Protocol
1. Erzeugung von OVCAR-3 Human Ovarialkarzinomzellen Stabil mit Lentiviren Beinhaltet den SOX2 Regulatory Region Reporterkonstrukt Transduzierte
- Generieren lentivirale Partikel durch Transfizieren der HEK 293T-Verpackungszelllinie mit einem Reporter-Konstrukt Erkennen eines SOX2 regulatorische Region, wie beschrieben 10,21.
HINWEIS: Die Reporter-Konstrukt weiterhin enthält eine Destabilisierung Domäne des ProteoTuner Schild-System vor dem tdTomato fluoreszierendes Protein. Shield1 bindet zur Destabilisierung Domäne wodurch das Proteasom, das Fluoreszenzprotein 22 abbauen zu verhindern. - Transduzieren OVCAR-3-Zellen mit lentivirale Partikel über einen Zeitraum von 24 Stunden. Danach das Virusüberstand und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in komplettem Medium (RPMI, ergänzt mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin).
- 48 Stunden später wurden 10 ug / ml puromycin wurden zu den Kulturen zugegeben und für 5 Tage gehalten, um die Auswahl richtig transduzierten Zellen zu ermöglichen.
2. Herstellung der Zellsortierung und Oberflächen
- Fügen Shield1 bei 1: 1.000-Verdünnung 24 Stunden vor der Zellsortierung. Verwenden stabil transduzierten OVCAR-3-Zellen ohne Shield1 Behandlung als negative Kontrollen (Figur 1). Absaugen Medien aus Kolben, waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und trypsinieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min.
- Stoppen Trypsin unter Verwendung Vollmedium (siehe oben), zu zählen Zellzahlen Zentrifuge Zellen bei 300 · g bei RT (15 - 25 ° C) für 5 min.
- Dekantieren und resuspendieren Zellen vorsichtig in 0,5-1 ml sterilem PBS.
- Verwenden Sie 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Passen Zellzahl von 5 Millionen Zellen pro ml.
- Bereiten ultra low-Befestigungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 & mgr; l Kugeln Medium (MEGM ergänzt mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen,B-27, Heparin-Natrium; oder DMEM / F12 mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen, B-27, Heparin-Natrium mit oder ohne Zugabe von 1% Methylcellulose ergänzt, siehe auch Tabelle 1). Gegebenenfalls Antibiotika, hinzugefügt werden zu dem Medium in einer Konzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, um das Risiko einer möglichen Kontamination minimieren.
- Sortieren RFP + und RFP- Zellen in vorbereitete Platten mit 96 Vertiefungen von oben, 1 Zelle pro Vertiefung (Einzelzellbasis Kugeln Assay) und 100 Zellen pro Vertiefung (multi zellbasierten Assay Kugeln) sind. Führen Art auf handelsüblichen Zellsortierer (siehe Materialien) mit Einzelzellenmodus, Setup Sortieren: 100 μ Düse, Manteldruck 20 psi und Ertrags Maske 0, Reinheit Maske 32, Phasenmaske 16.
- Beurteilen Plattierungseffizienz von mikroskopisch scoring Vertiefungen mit Zellen (für die einzelnen Assays auf Zellbasis) und durch Zählen der Zellzahlen in einzelnen Vertiefungen (für die Mehr Assay auf Zellbasis, Figur 2
- Zellen unter Standardbedingungen in Bereichen mittlerer inkubieren (Zusammensetzung siehe Schritt 2.6) bei 37 ° C und 5% CO 2. Ergänzung täglich bFGF (20 ng / ml) und EGF (20 ng / ml).
- Nach einer Woche zählen Anzahl von Schwellentumorsphären mit einem Standard-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung oder 4X und einem Fluoreszenzmikroskop zur Fluoreszenzsignal von der integrierten Reportersystem zu erkennen. Graf Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 um als "große" Kugeln und Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 um, wie "klein" Kugeln (Abbildung 3). Achten Sie darauf, dass Sie echte Kugeln zu zählen und Cluster nicht zell.
