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मल्टी और सिंगल सेल आधारित क्षेत्रों assays का उपयोग मानव डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा कोशिकाओं में स्टेम सेल गुणों का मूल्यांकन

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52259
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

Protocol

OVCAR -3 मानव डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा कोशिकाओं के 1. पीढ़ी stably lentiviruses Sox2 विनियामक क्षेत्र रिपोर्टर निर्माण को रोकने के साथ transduced

  1. वर्णित 10,21 के रूप में एक Sox2 विनियामक क्षेत्र पहचानने एक पत्रकार के निर्माण के साथ HEK 293T-पैकेजिंग सेल लाइन transfecting द्वारा lentiviral कणों उत्पन्न करता है।
    नोट: रिपोर्टर आगे का निर्माण आगे tdTomato प्रतिदीप्ति प्रोटीन की ProteoTuner शील्ड प्रणाली की अस्थिरता डोमेन होते हैं। Shield1 जिससे प्रतिदीप्ति प्रोटीन 22 नीचा करने के लिए Proteasome रोकने अस्थिरता डोमेन को बांधता है।
  2. 24 घंटा की एक समय अवधि में lentiviral कणों के साथ OVCAR-तीन कोशिकाओं transduce। बाद में, वायरल सतह पर तैरनेवाला हटाने और पूरा मध्यम में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और सुसंस्कृत के साथ कोशिकाओं को धोने (RPMI 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति, 10% FBS के साथ पूरक)।
  3. 48 घंटा बाद में, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Puromycin संस्कृतियों के लिए जोड़ा गया है और ठीक से transduced कोशिकाओं के चयन की अनुमति के लिए 5 दिनों के लिए बनाए रखा गया।

सेल छँटाई और चढ़ाना 2. तैयारी

  1. 1 पर Shield1 जोड़ें: सेल छँटाई करने के लिए पहले 1000 कमजोर पड़ने 24 घंटा। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में Shield1 उपचार (चित्रा 1) के बिना stably transduced OVCAR-तीन कोशिकाओं का प्रयोग करें। कुप्पी से महाप्राण मीडिया, 3 मिनट के लिए 0.05% trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और trypsinize।
  2. 5 मिनट के लिए - (25 डिग्री सेल्सियस 15) आरटी पर 300 XG पर सेल नंबर, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं की गिनती, (ऊपर देखें) पूरा माध्यम का उपयोग करके ट्रिप्सिन बंद करो।
  3. छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं ध्यान में 0.5-1 एमएल बाँझ पीबीएस।
  4. एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन सेल झरनी टोपी फिल्टर का प्रयोग करें।
  5. मिलीलीटर प्रति 5 लाख कोशिकाओं को सेल गिनती समायोजित करें।
  6. , MEGM वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, और पूरक आहार के साथ पूरक (100 μl के साथ मध्यम अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह प्लेटें क्षेत्रों को तैयारबी-27, heparine सोडियम; या वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, और पूरक आहार, बी -27, के साथ या 1% methylcellulose के अलावा बिना heparine सोडियम के साथ पूरक DMEM / F12) भी 1 टेबल देखें। वैकल्पिक रूप से संभव संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन की एकाग्रता में मध्यम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें।
  7. क्रमबद्ध आरएफपी + और ऊपर से तैयार 96 अच्छी तरह प्लेटों में RFP- कोशिकाओं, अच्छी तरह से प्रति एक सेल (एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों परख) और क्रमशः अच्छी तरह से प्रति 100 कोशिकाओं (बहु सेल आधारित क्षेत्रों परख),। 100 μ नोजल, म्यान दबाव 20 साई, और उपज मुखौटा 0, पवित्रता मुखौटा 32, चरण मुखौटा 16: एकल कोशिका मोड, क्रमबद्ध स्थापना का उपयोग कर (सामग्री देखें) क्रमबद्ध पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल सॉर्टर प्रदर्शन करते हैं।
  8. माइक्रोस्कोप (एकल सेल आधारित परख के लिए) कोशिकाओं से युक्त कुओं रन बनाकर और बहु सेल आधारित परख के लिए (व्यक्तिगत कुओं में सेल नंबर की गणना के द्वारा दक्षता चढ़ाना का आकलन, चित्रा 2
  9. मध्यम क्षेत्रों में मानक की शर्तों के तहत कोशिकाओं को सेते 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (रचना के लिए कदम 2.6 देखें)। दैनिक bFGF (20 एनजी / एमएल) और EGF (20 एनजी / एमएल) अनुपूरक।
  10. एक सप्ताह के बाद, एकीकृत संवाददाता प्रणाली से प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए 4X या 10X बढ़ाई और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग ट्यूमर क्षेत्रों उभरते की संख्या गिनती। "" छोटे क्षेत्रों के रूप में 100 माइक्रोन (चित्रा 3) - एक व्यास 50 के साथ "बड़े" क्षेत्रों के रूप में 100 माइक्रोन से अधिक के एक व्यास के साथ क्षेत्रों, और क्षेत्रों की गणना। आप वास्तविक क्षेत्रों गिनती और समूहों सेल नहीं है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: एकल कोशिका आधारित assays में क्षेत्र के गठन संस्कृति के 10 (7 बनाम) दिनों के बाद microscopically स्कोर करने के लिए आसान है।
  11. आरएफपी + में क्षेत्र के गठन की कोशिकाओं और एकल कोशिका आधारित assays में क्रमशः RFP- कोशिकाओं (प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली) या बहु सेल बीए के अनुपात की गणनाशॉ एट अल द्वारा प्रस्तुत के रूप में SED क्षेत्रों assays के (प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के लिए एक अच्छी तरह से)। 16
    नोट: क्षेत्र बनाने कोशिकाओं (%) = (क्षेत्रों की संख्या) / (वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या) का अनुपात 100 x

