Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52259

Protocol

1. Generatie van OVCAR-3 Human ovariumcarcinoom cellen die stabiel Getransduceerde met Lentivirussen Bevat de SOX2 Regulatory Gewest Reporter Construct

  1. Genereren lentivirale deeltjes door transfectie van de HEK 293T-inpakcellijn met een reporterconstruct herkennen van een SOX2 regulerende regio zoals beschreven 10,21.
    OPMERKING: De verslaggever construct bevat verder een destabilisatie domein van de ProteoTuner Shield System voorsprong op de tdTomato fluorescentie eiwit. Shield1 bindt aan de destabilisatie domein aldus het proteasoom de fluorescentie-eiwit 22 degraderen voorkomen.
  2. Transduceren OVCAR-3 cellen met lentivirale deeltjes gedurende een periode van 24 uur. Daarna verwijdert de virale supernatant en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gekweekt in compleet medium (RPMI aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine).
  3. 48 uur later, 10 ug / ml puromycin toegevoegd aan de kweken en gedurende 5 dagen selectie van goed getransduceerde cellen mogelijk.

2. Voorbereiding van Cell Sorting en Plating

  1. Voeg Shield1 bij 1: 1000 verdunning 24 uur voorafgaand aan het sorteren van cellen. Gebruik stabiel getransduceerde OVCAR-3 cellen zonder Shield1 behandeling negatieve controles (figuur 1). Zuig media van kolf, wassen cellen met 1x PBS en trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA gedurende 3 min.
  2. Stop trypsine met compleet medium (zie hierboven), telling celaantallen Centrifugeer cellen bij 300 g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 5 min.
  3. Giet supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in 0,5-1 ml steriele PBS.
  4. Gebruik 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen.
  5. Pas celgetal tot 5 miljoen cellen per ml.
  6. Bereid ultra low-attachment 96-well platen met 100 ul bollen medium (MEGM aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen,B-27, heparine-natrium; of DMEM / F12 aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen, B-27, heparine-natrium met of zonder toevoeging van 1% methylcellulose, zie ook tabel 1). Eventueel antibiotica aan het medium bij een concentratie van 100 E / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine om het risico van mogelijke besmetting te minimaliseren.
  7. Sorteer RFP + en RFP- cellen in bereid 96 putjes van boven, 1 cel per putje (eencellige gebaseerde sferen assay) en 100 cellen per putje (meerdere cellen gebaseerde assay bollen), respectievelijk. Uit te voeren soort op commercieel beschikbare celsorteerder (zie Materials) met behulp van enkele cel modus Sorteren setup: 100 μ mondstuk, schede druk 20 psi, en de opbrengst masker 0, zuiverheid masker 32, fase masker 16.
  8. Beoordeel plating efficiëntie door microscopisch maken van putjes die cellen (voor de enkele cellen gebaseerde assay) en celaantallen telling in afzonderlijke putjes (voor meerdere cellen gebaseerde assay Figuur 2
  9. Incubeer cellen onder standaardomstandigheden in sferen medium (voor de samenstelling zie stap 2.6) bij 37 ° C en 5% CO2. Supplement dagelijks bFGF (20 ng / ml) en EGF (20 ng / ml).
  10. Na één week, tellen aantal opkomende tumor bolletjes met een standaard microscoop met 4x of 10x vergroting en een fluorescentie microscoop fluorescentiesignaal van het geïntegreerde reporter systeem detecteren. Telling bollen met een diameter groter dan 100 pm als "grote" bollen en bollen met een diameter 50 - 100 urn als "kleine" bolletjes (Figuur 3). Zorg ervoor dat u rekenen echte bollen en clusters niet cel.
    Opmerking: In single celgebaseerde proeven bol vorming gemakkelijker microscopisch toonde na 10 (versus 7) dagen kweken.
  11. Bereken het percentage bol vormende cellen RFP + respectievelijk RFP- cellen in één celgebaseerde proeven (een 96-well plaat voor elk experiment) of meerdere cel-based sferen assays (één goed voor elke individuele experiment) zoals gepresenteerd door Shaw et al. 16
    OPMERKING: Percentage gebied vormende cellen (%) = (aantal bollen) / (aantal gezaaide cellen) x 100