HINWEIS: In einzelnen Assays auf Zellbasis Kugelbildung ist einfacher zu mikroskopisch nach 10 (Vergleich 7) Tagen Kultur erzielen. - Berechnen des Anteils der Kugel bildenden Zellen in RFP + bzw. RFP- Zellen in einzelnen Assays auf Zellbasis (eine Platte mit 96 Vertiefungen für jedes einzelne Experiment) oder Mehrfachzelle-baSED Kugeln Assays (Eine Vertiefung für jedes einzelne Experiment), wie von Shaw et al. 16
HINWEIS: Anteil der Kugel bildenden Zellen (%) = (Anzahl der Kugeln) / (Zahl der ausgesäten Zellen) × 100
3. Serien Passagieren von Kugeln
- Platzieren Sie den Inhalt jedes Wells in einer geeigneten sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT. Bei mehrzellbasierten Assays Kugeln, sammeln gemeinsam die Kugeln von einem gut. Mit PBS und zentrifugieren 2 Minuten mehr 5 Mal - Waschen Sie die gut 3. Für einzelne zellbasierten Assays Kugeln, sammeln einzelnen Kugeln. Aufgrund der geringen Anzahl von Zellen, verwendet 1,5 ml Röhrchen für Zentrifugation und Waschschritten.
- Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA.
- Um ein optimales Zelltrennung zu erreichen, Inkubation der Zellsuspension bei 37 ° C für 5 min in einem weichen Schüttler. Optimieren Trypsinierung Zeit für Ihre Zelllinie zu niedrigeren Zellsterberate: wenn keine großenSphären sichtbar verreiben vorsichtig mit einem 100 ul Pipettenspitze. Im Fall sind große Kugeln noch vorhanden, Inkubation mit Trypsin weitere 3 min und dann dem Verreiben Schritt. Bei Einzelzellbasierte Assays stellen Sie sicher, um die Zeit für eine optimale Zellausbeute von lebenden Zellen während der Trypsinierung Schritt optimieren.
- Um das Trypsin zu inaktivieren, 500 & mgr; l vollständiges Medium und Zentrifugation bei 300 g für 10 min, im Falle der Einzelzellassays Zentrifuge für weitere 2 min.
- Überstand entfernen und resuspendieren Zellen vorsichtig in Sphären Medium.
- Verwenden Sie eine 40 um Zellsieb Kappe Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- In dem Fall der Verwendung RFP + und RFP- Zellen in Mehrzellen bassed Assays beurteilt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen in jeder Vertiefung nach Resuspendierung über Durchflusszytometer Analyse.
- Für serielle replating Tests von Einzelzellen, Samen 1-Zelle pro Vertiefung in eine neue Ultra-Low-Befestigung Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt, wie oben beschrieben. Von einer einzelnen Kugel, Saatgut rund 20 Einzelbecken. Für replating Tests von Multi zellbasierten Primär Kugeln, von einem gut von primären Sphären erhalten Samenzellen in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen und zählen Sie die Zellzahl am nächsten Tag durch Mikroskopie.
- Beurteilung der Anteil der Kugel bildenden Zellen in der Sekundärkugeln Tests unter Verwendung des in Schritt 2.11 beschriebenen Formel.
4. Ergebnis-Analyse
- Analysieren Ergebnisse von Experimenten in unabhängigen dreifach durchgeführt und mit zweiseitigen Student-t-Test, um normal verteilt Werte und ansonsten Mann-Whitney-Tests für die statistische Analyse zu untersuchen.
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Representative Results
Bei herkömmlichen Sphären Assays fast 40% der RFP + OVCAR-3-Zellen gegenüber 20% der RFP- Zellen führte zu einer individuellen Tumorbereich in der primären Kügelchen Assay (4A). Darüber hinaus waren die Bereiche, die durch RFP + Zellen gebildet Größe als die RFP- Zellen größer ausgebildet.
Beim Betrieb in Tests auf Zellbasis überzogen, RFP + Zellen ebenfalls gebildet mehr Kugeln als RFP- Zellen bestätigt die obigen Ergebnisse. Allerdings gab es eine Tendenz zur Erzeugung von weniger Kugeln pro im einzelnen gegenüber dem Mehr Assay auf Zellbasis (4A, B) überzogen, das anzeigt, dass in diesem Assay Kugelbildung kann durch technische Artefakte wie mechanische Kugel Fusion oder Dissoziation vorgespannt wird in der nicht-adhärenten Kulturmedium.