क्षेत्रों के 3. सीरियल Passaging

  1. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर एक उपयुक्त बाँझ ट्यूब और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक अच्छी तरह की सामग्री रखें। बहु सेल आधारित क्षेत्रों assays के लिए, एक साथ अच्छी तरह से एक से क्षेत्रों इकट्ठा। पीबीएस और अब सेंट्रीफ्यूज दो मिनट के साथ 5 बार - अच्छी तरह से 3 धो लें। एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के लिए, अलग-अलग क्षेत्रों के लिए इकट्ठा। कारण कोशिकाओं की कम संख्या के लिए, centrifugation और वाशिंग चरणों के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें।
  2. 0.05% trypsin-EDTA के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें।
  3. इष्टतम सेल जुदाई को प्राप्त करने के लिए, एक नरम प्रकार के बरतन में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं। कम कोशिका मृत्यु दर के लिए अपने सेल लाइन के लिए trypsinization के समय का अनुकूलन: कोई बड़ी अगरक्षेत्रों धीरे एक 100 μl विंदुक टिप का उपयोग कर दिखाई दे महीन चुर्ण बनाना है। मामले में बड़े क्षेत्रों, अभी भी मौजूद हैं और 3 मिनट trypsin साथ सेते हैं और फिर विचूर्णन कदम के लिए आगे बढ़ें। एकल के मामले में सेल आधारित assays trypsinization के चरण के दौरान जीवित कोशिकाओं का इष्टतम सेल उपज के लिए समय का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. , ट्रिप्सिन निष्क्रिय एकल कोशिका assays के अतिरिक्त 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के मामले में 10 मिनट के लिए 300 XG पर 500 μl पूरा मध्यम और सेंट्रीफ्यूज जोड़ने के लिए।
  5. क्षेत्रों के माध्यम में ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को निकाल दें।
  6. एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 40 माइक्रोन सेल झरनी टोपी फिल्टर का प्रयोग करें।
  7. आरएफपी + और बहु ​​सेल bassed assays में RFP- कोशिकाओं का उपयोग कर के मामले में, विश्लेषण प्रवाह के माध्यम से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के बाद मेजबान में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करें।
  8. ऊपर विस्तृत रूप में तैयार एकल कक्षों के धारावाहिक replating assays के बीज प्रति अच्छी तरह से एक सेल एक नई अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह से थाली में लिए। एक व्यक्ति के क्षेत्र से, लगभग 20 व्यक्ति कुओं बीज। बहु सेल आधारित प्राथमिक क्षेत्रों के replating assays के लिए, बीज कोशिकाओं को एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में प्राथमिक क्षेत्रों में से एक अच्छी तरह से प्राप्त की है और माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल नंबर अगले दिन गिनती।
  9. कदम 2.11 में वर्णित सूत्र का उपयोग माध्यमिक क्षेत्रों assays में क्षेत्र के गठन की कोशिकाओं के अनुपात का आकलन करें।

