som en fluorescens-minus en kontroll för att fastställa grindning för tetramer + celler. B. Tetramer + -T-celler sorterades in i en 96-brunnars rundbottnad vävnadsodlingsplatta innehållande 100 | il human-T-cellkulturmedium. Den plåtsammansättningen ingår positiva och negativa kontrollbrunnar som anges.
Ur ett startnummer på 2,0 x 10 7 leukocyter hittade vi en frekvens på alloantigen specifika celler av 1/4776 T-celler:
1,1x10 6 tetramer berikade celler x 0,992 (sing) x 0,744 (lymfocyter) x 0,477 (CD5 + CD14 - CD19 -) x 0,0034 (tetramer + T-celler) / 2,0 x10 7 perifert blod leukocyter x 0,314 (pre-anrikning CD3 +)
Från start 2,0x10 7 leukocyter kunde vi isolera 88 individuella tetramer-märkta T-celler för odling. Efter 2 omgångar av anti-CD3 / CD28 microbead stimulans och kultur som beskrivs vi identifierat två tillväxtpositiva kulturer genom mikroskopisk undersökning (representativt exempel på tillväxt 10 dagar efter en enda cell isolering och odling som visas i figur 3 A). Klonala kulturer utökas till 1 ml som beskrivs, och alloantigen specificitet bedömdes genom att undersöka bindning av A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer (Figur 3 B).
Figur 3. Utvärdering av T-cellkulturer. A. Mikroskopisk undersökning av 96-brunnars platt T-cellkulturer. Representativt exempel på T-cellkultur 10dagar efter isolering av individuella T-celler med flödescytometri sortering. Celler stimulerades med 0,5 | il anti-CD3 / CD28 mikropärlor / brunn (exemplen angivna med pilspets) i en volym av 200 | il human-T-cellkulturmedium. B. T-cell alloantigen specificitet klonala T-cellkulturer som utvärderades genom flödescytometri analys av pMHC tetramer märkning. Klonala T-cellkulturer av flödescytometri isolerade CD5 + CD14 - CD19 - A2 30-48 undersöks / HLA-DR4 tetramer + lymfocyter för A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer bindande efter 4 veckors odling in vitro. Tetramer-omärkta celler användes som en fluorescens-minus en kontroll för att fastställa grindning för tetramer + celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