Um diese Aspekte weiter zu untersuchen, verglichen wir den Einfluss der Zell Beschichtungs-Dichte auf Kugeln Bildung. Wir plattierten Zellen mit limitierender Verdünnung von 1000 Zellen auf 1 Zelle pro Well in 96--Wanne Platten und festgestellt, dass die Anzahl der Schwellenkügelchen waren in hohem Maße abhängig von der Anzahl der ursprünglich ausplattierten Zellen. Überraschenderweise wurden höhere Zahlen von Kugeln aus niedrigeren Zahlen von plattierten Zellen sowohl MGEM und DMEM / F12-basierte Medien gezählt, was zeigt, dass tatsächlich Plattierung Modalitäten hochBefunden in diesem Assay (Figur 5). Im Gegensatz dazu, wenn die Zellen durch Zugabe von 1% iger Methylcellulose zu DMEM / F12 basierende Kugeln immobilisierten Medium 23,24 der Wirkungsgrad der Kugelbildung war weitgehend unabhängig von der Zelldichte.
Um den Einfluss von Kugeln Kulturbedingungen auf CSC Eigenschaften zu erforschen, untersuchten wir den Prozentsatz an Zellen nach 7 Tagen Inkubation in der Kugeln Assay exprimieren roten Fluoreszenz-Signal. Wir fanden, dass in mehreren Zellbasis Kugeln Kulturen bei etwa 35% der Zellen aus RFP + Kugeln verloren ihre roten Fluoreszenz Signal nach sieben Tagen in Kultur (6A), was darauf hindeutet, dass sie undergeine Unterscheidung, während 65% erhalten eine RFP + Signal hindeutet Selbsterneuerungskapazität. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen von Kugeln aus zunächst RFP- Zellen erzeugt blieb RFP negativ (6A), was darauf hinweist, dass sie nicht die Wiederherstellung der Stammzellpotential unter diesen Bedingungen.
Die Fluoreszenzmikroskopie auf Kugeln aus einzelnen Zellen erzeugt geführt bestätigten diese Ergebnisse zeigen, dass einzelne Bereiche abgeleitet RFP + Zellen enthalten sowohl RFP + und RFP- Zellen, während Kugeln aus RFP- Zellen stammen weiterhin negativ für das rote Signal.
Ähnliche Ergebnisse wurden in replating Assays von beiden Bedingungen beobachtet.
Abbildung 1. Arbeitsablauf des lentiviralen Transduktion, Auswahl und Sortierung von RFP + und RFP- Zellen. Nach lentivirale Transduktion und positive Selektion von erfolgreich transduzierten Zellen über Puromycin Belichtung RFP- und RPF + Zellen durch FACS in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen in Bereichen mittlerer sortiert. Bei mehrzellbasierten Assays Sphären werden 100 Zellen in einer guten Position. Plattierungseffizienz durch Mikroskopie nach der Sortierung durchgeführt bewertet. Kugeln wurden durch Mikroskopie nach sieben bis zehn Tagen hat, in Einzelzellen dissoziiert, über Durchflusszytometrie analysiert und in sekundäre Kugeln erneut plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Imaging sortierter RFP + und RFP- Zellen nach der Plattierung. Einzel RFP + und RFP- Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen sortiert sind zum korrekten Plattierung unter Verwendung eines (Fluoreszenz) Mikroskop analysiert.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Analyse von Kugeln Bildung in einzelnen Assays auf Zellbasis. Spheres Bildung ist nach sieben bis zehn Tagen analysiert. (A) Large (Durchmesser> 100 um) und (B) klein (Durchmesser von 50 bis 100 um). Sphären unterschieden mikroskopisch auf Größe basieren Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Effizienz der Tumorbildung aus Kugeln RFP +und RFP- OVCAR-3-Zellen in Multi gegen einzellige basierend Sphären Assays. Vergleich von primären und sekundären Bereich Effizienz von OVCAR-3-Zellen, wie in mehreren (A) untersucht im Vergleich zu Einzelzellbasierten Assays Kugeln (B). Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Zell Plattierungsdichte stark Auswirkungen Kugel zählt von OVCAR-3-Zellen in den Mehrzellbasierten Assay Sphären in flüssiger, jedoch außerhalb Methyl ergänzten Kulturen. Die Verwendung von verschiedenen Zelldichten und Wachstumsmedien wurden in der Literatur für Eierstockkrebs gemeldet Kugeln Assays. Um mögliche Verzerrungen durch diese Variablen eingeführt Analyse werden die Zellen bei differe vernickeltnt Dichten in 200 ul verschiedenen Bereichen Kulturmedien (MGEM, DMEM / F12 mit allen Ergänzungsmittel im Sinne der Protokollabschnitt oder DMEM / F12 mit allen Ergänzungen detailliert und mit 1% iger Methylcellulose) und Kugelbildung wird nach 7 Tagen hat (A) . Gezeigt in (B) sind Mikroskopiebilder von Zellen bei unterschiedlichen Dichten nach dem Ausplattieren in DMEM / F12 als einen Tag zogene Kugeln Kulturmedium ohne Methylcellulose. Beachten Sie die Zellhaufen Schwellen bei hoher Zelldichte im Gegensatz zu Einzelzellen in geringer Dichte Platten gesehen. Maßstab für Bilder:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Analyse der RFP-Signal in der Tumor Kugeln aus RFP + und JEWEILIGEN gebildetely RFP- OVCAR-3-Zellen (A) Durchflusszytometrie-Analyse für RFP-Signal in dissoziierter Kugeln aus RFP + und RFP- Zellen (Multi zellbasierten Assay Kugeln). (B) Mikroskopie von Kugeln aus RFP + und RFP- Zellen (Einzelzellbasis Bereichen Assay) abgeleitet zeigt heterogene RFP Signal in Kugeln aus RFP abgeleitet + nicht aber von RFP- Zellen. Bilder wurden am Tag 7 für konventionelle Kugeln und Tag 10 für Einzelzellbasierten Assays Kugel getroffen. Beachten Sie die größere Größe von Kugeln aus RFP + vermeintlichen CSCs abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Menschlichen Eierstockkrebszellquelle | Basismedium | Zuschläge | Autoren |
| OVCAR-3, Caov-3, Grundmaterial | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 & mgr; g / ml Heparin, Hydrocortison, Insulin (SingleQuot kit) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ug / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 2% B-27, 0,4% BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml Hydrocortison | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, Vormaterial | DMEM / F12 | 5 ug / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | T. Xiang et al. |
| Vormaterial | DMEM / F12 > | 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | MF Shi et al. |
| Vormaterial | DMEM / F12 | 5 ug / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | Shu Zhang et al. |
| Vormaterial | EBM-2 oder X-VIVO | 5 ug / ml Insulin, 20 ng / ml rEGF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 & mgr; g / ml Heparin | Dongming Liang et al. |
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Discussion
Spheres Kulturen sind eine weit verbreitete Methode, um zu untersuchen Krebsstammzellpotential und bereichern für stielartigen Zellen in einer breiten Palette von menschlichen Tumorzellen 15,25,26. Unter diesen Kulturbedingungen werden die Krebszellen, die Selbsterneuerung Fähigkeit fehlt voraussichtlich zu differenzieren und schließlich Zelltod. Obwohl sie zunächst bilden Zellhaufen oder auch Tumorsphären vor allem in der Grund Assays, sind sie nicht in der Lage, Kugel bildende Fähigkeit auf serielle replating Sustain wegen des Mangels an Selbsterneuerung Eigenschaften. Spheres Assays werden als Surrogat Tests zur CSCs identifizieren und bewerten ihre Häufigkeit im gesamten Tumorzellpopulationen.
Jedoch können deutliche Schwankungen zwischen den Sphären Assays beobachtet, durchgeführt werden, nach verschiedenen veröffentlichten Protokollen 5,10,27-35 (Tabelle 1). In unserem Labor haben wir zuvor Kugelbildung von humanen Ovarialkarzinomzellen Verwendung MEGM mit B-27 ergänzt veröffentlichtBFGF, Heparin und SingleQuot TM (mit Insulin, rEGF und Hydrocortison). Andere Labors verwenden ganzen DMEM / F12 Medium, während einige nur hinzufügen B-27 und rEGF. In diesem Bericht wurden mehrzellbasierten Assay Kugeln in OVCAR-3-Zellen und deshalb erfolgt mit unterschiedlichen Bedingungen. Verwendung MEGM oder DMEM / F12 mit allen Ergänzungs keinen signifikanten Unterschied in Kugelbildung wurde in diesen Zellen (5A) beobachtet. Darüber hinaus haben einige Labors spekuliert, dass EGF und FGF kann schnell abbaubar und haben Protokolle Zugabe dieser Wachstumsfaktoren täglich zu dem Medium hergestellt. Daher verglichen Kugeln Assays in einem Medium, in dem EGF und FGF wurde nur zu Beginn der Kugeln Assays mit täglichen Zugabe von EGF und FGF zu der Zellkultur zugegeben wurde, und wir finden diese Assays zu gleichwertigen Ergebnissen in OVCAR-3-Zellen zu erhalten (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass das teure und mühsame tägliche Ergänzung mit EGF und FGF nicht immer notwendig sein. Ob diese Ergebnissesind anwendbar auf Zellen, die aus anderen Eierstockkrebszelllinien oder Primärproben oder unter verschiedenen Versuchsbedingungen noch bestimmt werden.
Allerdings beobachten wir einen erheblichen Verzerrung der Zahlen erzielter Kugeln von einem anderen getesteten Variable, die Zelle Plattierungsdichte eingeführt. Überraschenderweise ausgesät Brunnen mit geringeren Mengen von Zellen zeigten eine höhere Anzahl von Kugeln. Begrenzungszellmobilität von 1% Methylcellulose in Folge der gleichen Effizienz der Kugelbildung, von der Anzahl der ursprünglich ausplattierten Zellen unabhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zelle Verklumpung und Kugel Fusion oder Disaggregation kann auftreten, zu modifizieren Sphäre Zahlen und führen zu ungenauen Ergebnissen in mehreren zellbasierten Assays Sphären. Wenn Zellen in geeigneten Dichte ausplattiert, multi zellbasierten Assays jedoch zu Ergebnissen eher vergleichbar mit Daten in Einzelzellbasis Kugel Assays gesammelt (Figur 4) zu führen. Um diese Ergebnisse weiter zu erforschen verglichen wir ein- und mehrzellbasiertenTests unter Verwendung von Ovarialkarzinom-Zellen über eine kürzlich veröffentlichte lentiviralen RFP Ausdruck Reportersystem für eine SOX2 regulatorischen Bereich 10 in vermeintlichen CSCs sortiert. Tatsächlich bestätigten beide Tests die verbesserte Primär- und Sekundärbereich bildenden Kapazität von RFP + gegen RFP- Zellen (4A, B). Wichtig ist, dass die höheren Zahlen von Kugeln aus RFP + Zellen beobachtet aufgrund höherer proliferative Kapazität der SOX2 exprimierenden Zellen (Daten nicht gezeigt), die in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigt, dass die Induktion von SOX2 ist fördert Kugeln Bildung und in vivo Tumorerzeugung ohne Beschleunigungs Zellzyklus 10.
Zusammengenommen sind Einzelzellbasis Kugeln Assays mehr aufwendig und teuer sondern in genaueren Daten, die auch durch die höhere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Experimenten bestätigt, führen. Seit Beschichtungs-Dichte hoch Einflüsse führt zu Mehrzellen-based Aussetzung Kugeln Assays Voraus Titration einer angemessenen Beschichtungs-Dichte für jede einzelne Tumorzelltyp vor der Untersuchung Kugelbildung unter Verwendung dieser Assays erforderlich. Alternativ können die genauere Einzelzellbasierten Assays verwendet werden, im Voraus oder Methyl Supplementierung um die Genauigkeit der Ergebnisse, indem mechanische Artefakte zu verbessern. Wenn Kugelbildung zwischen Bedingungen verglichen wobei die genetische Veränderung oder medikamentöse Behandlung kann stark verändern Lebensfähigkeit der Zellen und damit die Zelldichte abnimmt, kann einzelne zellbasierten Assays Bereich zwingend falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden.
Zusammengefasst unter geeigneten Versuchsbedingungen sowohl die Mehrzellbasierten Assay Sphären und die Einzelzellbasis Bereichen Assay in der Lage, Unterschiede in der Sphäre Potential zwischen verschiedenen Zellpopulationen (Stamm-und Nicht-Stammzellen) zeigen. Jedoch sind Mehrzellbasierten Assays, die Kugeln werden gewöhnlich in Flüssigkulturen ausgeführt anfälliger errors durch Versuchsplanung durch Beschichtungs-Dichte eingeführt. Ergänzung von Methylcellulose (1%), Multi zellbasierte Assays können Artefakte im Zusammenhang mit Verklumpung und Kugel Fusion Zelle zu begrenzen. Basierend auf diesen Daten, empfehlen wir einzelne zellbasierten Assays Bereichen durchgeführt, es sei denn detaillierte Titration Analysen wurden im Voraus und negativen Auswirkungen der Versuchsbedingungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen durchgeführt und damit die Zelldichte wurde ausgeschlossen werden. Allerdings sind einzelne zellbasierten Assays Sphären aufwändiger und teurer, und vielleicht nicht in jeder Versuchseinstellung erforderlich. Methylcellulose-ergänzt Multi zellbasierten Assays Kugeln kann eine andere Alternative in einigen experimentellen Einstellungen darstellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
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