4. परीक्षा परिणामो का विश्लेषण

  1. स्वतंत्र triplicates में प्रदर्शन प्रयोगों से परिणामों का विश्लेषण और दो तरफा छात्र के टी-टेस्ट सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सामान्य रूप से वितरित मूल्यों और अन्यथा मान व्हिटनी परीक्षण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।

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Representative Results

पारंपरिक क्षेत्रों assays में, आरएफपी + OVCAR-तीन कोशिकाओं बनाम RFP- कोशिकाओं के 20% के लगभग 40% प्राथमिक क्षेत्रों परख (चित्रा -4 ए) में एक व्यक्ति ट्यूमर क्षेत्र को जन्म दिया है। इसके अलावा, आरएफपी + कोशिकाओं द्वारा गठित क्षेत्रों RFP- कोशिकाओं द्वारा गठित उन लोगों की तुलना में आकार में बड़े थे।

एकल कोशिका आधारित assays में चढ़ाया करते हैं, आरएफपी + कोशिकाओं भी ऊपर दिए गए परिणामों की पुष्टि, RFP- कोशिकाओं की तुलना में अधिक क्षेत्रों का गठन किया। हालांकि, बहु सेल आधारित परख (चित्रा -4 ए, बी) बनाम एकल में चढ़ाया प्रति कम क्षेत्रों की पीढ़ी की दिशा में एक प्रवृत्ति इस परख क्षेत्र के गठन में इस तरह के यांत्रिक क्षेत्र फ्यूजन या हदबंदी के रूप में तकनीकी कलाकृतियों के माध्यम से पक्षपातपूर्ण हो सकता है यह दर्शाता है कि वहां गया था गैर पक्षपाती संस्कृति के माध्यम में।

आगे इन पहलुओं का पता लगाने के लिए, हम क्षेत्रों गठन पर सेल चढ़ाना घनत्व के प्रभाव की तुलना में। हम 96 में अच्छी तरह से प्रति एक सेल करने के लिए 1000 कोशिकाओं से सीमित कमजोर पड़ने का उपयोग कोशिकाओं चढ़ाया-well प्लेटें और उभरते क्षेत्रों की संख्या शुरू में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या पर अत्यधिक निर्भर थे पाया। हैरानी की बात है, क्षेत्रों की अधिक संख्या का प्रदर्शन, MGEM और DMEM / F12 आधारित मीडिया दोनों में चढ़ाया कोशिकाओं की कम संख्या से गिना रहे थे कि इस परख में वास्तव में चढ़ाना तौर तरीकों अत्यधिक पूर्वाग्रह परिणाम (चित्रा 5)। कोशिकाओं DMEM / F12 आधारित क्षेत्रों के लिए 1% methylcellulose जोड़कर immobilized गया जब इसके विपरीत, मध्यम 23,24 क्षेत्र के गठन की दक्षता सेल घनत्व के ज्यादातर स्वतंत्र था।

सीएससी संपत्तियों पर क्षेत्रों संस्कृति की स्थिति के प्रभाव का पता लगाने के लिए, हम क्षेत्रों परख में ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद लाल प्रतिदीप्ति संकेत व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत का विश्लेषण किया। हम वे हैं, सुझाव है कि बहु सेल आधारित क्षेत्रों संस्कृतियों में आरएफपी + क्षेत्रों से कोशिकाओं का लगभग 35% संस्कृति (चित्रा 6A) के सात दिनों के बाद उनके लाल प्रतिदीप्ति संकेत खो पाया कि undergएक भेदभाव, जबकि 65% आत्म नवीकरण क्षमता का सुझाव एक आरएफपी + संकेत बनाए रखा। इसके विपरीत, शुरू में RFP- कोशिकाओं से उत्पन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं वे इन परिस्थितियों में स्टेम सेल संभावित फिर से स्थापित नहीं कर सकते यह दर्शाता है कि आरएफपी नकारात्मक (चित्रा 6A) बने रहे।