3. Seriële passage van de Bollen

  1. Breng de inhoud van elk putje in een geschikte steriele buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Voor multi-cel-gebaseerde sferen assays, verzamelen samen de sferen van het ene goed. Was de put 3-5 maal met PBS en centrifugeer 2 minuten langer. Voor single-cell based sferen assays, het verzamelen van individuele bollen. Door de lage aantallen cellen, gebruik 1,5 ml buizen voor centrifugatie en wasstappen.
  2. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ul 0.05% trypsine-EDTA.
  3. Om een ​​optimale celscheiding bereikt, incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 5 min in een zachte shaker. Optimaliseer trypsinisatie tijd voor uw cellijn tot lagere celdood tarief: als er geen grotebollen zichtbaar vermaal voorzichtig met behulp van een 100 ul pipet tip. Bij grote bollen zijn nog steeds aanwezig, incubeer met trypsine nog eens 3 min en vervolgens overgaan tot de tritureren stap. In het geval van enkelvoudige zorg ervoor om de tijd te optimaliseren voor een optimale cel opbrengst van levende cellen tijdens de behandeling met trypsine stap cel-gebaseerde testen.
  4. Om het trypsine te inactiveren, voeg 500 ul volledig medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij cel assays, centrifuge extra 2 min.
  5. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in sferen medium.
  6. Gebruik een 40 micrometer cel zeefdop filter om een ​​eencellige suspensie te verkrijgen.
  7. Bij gebruik RFP + en RFP- cellen in meercellige bassed assays beoordelen het percentage fluorescerende cellen in elk putje na resuspensie via flowcytometer analyse.
  8. Voor seriële replating testen van enkele cellen, zaden 1 cel per putje in een nieuwe ultra low-attachment 96-well plaat bereid zoals hierboven gedetailleerd. Van het ene individu bol, zaad ongeveer 20 individuele putten. Voor replating testen van meerdere cellen gebaseerde primaire werelden, zaadcellen verkregen uit een bron van primaire werelden in een nieuwe 96-well plaat en tel de celaantallen volgende dag microscopie.
  9. Beoordelen van het aandeel van de-bol-vormende cellen in het voortgezet sferen testen met behulp van de formule in stap 2.11 beschreven.

4. Resultaat Analyse

  1. Resultaten van experimenten uitgevoerd in onafhankelijke triplo geanalyseerd en gebruikt t-Test tweezijdige Student's normaal verdeelde waarden en anderszins Mann-Whitney-analyse Tests voor statistische analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In conventionele bollen assays, bijna 40% van RFP + OVCAR-3 cellen versus 20% van RFP- cellen leidde tot een individuele tumor bol in de primaire gebieden assay (figuur 4A). Bovendien bollen gevormd door RFP + cellen groter in omvang dan die gevormd door RFP- cellen.

Wanneer plated in single-cell based assays, RFP + cellen vormde ook meer bollen dan RFP- cellen, ter bevestiging van de resultaten hierboven. Er was echter een tendens generatie minder bollen per uitgeplaat in de eenmalige en de meerdere cellen gebaseerde assay (Figuur 4A, B), wat aangeeft dat deze test gebied formatie kan worden voorgespannen door middel van technische artefacten zoals mechanische bol fusie of dissociatie in de niet-hechtende kweekmedium.

Om deze aspecten verder te onderzoeken, vergeleken we de invloed van de cel uitplaatdichtheid op sferen formatie. We geplateerde cellen middels beperkende verdunning van 1000 cellen 1 cel per putje in 96-Goed platen en vond dat het aantal opkomende gebieden waren sterk afhankelijk van het aantal oorspronkelijk geplateerde cellen. Verrassenderwijs hogere aantallen kernen werden geteld lagere aantallen cellen uitgeplaat in zowel MGEM en DMEM / F12-gebaseerde media, waaruit blijkt dat inderdaad plating modaliteiten sterk vooroordeel resultaten in deze assay (figuur 5). Daarentegen, wanneer cellen werden geïmmobiliseerd door 1% methylcellulose tot DMEM / F12 gebaseerde sferen medium 23,24 efficiëntie van bol vorming was meestal onafhankelijk van celdichtheid.

Om de invloed van bollen kweekomstandigheden op CSC eigenschappen staand, analyseren we het percentage cellen die rode fluorescentie signaal na 7 dagen incubatie in de sferen assay. We vonden dat in meerdere cellen gebaseerde sferen kweken ongeveer 35% van de cellen van RFP + sferen verloren hun rode fluorescentie signaal na zeven dagen kweken (figuur 6A), wat suggereert dat zij undergeen differentiatie, terwijl 65% behield een RFP + signaal suggereert zelfvernieuwingscapaciteit. Daarentegen cellen van sferen geproduceerd uit eerste RFP- cellen bleef negatief RFP (figuur 6A), wat aangeeft dat zij niet opnieuw vestigen stamcellen potentieel onder deze omstandigheden.

Fluorescentie microscopie uitgevoerd op gebieden gegenereerd uit enkele cellen bevestigden deze resultaten waaruit blijkt dat enkele bolletjes afgeleid RFP + cellen bevatte zowel RFP + en RFP- cellen terwijl sferen afkomstig van RFP- cellen bleven negatief voor de rode signaal.

Soortgelijke resultaten werden waargenomen in replating assays van beide voorwaarden.

Figuur 1
Figuur 1. Workflow van lentivirale transductie, selectie en sortering van RFP + en RFP- cellen. Na lentivirale transductie en positieve selectie van succes getransduceerde cellen via puromycine blootstelling RFP- en RPF + cellen worden gesorteerd door FACS in individuele putjes van een 96-wells plaat in sferen medium. Voor multi-cel-gebaseerde sferen assays, zijn 100 cellen geplaatst in een put. Plating efficiëntie wordt beoordeeld door microscopie uitgevoerd na sortering. Bolletjes werden gescoord door microscopie na zeven tot tien dagen, gedissocieerd in enkele cellen, geanalyseerd via flowcytometrie en opnieuw uitgeplaat in secundaire sferen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Imaging gesorteerde RFP + en RFP- cellen na uitplaten. Enkele RFP + en RFP- cellen gesorteerd in elk putje van een plaat met 96 putjes geanalyseerd juiste plateren met een (fluorescentie) microscoop.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Analyse van gebieden formatie in één celgebaseerde proeven. Gebieden vorming geanalyseerd na zeven tot tien dagen. (A) Groot (diameter> 100 micrometer) en (B) klein (diameter 50 - 100 micrometer). Sferen onderscheiden microscopisch op basis van grootte Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Efficiëntie van de tumor bollen vorming van RFP +en RFP- OVCAR-3-cellen in multi versus single-cell based sferen assays. Vergelijking van de primaire en secundaire sfeer efficiëntie van OVCAR-3-cellen zoals bepaald in multi (A) ten opzichte van single-cell based sferen assays (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Cel uitplaatdichtheid sterk effect gebied telt van OVCAR-3 cellen in de meerdere cellen gebaseerde sferen assay uitgevoerd in vloeibare maar niet in methylcellulose aangevuld kweken. Het gebruik van andere cel dichtheden en kweekmedia werden gerapporteerd in de literatuur voor eierstokkanker bollen assays. Om mogelijke vooroordelen geïntroduceerd door deze variabelen te analyseren, worden de cellen uitgeplaat bij different dichtheden in 200 ul van verschillende sferen cultuur media (MGEM, DMEM / F12 met alle supplementen zoals omschreven in de paragraaf protocol of DMEM / F12 met alle supplementen en die 1% methylcellulose) en bol vorming wordt gescoord na 7 dagen (A) . Getoond in (B) zijn microscopie foto van cellen uitgeplaat bij verschillende dichtheden die één dag na het uitplaten in DMEM / F12 bollen kweekmedium zonder methylcellulose. Let op de cel clusters ontstaan ​​bij hoge celdichtheid in tegenstelling tot enkele cellen waargenomen bij lage dichtheid platen. Schaal bar voor foto's:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Analyse van RFP signaal tumor gebieden gevormd uit RFP + en respectieely RFP- OVCAR-3 cellen (A) Flowcytometrieanalyse voor RFP signaal in gedissocieerde sferen afgeleid van RFP + en RFP- cellen (multi-cel-gebaseerde sferen assay).; (B) Microscopie van bolletjes afgeleid van RFP + en RFP- cellen (single cell-based sferen assay) onthult heterogene RFP signaal in sferen afgeleid van RFP + maar niet van RFP- cellen. Foto's werden genomen op dag 7 voor conventionele bollen en dag 10 voor single-cell based sfeer proeven. Let op de grotere omvang van bolletjes afgeleid van RFP + vermeende CSCs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Menselijke ovariale kankercel source Basic medium Supplementen Auteurs
OVCAR-3, Caov-3, primair materiaal MEGM 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparine, hydrocortison, insuline (SingleQuot kit) Bareiss et al.
SKOV3 DMEM / F12 5 ug / ml insuline, 10 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA Li Ma et al.
A2780 DMEM / F12 5 ug / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 2% B-27, 0,4% BSA Haiwei Wang et al.
SKOV3 DMEM / F12 5 ug / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml hydrocortison Yong-Rui Du et al.
A2780, primair materiaal DMEM / F12 5 ug / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA T. Xiang et al.
Primair materiaal DMEM / F12 > 5 ug / ml insuline, 10 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA Te Liu et al.
MLS DMEM / F12 10 ng / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 Soritau et al.
3AO DMEM / F12 1 mg / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 MF Shi et al.
Primair materiaal DMEM / F12 5 ug / ml insuline, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA Shu Zhang et al.
Primair materiaal EBM-2 of X-VIVO 5 ug / ml insuline, 20 ng / ml REGF Ilona Kryczek et al.
OVCAR-3 MEGM 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparine Dongming Liang et al.
NHOUD "> Tabel 1. Voorbeelden van andere cel bronnen (cellijnen en primaire-patiënt afgeleid weefsel), media en supplementen gebruikt voor ovariële bollen assays in de vorige verslagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sferen culturen zijn een gebruikte methode om kanker stamcellen potentieel te testen en te verrijken voor stamcellen-achtige cellen in een breed spectrum van menselijke tumorcellen 15,25,26. Onder deze kweekomstandigheden worden kankercellen die zelfvernieuwing vermogen missen verwacht differentiëren en uiteindelijk celdood. Hoewel ze aanvankelijk celgroepen of tumor bollen name primaire assays kunnen vormen, zijn ze niet in staat bol vormende vermogen van seriële replating stand door gebrek aan zelf-vernieuwing eigenschappen. Gebieden assays worden gebruikt als surrogaat bepalingen om CSCs identificeren en hun frequentie gehele tumorcel populaties evalueren.