एकल कक्षों से उत्पन्न क्षेत्रों पर प्रदर्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एकल क्षेत्रों आरएफपी व्युत्पन्न + RFP- कोशिकाओं से व्युत्पन्न क्षेत्रों रेड सिग्नल के लिए नकारात्मक बनी हुई है, जबकि कोशिकाओं आरएफपी + और RFP- कोशिकाओं दोनों निहित दिखा रहा है कि इन परिणामों की पुष्टि की।

इसी तरह के परिणाम दोनों स्थितियों से replating assays में मनाया गया।

चित्रा 1
चित्रा lentiviral पारगमन, चयन के 1. कार्यप्रवाह और lentiviral पारगमन और के सकारात्मक चयन के बाद। आरएफपी + और ​​RFP- कोशिकाओं की छँटाई puromycin जोखिम, RFP- और आरपीएफ + कोशिकाओं के माध्यम से सफलतापूर्वक transduced कोशिकाओं क्षेत्रों माध्यम में एक 96 अच्छी तरह से थाली के अलग-अलग कुओं में FACS द्वारा हल कर रहे हैं। बहु सेल आधारित क्षेत्रों assays के लिए, 100 कोशिकाओं एक कुएं में रखा जाता है। चढ़ाना दक्षता छंटाई के बाद प्रदर्शन किया माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया है। क्षेत्रों, सात से दस दिनों के बाद माइक्रोस्कोपी द्वारा रन बनाए फ्लो के माध्यम से विश्लेषण किया और माध्यमिक क्षेत्रों में replated एकल कक्षों में अलग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चढ़ाना। सिंगल आरएफपी + और ​​प्रत्येक अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में हल RFP- कोशिकाओं के बाद हल आरएफपी + और ​​RFP- कोशिकाओं की चित्रा 2. इमेजिंग एक (फ्लोरोसेंट) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सही चढ़ाना के लिए विश्लेषण कर रहे हैं।w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
एकल कोशिका आधारित assays में क्षेत्रों के गठन की चित्रा 3. विश्लेषण। क्षेत्रों गठन के सात से दस दिनों के बाद विश्लेषण किया है। (ए) बड़े (व्यास> 100 माइक्रोन) और (बी) छोटे (50 व्यास - 100 माइक्रोन)। क्षेत्रों microscopically आकार के आधार पर प्रतिष्ठित कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
ट्यूमर के चित्रा 4. क्षमता आरएफपी से गठन क्षेत्रों +और RFP- OVCAR-तीन एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के (बी) बनाम बहु (ए) में assayed रूप OVCAR-तीन कोशिकाओं से प्राथमिक और माध्यमिक क्षेत्र दक्षता की एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के बनाम बहु। इसकी तुलना में कोशिकाओं। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 5
चित्रा 5. सेल चढ़ाना घनत्व जोरदार प्रभावों क्षेत्र तरल में प्रदर्शन बहु सेल आधारित क्षेत्रों परख में OVCAR-तीन कोशिकाओं से गिना जाता है लेकिन अलग अलग सेल घनत्व और विकास मीडिया की नहीं methylcellulose पूरक संस्कृतियों में। उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए साहित्य में सूचित किया गया है assays के क्षेत्रों। इनके द्वारा शुरू संभव पूर्वाग्रहों का विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं विभिन्न पर चढ़ाया जाता हैविभिन्न क्षेत्रों संस्कृति मीडिया के 200 μl (MGEM, सभी की खुराक के साथ प्रोटोकॉल अनुभाग, या DMEM / F12 में विस्तृत और 1% methylcellulose युक्त के रूप में सभी की खुराक के साथ DMEM / F12) और क्षेत्र के गठन के सात दिनों के बाद रन बनाए है में NT घनत्व (ए) । DMEM / F12 में चढ़ाना के बाद एक दिन में ले लिया अलग घनत्व पर चढ़ाया कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी चित्र (बी) में दिखाया गया methylcellulose के बिना संस्कृति के माध्यम क्षेत्रों। कम घनत्व प्लेटों में देखा एकल कक्षों के लिए विरोध के रूप में उच्च सेलुलर घनत्व में उभरते सेल समूहों पर ध्यान दें। चित्रों के लिए स्केल बार:। 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