Echter, aanzienlijke verschillen worden waargenomen tussen bollen assays uitgevoerd volgens verschillende gepubliceerde protocollen 5,10,27-35 (Tabel 1). In ons laboratorium hebben wij eerder gepubliceerd bol vorming van menselijk ovariumcarcinoom cellen middels MEGM aangevuld met B-27, BFGF en heparine SingleQuot TM (die insuline, REGF en hydrocortison). Andere labs gebruiken hele DMEM / F12 Medium, terwijl sommige add alleen B-27 en REGF. In dit rapport werden meerdere cellen gebaseerde assay bollen in OVCAR-3 cellen derhalve uitgevoerd met verschillende omstandigheden. Met MEGM of DMEM / F12 met supplementen geen significant verschil in gebied formatie werd waargenomen in deze cellen (Figuur 5A). Bovendien hebben sommige laboratoria gespeculeerd dat EGF en FGF snel afgebroken kunnen worden en hebben protocols deze groeifactoren dagelijkse toevoeging aan het medium ingesteld. Daarom vergeleken bollen assays uitgevoerd in een medium waarin EGF en FGF alleen werd toegevoegd aan het begin van de bollen assays met dagelijkse toevoeging van EGF en FGF aan de celkweek, en we vinden deze assays gelijkwaardige resultaten op in OVCAR-3 cellen (gegevens niet getoond), wat suggereert dat de dure en arbeidsintensieve dagelijkse aanvulling met EGF en FGF niet altijd noodzakelijk. Of deze resultatenzijn van toepassing op cellen van andere eierstokkanker cellijnen of primaire monsters, of onder verschillende experimentele condities nog worden bepaald.