ट्यूमर क्षेत्रों में संकेत आरएफपी + और ​​respectiv से गठित विश्लेषण आरएफपी के 6 चित्राइली RFP- OVCAR-तीन कोशिकाओं (ए) आरएफपी + और ​​RFP- कोशिकाओं से व्युत्पन्न अलग क्षेत्रों में आरएफपी संकेत के लिए cytometry विश्लेषण (बहु सेल आधारित क्षेत्रों परख) प्रवाह। आरएफपी + और ​​RFP- कोशिकाओं (एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों परख) से ली गई क्षेत्रों (बी) माइक्रोस्कोपी विषम आरएफपी आरएफपी से व्युत्पन्न क्षेत्रों में संकेत नहीं बल्कि RFP- कोशिकाओं से पता चलता है। चित्र एकल कोशिका आधारित क्षेत्र assays के लिए पारंपरिक क्षेत्रों और 10 दिन के लिए दिन 7 पर ले जाया गया। आरएफपी + ख्यात सीएससी से व्युत्पन्न क्षेत्रों के बड़े आकार पर ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल स्रोत बेसिक मध्यम की आपूर्ति करता है लेखक
OVCAR -3, Caov -3, प्राथमिक सामग्री MEGM 20 एनजी / एमएल rEGF, 20 एनजी / एमएल bFGF, बी -27, चार माइक्रोग्राम प्रति / एमएल हेपरिन, hydrocortisone, इंसुलिन (SingleQuot किट) Bareiss एट अल।
SKOV3 DMEM / F12 / एमएल इंसुलिन, 10 एनजी / एमएल rEGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 12 एनजी / एमएल LIF, 0.3% बीएसए 5 माइक्रोग्राम प्रति ली मा एट अल।
A2780 DMEM / F12 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 2% बी -27, 0.4% बीएसए Haiwei वैंग एट अल।
SKOV3 DMEM / F12 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 2% बी -27, एक एनजी / एमएल hydrocortisone योंग-रुई दू एट अल।
A2780, प्राथमिक सामग्री DMEM / F12 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 0.4% बीएसए टी जियांग एट अल।
प्राथमिक सामग्री DMEM / F12 > / एमएल इंसुलिन, 10 एनजी / एमएल rEGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 12 एनजी / एमएल LIF, 0.3% बीएसए 5 माइक्रोग्राम प्रति ते लियू एट अल।
एमएलएस DMEM / F12 10 एनजी / एमएल इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 20 एनजी / एमएल bFGF, 2% बी-27 Soritau एट अल।
3AO DMEM / F12 1 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 20 एनजी / एमएल bFGF, 2% बी-27 एमएफ शि एट अल।
प्राथमिक सामग्री DMEM / F12 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 0.4% बीएसए शू झांग एट अल।
प्राथमिक सामग्री EBM-2 या एक्स विवो 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इंसुलिन, 20 एनजी / एमएल rEGF Ilona Kryczek एट अल।
OVCAR -3 MEGM 20 एनजी / एमएल rEGF, 20 एनजी / एमएल bFGF, बी -27, चार माइक्रोग्राम प्रति / एमएल हेपरिन Dongming लिआंग एट अल।
"ontent> पिछली रिपोर्टों में डिम्बग्रंथि क्षेत्रों assays के लिए इस्तेमाल किया अलग सेल स्रोतों (सेल लाइनों और प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ऊतक), मीडिया और खुराक की 1. उदाहरण टेबल।

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Discussion

क्षेत्रों संस्कृतियों कैंसर स्टेम सेल संभावित परख और मानव ट्यूमर कोशिकाओं 15,25,26 की एक विस्तृत श्रृंखला में स्टेम कोशिकाओं की तरह के लिए समृद्ध करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तरीका है। इन संस्कृति शर्तों के तहत, आत्म नवीकरण की क्षमता की कमी है कि कैंसर कोशिकाओं को अलग और अंततः कोशिका मृत्यु से गुजरना करने की उम्मीद कर रहे हैं। वे शुरू में सेल समूहों या विशेष रूप से प्राथमिक assays में भी ट्यूमर क्षेत्रों फार्म का हो सकता है, वे कारण स्वयं renewing गुणों की कमी के धारावाहिक replating पर क्षेत्र बनाने की क्षमता को बनाए रखने में सक्षम नहीं हैं। क्षेत्रों assays के सीएससी की पहचान करने और पूरे ट्यूमर सेल आबादी में उनकी आवृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए सरोगेट assays के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।

हालांकि, पर्याप्त परिवर्तनशीलता अलग प्रकाशित प्रोटोकॉल 5,10,27-35 (तालिका 1) निम्नलिखित क्षेत्रों assays के बीच प्रदर्शन देखा जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम पहले से बी-27 के साथ पूरक MEGM का उपयोग करते हुए मानव डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा कोशिकाओं से क्षेत्र के गठन को प्रकाशित किया है, BFGF, हेपरिन और SingleQuot टीएम (इंसुलिन, rEGF और hydrocortisone युक्त)। कुछ ही बी-27 और rEGF जोड़ने जबकि अन्य प्रयोगशालाओं, पूरे DMEM / F12 मध्यम का उपयोग करें। इस रिपोर्ट में, OVCAR-तीन कोशिकाओं में बहु सेल आधारित क्षेत्रों परख इसलिए अलग शर्तों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। क्षेत्र के गठन में कोई महत्वपूर्ण अंतर इन कोशिकाओं (चित्रा 5A) में मनाया गया सभी की खुराक के साथ MEGM या DMEM / F12 का उपयोग करना। इसके अलावा, कुछ प्रयोगशालाओं EGF और FGF जल्दी से अपमानित हो सकता है कि अनुमान लगाया है और मध्यम करने के लिए दैनिक इन वृद्धि कारकों जोड़ने प्रोटोकॉल की स्थापना की है। इसलिए हम EGF और FGF सेल संस्कृति के लिए दैनिक EGF के अलावा और FGF साथ क्षेत्रों assays के शुरुआत में ही जोड़ा गया है जिसमें एक माध्यम में प्रदर्शन क्षेत्रों assays के तुलना में, और हम OVCAR-तीन कोशिकाओं में बराबर परिणाम इन assays लगता है EGF और FGF साथ महंगी और श्रमसाध्य दैनिक पूरकता हमेशा जरूरी नहीं हो सकता है, सुझाव है कि (डेटा) नहीं दिखाया। इन परिणामों चाहेअन्य डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों या प्राथमिक नमूनों से, या विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं निर्धारित किया जाना बना रहता है।

हालांकि, हम एक और परीक्षण किया चर, सेल चढ़ाना घनत्व द्वारा शुरू रन बनाए क्षेत्रों की संख्या में पर्याप्त पूर्वाग्रह मनाया। कोशिकाओं की कम संख्या क्षेत्रों की अधिक संख्या से पता चला है साथ हैरानी की बात है, कुओं वरीयता प्राप्त। 1% methylcellulose द्वारा सीमित सेल गतिशीलता शुरू में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या पर स्वतंत्र क्षेत्र के गठन, का एक ही दक्षता में हुई। इन परिणामों के सेल clumping और क्षेत्र फ्यूजन या disaggregation क्षेत्र संख्या को संशोधित करने और बहु ​​सेल आधारित क्षेत्रों assays में गलत परिणाम के लिए अग्रणी हो सकता है कि सलाह देते हैं। कोशिकाओं उचित घनत्व पर चढ़ाया जाता है, बहु सेल आधारित assays हालांकि एकल कोशिका आधारित क्षेत्र assays में एकत्र आंकड़ों के बजाय तुलनीय परिणाम (चित्रा 4) के लिए सीसा। आगे इन परिणामों का पता लगाने के लिए हम एकल और बहु ​​सेल आधारित तुलनाएक Sox2 विनियामक क्षेत्र 10 के लिए एक हाल ही में प्रकाशित lentiviral आरएफपी व्यक्त संवाददाता प्रणाली के माध्यम से ख्यात सीएससी में हल डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग assays के। दरअसल, दोनों assays के आरएफपी का बढ़ाया प्राथमिक और माध्यमिक क्षेत्र बनाने की क्षमता की पुष्टि की + RFP- कोशिकाओं बनाम (चित्रा -4 ए, बी)। महत्वपूर्ण बात है, आरएफपी + कोशिकाओं से मनाया क्षेत्रों की अधिक संख्या Sox2 की कि प्रेरण दिखा पिछले परिणामों के साथ कतार में है, जो Sox2 व्यक्त कोशिकाओं के उच्च proliferative क्षमता (नहीं दिखाया डेटा), की वजह से नहीं थे त्वरक के बिना क्षेत्रों गठन और विवो tumorigenicity में बढ़ावा देता है सेल चक्र प्रगति 10।

साथ में ले ली, एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के अधिक श्रमसाध्य और महंगे हैं, लेकिन वे भी प्रयोगों के बीच परिणामों के उच्च reproducibility के द्वारा पुष्टि की है जो अधिक सटीक डाटा, में परिणाम। बहु सेल-बस में चढ़ाना घनत्व अत्यधिक प्रभावित करती है परिणामों के बादएड निलंबन assays के पर्याप्त चढ़ाना घनत्व की अग्रिम अनुमापन इन assays का उपयोग क्षेत्र के गठन की परख करने की क्रिया से पहले प्रत्येक व्यक्ति ट्यूमर कोशिका प्रकार के लिए आवश्यक है क्षेत्रों। वैकल्पिक रूप से, और अधिक सटीक एकल कोशिका आधारित assays अग्रिम इस्तेमाल किया जा सकता है, या methylcellulose पूरकता मैकेनिकल कलाकृतियों को कम करने से परिणामों की सटीकता में सुधार करने के लिए। आनुवंशिक संशोधन या नशीली दवाओं के उपचार गंभीर रूप जिससे सेल घनत्व कम है, कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बदल सकता है, जहां क्षेत्र के गठन की स्थिति के बीच तुलना की जाती है, तो एकल कोशिका आधारित क्षेत्र assays के झूठे सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए अनिवार्य हो सकता है।

सारांश में, उचित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बहु सेल आधारित क्षेत्रों परख और एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों परख दोनों अलग सेल आबादी (स्टेम और गैर स्टेम सेल) के बीच क्षेत्र की क्षमता में मतभेद का संकेत कर रहे हैं। हालांकि, आमतौर पर तरल संस्कृतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं, जो बहु सेल आधारित क्षेत्रों assays के ई करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैंचढ़ाना घनत्व के माध्यम से प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा शुरू की rrors। बहु सेल आधारित assays के लिए methylcellulose (1%) की पूरकता clumping और क्षेत्र संलयन सेल से संबंधित कलाकृतियों को सीमित कर सकते हैं। इन आंकड़ों के आधार पर हमने विस्तृत अनुमापन विश्लेषण सेल व्यवहार्यता पर प्रयोगात्मक शर्तों की अग्रिम और नकारात्मक प्रभाव प्रदर्शन किया गया है और इस तरह सेल घनत्व की संभावना से इनकार कर दिया गया है जब तक कि एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। हालांकि, एकल कोशिका आधारित क्षेत्रों assays के अधिक श्रमसाध्य और अधिक महंगे हैं, और प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटिंग में आवश्यक नहीं किया जा सकता है। Methylcellulose पूरक बहु सेल आधारित क्षेत्रों assays के कुछ प्रयोगात्मक सेटिंग में एक और विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-attachment plate Corning 3474
MEGM Lonza CC-3151
Insulin Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
Hydrocortisone Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Sigma E9644 end concentration: 20 ng/ml
FGF PeproTech 100-18B end concentration: 20 ng/ml
B-27 Invitrogen/ Gibco 17504-044 end concentration: 1X
Heparin-Natrium-25000 IE Ratiopharm N68542.02 dilution 1:1,000
Pen/Strep Gibco 15140-122
FCS Gibco 10500-064
RPMI 1640 Gibco 21875-034
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Dulbecco’s PBS (1X) Gibco 14190-094
Shield1 Clontech 632189 dilution 1:1,000
DMEM/F12 Gibco 21041-025
DMEM/F12 (powder) Gibco 42400-010
Methyl cellulose Sigma M0387
Puromycin dihydrochloride Applichem A2856
Cell sorter BD Aria III cell sorter
FACS analyser BD Accuri c6 flow cytometer
Microscope Olympus IX50 Osiris

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References

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चिकित्सा अंक 95 कैंसर स्टेम कोशिकाओं परख डिम्बग्रंथि एकल कोशिका Sox2 क्षेत्रों डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा
मल्टी और सिंगल सेल आधारित क्षेत्रों assays का उपयोग मानव डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा कोशिकाओं में स्टेम सेल गुणों का मूल्यांकन
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Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. … More

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. J. Vis. Exp. (95), e52259, doi:10.3791/52259 (2015).

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