Echter, observeerden we een aanzienlijke bias in de aantallen gescoord bollen die bij andere geteste variabele cel plating dichtheid. Verrassenderwijs putjes geënt met lagere aantallen cellen vertoonden hogere aantallen bollen. Beperking celbeweging met 1% methylcellulose resulteerde in gelijke efficiëntie van bol vorming, onafhankelijk van het aantal initieel geplateerde cellen. Deze resultaten suggereren dat cellen klonteren en bol fusie of opsplitsing kan plaatsvinden modificeren bol nummers en leiden tot onnauwkeurige resultaten in meerdere cellen gebaseerde assays bollen. Wanneer cellen worden uitgeplaat op juiste dichtheid meerdere celgebaseerde proeven leiden echter tot resultaat nogal vergelijkbaar data in individuele cellen gebaseerde assays verzameld gebied (figuur 4). Om deze resultaten verder te onderzoeken vergeleken we single en multi-cel-gebaseerdeassays met behulp van ovariumcarcinoom cellen gesorteerd in vermeende CSCs via een onlangs gepubliceerd lentiviraal RFP uiten reporter voor een SOX2 regulerende regio 10. Inderdaad, beide testen bevestigden de verbeterde primaire en secundaire kring vormen aantal RFP + versus RFP- cellen (Figuur 4A, B). Belangrijk is dat de hogere aantallen sferen waargenomen vanuit RFP + cellen waren niet het gevolg van hogere proliferatieve capaciteit van de SOX2 expressie brengende cellen (data niet getoond), hetgeen in overeenstemming met eerdere resultaten blijkt dat de inductie van SOX2 bevordert bollen vorming en in vivo tumorigeniciteit zonder versnellende celcyclusprogressie 10.

Tezamen eencellige gebaseerde sferen assays zijn bewerkelijk en duur, maar ze accuratere gegevens, hetgeen ook wordt bevestigd door de hogere reproduceerbaarheid tussen experimenten. Aangezien uitplaatdichtheid zeer invloeden resulteert in multicel-based suspensie bollen testen vooraf titratie voldoende uitplaatdichtheid is voor elk afzonderlijk tumorceltype voor testen bol vorming met deze assays. Alternatief kan het nauwkeuriger enkele celgebaseerde proeven vooraf worden gebruikt of methylcellulose suppletie nauwkeurigheid van de resultaten verbeteren door mechanische artefacten. Als bol vorming vergeleken tussen condities waar de genetische modificatie of medicatie sterk kunnen veranderen levensvatbaarheid van de cellen, waardoor celdichtheid afneemt, kan een eencellig gebaseerde bol assays verplicht vals positieve resultaten te vermijden.

Kortom, onder de juiste experimentele omstandigheden zowel de multi-cel-gebaseerde sferen test en de single-cell based sferen assay zijn in staat om verschillen in sfeer potentiaal tussen verschillende celpopulaties (stam en niet-stamcellen) te geven. Echter, meerdere cellen gebaseerde assays sferen die gewoonlijk worden uitgevoerd in vloeibare culturen gevoeliger voor errors geïntroduceerd door experimenteel ontwerp door plating dichtheid. Suppletie van methylcellulose (1%) tot meerdere cellen gebaseerde assays kunnen artefacten gerelateerd aan klontering en bol fusion cel beperken. Op basis van deze gegevens, raden wij eencellige gebaseerde sferen testen worden uitgevoerd, tenzij gedetailleerde titratie analyses zijn uitgevoerd upfront en de negatieve impact van de experimentele omstandigheden op de levensvatbaarheid van de cellen en daardoor celdichtheid is uitgesloten. Echter, eencellige gebaseerde sferen assays bewerkelijker en duurder, en mogelijk niet in elke experimentele instelling vereist. Methylcellulose aangevuld meerdere cellen gebaseerde assays kunnen bolletjes ander alternatief in experimentele instellingen vertegenwoordigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-attachment plate Corning 3474
MEGM Lonza CC-3151
Insulin Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
Hydrocortisone Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Sigma E9644 end concentration: 20 ng/ml
FGF PeproTech 100-18B end concentration: 20 ng/ml
B-27 Invitrogen/ Gibco 17504-044 end concentration: 1X
Heparin-Natrium-25000 IE Ratiopharm N68542.02 dilution 1:1,000
Pen/Strep Gibco 15140-122
FCS Gibco 10500-064
RPMI 1640 Gibco 21875-034
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Dulbecco’s PBS (1X) Gibco 14190-094
Shield1 Clontech 632189 dilution 1:1,000
DMEM/F12 Gibco 21041-025
DMEM/F12 (powder) Gibco 42400-010
Methyl cellulose Sigma M0387
Puromycin dihydrochloride Applichem A2856
Cell sorter BD Aria III cell sorter
FACS analyser BD Accuri c6 flow cytometer
Microscope Olympus IX50 Osiris

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).

Tags

Geneeskunde kanker stamcellen bollen assay eierstok- enkele cel SOX2,
Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. More

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. J. Vis. Exp. (95), e52259, doi:10.3791/52259 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter