Protocol
安定SOX2規制地域レポーター構築物を含むレンチウイルスで形質導入されたOVCAR-3ヒト卵巣癌細胞の1世代
- 10,21が説明されているようにSOX2調節領域を認識レポーター構築とHEK 293T-パッケージング細胞株をトランスフェクションすることによってレンチウイルス粒子を生成します。
注：レポーター構築物はさらに、先にtdTomatoの蛍光タンパク質のProteoTunerシステムシールドシステムの不安定化ドメインを含む。 Shield1を、それにより蛍光タンパク質22を分解するためのプロテアソームを防止不安定化ドメインに結合する。 - 24時間の期間にわたって、レンチウイルス粒子を有するOVCAR-3細胞を形質導入する。その後、ウイルス上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、完全培地中で培養した（RPMI、10％FBS、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン）で細胞を洗浄する。
- 48時間後、10μg/ mlののプーロマイシンを培養物に添加し、適切に形質導入された細胞の選択を可能にするために5日間維持した。
細胞選別、めっきの作製
- 前細胞選別1,000希釈24時間：1でのShield1を追加します。ネガティブコントロールとしてのShield1処理（ 図1）することなく、安定的に形質導入されたOVCAR-3細胞を使用してください。フラスコから培地を吸引除去し、3分間、0.05％トリプシン-EDTAを用いて細胞を1×PBSで細胞を洗浄し、トリプシン処理。
- 5分間 - （25°C 15）完全培地を使用してトリプシンを停止し（上記参照）、細胞数をカウントし、室温で300×gで遠心分離細胞。
- 1mlの滅菌PBS - 0.5に慎重に上清を再懸濁細胞をデカントします。
- 単一細胞懸濁液を得るために、40μmのセルストレーナーキャップフィルタを使用する。
- ミリリットルあたり5万個の細胞に細胞数を調整します。
- 培地を100μlの球で超低付着の96ウェルプレートを準備し（MEGMは、増殖因子、サイトカイン、およびサプリメントを補充B-27、ヘパリンナトリウム;またはDMEM / F12）は、 表1を参照して、1％メチルセルロースの添加の有無にかかわらず、成長因子、サイトカイン、およびサプリメント、B-27、ヘパリンナトリウムを補充した。必要に応じて可能な汚染のリスクを最小限にするために100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンの濃度で培地に抗生物質を加える。
- ソートRFP +上から調製した96ウェルプレートにRFP-細胞を、ウェルあたり1細胞（単球、細胞ベースアッセイ）及びウェル当たり100細胞（多細胞ベースの球アッセイ）。 100μノズル、シース圧力20 PSI、および歩留まりマスク0、純度マスク32、位相マスク16：シングルセルモード、ソートセットアップを使用して（ 材料を参照）ソートで市販のセルソーターを実行します。
- 多細胞ベースのアッセイのために（顕微鏡的（単一の細胞ベースのアッセイのために）細胞を含むウェルをスコアによって個々のウェル中の細胞数を計数することにより、めっき効率を評価する; 図2
- 37℃、5％CO 2で（組成についてステップ2.6参照）培地球における標準条件下で細胞をインキュベートする。毎日のbFGF（20ng / ml）およびEGF（20ng / mlの）を補完する。
- 1週間後、統合されたレポーターシステムからの蛍光シグナルを検出するための4倍または10倍の倍率蛍光顕微鏡で標準的な顕微鏡を使用して、新たな腫瘍球の数を数える。 「大」球としては100μmを超える直径の球をカウントし、直径50球- "小さな"球（ 図3）としては100μm。あなたが本当の球をカウントし、クラスターをセルではないことを確認してください。
注：単一のセルベースアッセイでは、球形成は文化の10（7対）日後に顕微鏡的に得点する方が簡単です。 - RFPの+中球形成細胞の割合を計算し、それぞれの単一細胞ベースのアッセイ（各個々の実験のために1枚の96ウェルプレート）または多細胞学士でRFP-細胞ショーらによって提示されたsed球アッセイ（各個々の実験用のウェル）。16
注：細胞を形成する球の割合（％）=（球の数）/（播種した細胞数）×100
球の3連続継代
- RTで10分間300×gで、適切な滅菌チューブと遠心分離機における各ウェルのコンテンツを配置します。マルチセルベース球アッセイのために、1つのウェルから球を一緒に集める。 PBSおよび2分より長い遠心分離機で5回 - よく3を洗う。単一細胞ベースの球アッセイのために、個々の球を集める。起因する細胞の数が少ないために、遠心分離および洗浄工程では1.5 mlチューブを使用しています。
- 0.05％トリプシン-EDTAの200μlの上清と再懸濁ペレットを削除します。
- 最適な細胞分離を達成するために、ソフトシェーカーで5分間、37℃で細胞懸濁液をインキュベートする。細胞死率を下げるためにあなたの細胞株について、トリプシン処理時間を最適化：なし大型た場合球は穏やかに100μlのピペットチップを用いて可視粉砕物である。ケースで大球は、まだ存在している別の3分のトリプシンでインキュベートした後、トリチュステップに進みます。シングルセルベースアッセイの場合、トリプシン処理工程中の生きた細胞の最適な細胞収量のための時間を最適化するようにしてください。
- トリプシンを不活性化するために、単一細胞アッセイの場合には、10分間、500μlのに追加の2分間の遠心分離を300×gで遠心分離し、完全培地を加える。
- 球培地に注意深く上清および再懸濁細胞を除去する。
- 単一細胞懸濁液を得るために、40μmのセルストレーナーキャップフィルタを使用する。
- RFP +および多細胞bassedアッセイにおいてRFP-細胞を用いる場合には、フローサイトメーター分析を介して十分に再懸濁した後、各蛍光細胞の割合を評価する。
- 上記で詳述したように調製した単一細胞の連続再プレーティングアッセイ、シードウェルあたり1細胞の新しい超低付着の96ウェルプレートに用。 1個々の球体からは、約20個々のウェルをシード。マルチセルベースのプライマリ球の再プレーティングアッセイのために、種子細胞を新しい96ウェルプレートに一次球の1つのウェルから得られ、顕微鏡法によって細胞数を翌日カウント。
- ステップ2.11で説明した式を用いた二球アッセイにおける球形成細胞の割合を評価する。
4.結果解析
- 独立した三連で行われた実験の結果を分析し、統計分析のために、正規分布の値とそれ以外のマン - ホイットニー·テストを分析するために、両側スチューデントのt検定を使用しています。
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Representative Results
従来の球アッセイにおいて、RFP + OVCAR-3細胞の約40％対RFP-細胞の20％が一次球アッセイにおける個々の腫瘍球（ 図4A）を生じた。また、RFP +細胞によって形成球体はRFP-細胞によって形成されたものよりもサイズが大きかった。
単一細胞に基づくアッセイでプレーティングすると、RFP +細胞はまた、上記の結果を確認し、RFP-細胞より球を形成した。しかし、多細胞ベースのアッセイ（ 図4A、B）対単一に播種あたり少ない球体の発生傾向が、このアッセイにおいて、球体の形成は、機械的な球融合または解離などの技術的成果物を介してバイアスされてもよいことを示してあった非接着性培養培地中。
さらにこれらの側面を探るために、我々は、球形成に及ぼす細胞播種密度の影響を比較した。私たちは96でウェルあたり1セルに1,000個の細胞から限界希釈を用いて細胞をメッキ型ウェルプレートおよび新興球の数が最初に播種した細胞の数に大きく依存していたことがわかった。驚くべきことに、球の高い番号は、このアッセイで実際にプレーモダリティの高いバイアス結果（ 図5）ことを実証し、両方MGEMし、DMEM / F12ベースのメディアでプレーティングした細胞の低い数字からカウントした。対照的に、細胞を、培地DMEM / F12ベースの球体に1％メチルセルロースを添加することにより固定化した23,24球形成の効率は、細胞密度の大部分は無関係であった。
CSC特性に球培養条件の影響を調査するために、我々は、球アッセイにおけるインキュベーションの7日後に赤色蛍光シグナルを発現する細胞の割合を分析した。我々は、マルチセルベース球培養においてRFP +球由来の細胞の約35％がアンダーグラウンドを持っていることを示唆し、培養物（ 図6A）の7日後に、それらの赤色蛍光シグナルを失ったことがわかった65％は自己再生能を示唆するRFP +信号を保持し、一方の分化。対照的に、最初にRFP-細胞から生成された球体からの細胞は、これらの条件下での幹細胞の可能性を再確立することができないことを示す、RFP陰性（ 図6A）が残った。
単一細胞から生成された球に対して行わ蛍光顕微鏡は、これらの結果はRFP-細胞由来の球体が赤信号に対して陰性のままであったRFP +細胞由来の単球は、RFP +とRFP-細胞の両方を含むことを示すことを確認した。
同様の結果は、両方の条件から再プレーティングアッセイで観察された。
図1.レンチウイルス伝達のワークフロー、選択とレンチウイルス形質導入とのポジティブ選択後。RFP +とRFP-細胞の仕分けピューロ暴露、RFP-とRPF +細胞を経由して成功した形質導入した細胞は球培地中で96ウェルプレートの個々のウェルにFACSによって並べ替えられています。マルチセルベース球アッセイのために、100細胞は、1つのウェルに配置されている。めっき効率は、ソート後に実行顕微鏡で評価されている。球が七から十日後に顕微鏡によりスコア化した、フローサイトメトリーによって分析し、二次球状に再プレート、単一の細胞に解離する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
めっき後にソートされたRFP +およびRFP-細胞の図2イメージング。96ウェルプレートの各ウェルにソート単一のRFP +とRFP-細胞が（蛍光）顕微鏡を使用して、正しいめっきを分析する。w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
単一細胞ベースのアッセイにおける球形成の図3.分析球形成は、7〜10日後に分析される。 （A）大（直径> 100ミクロン）と（B）小（直径50から100ミクロン）の球を顕微鏡サイズに基づいて区別されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
RFP +から腫瘍球形成の図4.効率とRFP- OVCAR-3単一セルベース球アッセイ対多のセル。OVCAR-3細胞からの一次および二球効率の比較単一のセルベースの球アッセイ（B）対多（A）でアッセイとして。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
強く影響球は、液体が、メチルセルロースで補充していない培養物中で行うマルチセルベース球アッセイにおけるOVCAR-3細胞から数え図5細胞播種密度異なる細胞密度および増殖培地の使用は、卵巣癌についての文献に報告されているアッセイを球。これらの変数によって導入可能なバイアスを分析するために、細胞はdiffereでプレーティングされている別の球培養培地（MGEM、すべてのサプリメントとプロトコルセクション、またはDMEM / F12で詳述し、1％メチルセルロースを含むものとして、すべてのサプリメントを含むDMEM / F12）の200μlの密度と球形成は7日間（A）で得点され、NT 。 （B）に示されているメチルセルロースを含まないDMEM / F12球培養培地をメッキした後に1日取ら異なる密度でプレーティングした細胞の顕微鏡写真である。低密度プレートで見られる単一細胞とは対照的に、高い細胞密度で新興の細胞クラスターに注意してください。写真のためのスケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
腫瘍球の信号はRFP +とrespectivから形成された分析RFPの図6.エリーRFP- OVCAR-3細胞を（A）は 、RFP +から派生し、解離した球とRFP-細胞（マルチセルベースの球アッセイ）においてRFP信号についてフローサイトメトリー分析。 RFP +およびRFP-細胞（単球、細胞ベースアッセイ）由来の球体の（B）顕微鏡は、異種のRFP RFPから誘導球体の信号+なくRFP-細胞から明らかになる。写真は、単一の細胞ベース球アッセイのために、従来の球体と10日目のために7日目に採取した。 RFP +の推定のCSCから派生球の大きいサイズを注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ヒト卵巣癌細胞源 | 塩基性媒体 | サプリメント | 著者 |
| OVCAR-3、Caov-3、主材料 | MEGM | 20ng / mlのREGF、20ng / mlのbFGFを、B-27、4 / mlのヘパリン、ヒドロコルチゾン、インスリン（SingleQuotキット） | Bareissのら。 |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5μg/ mlのインスリン、10ng / mlのREGF、10ng / mlのbFGFを、12 / mlのLIF、0.3％BSA | リー馬ら |
| A2780 | DMEM / F12 | 5μg/ mlのインスリン、20ng / mlのREGF、2％B-27、0.4％BSA | Haiwei Wang ら。 |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5μg/ mlのインスリン、20ng / mlのREGF、10ng / mlのbFGFを、2％B-27、1 / mlのヒドロコルチゾン | ヨン·ルイドゥら。 |
| A2780、主材料 | DMEM / F12 | 5μg/ mlのインスリン、20ng / mlのREGF、10ng / mlのbFGFを、0.4％BSA | T.翔ら。 |
| 主要材料 | DMEM / F12 > | 5μg/ mlのインスリン、10ng / mlのREGF、10ng / mlのbFGFを、12 / mlのLIF、0.3％BSA | テ·Liuら。 |
| MLS | DMEM / F12 | 10ng / mlのインスリン、20ng / mlのREGF、20ng / mlのbFGFを、2％B-27 | Soritau ら 。 |
| 3AO | DMEM / F12 | 1mg / mlのインスリン、20ng / mlのREGF、20ng / mlのbFGFを、2％B-27 | MF市ら。 |
| 主要材料 | DMEM / F12 | 5μg/ mlのインスリン、20ng / mlのREGF、10ng / mlのbFGFを、0.4％BSA | シュウZhang ら。 |
| 主要材料 | EBM-2またはX-VIVO | 5μg/ mlのインスリン、20ng / mlのREGF | イローナKryczek ら。 |
| OVCAR-3 | MEGM | 20ng / mlのREGF、20ng / mlのbFGFを、B-27、4μg/ mlのヘパリン | 東明Liang ら。 |
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Discussion
球培養物は、癌幹細胞は、潜在的なアッセイおよびヒト腫瘍細胞15,25,26広範囲の幹様細胞を濃縮するために広く用いられている方法である。これらの培養条件下で、自己複製能を欠く癌細胞は分化し、最終的に細胞死を受けることが予想される。彼らは当初、特に第一のアッセイであっても腫瘍球を細胞クラスターを形成するか、またはかもしれないが、それらは、自己複製の特性の欠如にシリアル再プレーティングの際に球形成能力を維持することができません。球アッセイのCSCを識別し、全腫瘍細胞集団におけるそれらの頻度を評価するための代理アッセイとして使用されている。
球アッセイは、異なる公開されたプロトコル5,10,27-35（ 表1）に続いて実行の間しかし、実質的な変動を観察することができる。私たちの研究室では、以前にMEGMを用いて、ヒト卵巣癌細胞から球形成を公開しているB-27を補った、bFGFを、ヘパリンおよびSingleQuot TM（インスリン、REGFおよびヒドロコルチゾンを含む）。一部のみB-27とREGFを追加しながら、他のラボは、全体のDMEM / F12培地を使用しています。この報告では、OVCAR-3細胞の多細胞ベースの球アッセイは、したがって、異なる条件を用いて実施した。球形成の有意差は、これらの細胞（ 図5A）は観察されなかったすべてのサプリメントをMEGMまたはDMEM / F12を用いて。また、いくつかの研究室は、EGFとFGFを迅速に低下する場合があることを推測している、中に毎日、これらの成長因子を追加するプロトコルを確立しています。したがって、我々は、EGF及びFGFは、細胞培養に毎日EGFの添加およびFGFと球アッセイの開始時にのみ添加した培地中で行わ球アッセイを比較して、我々は、OVCAR-3細胞で同等の結果を得るために、これらのアッセイを見つけるEGFとFGFとの高価で面倒な毎日の補給は、必ずしも必要ではないかもしれないことを示唆した（データは示さず）。これらの結果かどうか他の卵巣癌細胞株または一次サンプルから、または異なる実験条件下で細胞に適用可能であることは決定されていない。
しかし、我々は、細胞播種密度が他の試験された変数によって導入得点球の数の実質的なバイアスを観察した。驚くべきことに、ウェルは球の高い数値を示した細胞のより低い数字を播種。 1％メチルセルロースによる細胞の移動性を制限すると、最初に播種した細胞の数に依存しない、球形成の同じ効率が得られた。これらの結果は、細胞凝集球融合または凝集球数を変更し、マルチセルベース球アッセイにおける不正確な結果につながる発生する可能性があることを示唆している。細胞が適切な密度で播種された場合、マルチセルベースアッセイは、しかしながら、単一の細胞ベースの球アッセイ（ 図4）で収集されたデータにかなり匹敵する結果をもたらす。さらに、これらの結果を調査するために、我々は、単一および複数の細胞ベースの比較SOX2調節領域10のための最近公開されたレンチウイルスRFPを発現するレポーターシステムを介して、推定上のCSCに分類卵巣癌細胞を用いたアッセイ。実際、両方のアッセイはRFP-細胞（ 図4A、B）対RFP +の容量を形成する強化された一次および二次球体を確認した。重要なことに、RFP +細胞から観察された球の高い数がSOX2の誘導を示した以前の結果と一致しているSOX2を発現する細胞の高い増殖能力（データは図示せず）に起因していなかったが、加速なし球形成およびインビボ腫瘍形成にを促進する細胞周期の進行10。
一緒になって、単一の細胞ベース球アッセイは、より面倒かつ高価であるが、それらはまた、実験間の結果の高い再現性により確認され、より正確なデータをもたらす。マルチセル-BASでプレーティング密度の高い影響を与える結果ので、編懸濁液アッセイ、適切な播種密度の先行滴定は、これらのアッセイを使用して球体形成をアッセイする前に、各個々の腫瘍細胞型に必要とされる球体。あるいは、より正確に単一の細胞ベースのアッセイは、機械的なアーチファクトを低減することにより、結果の精度を向上させるために先行、またはメチルセルロース補充を使用することができる。球形成が遺伝子改変または薬物治療が厳しく、それによって細胞密度を減少させる、細胞の生存率を変化させることができる条件の間で比較した場合、単一の細胞ベース球アッセイは、偽陽性の結果を回避するために必須であってもよい。
要約すると、適切な実験条件下でマルチセルベース球アッセイおよび単一細胞ベースの球アッセイの両方は、異なる細胞集団（幹細胞および非幹細胞）との間の球電位の差を示すことができる。しかし、一般に、液体培養物において行われるマルチセルベース球アッセイは、電子を受けやすいメッキ密度を通じて実験計画によって導入rrors。マルチセルベースアッセイにメチルセルロースの補足（1％）が細胞凝集と球の融合に関連する成果物を制限することができます。これらのデータに基づいて、我々は、詳細な滴定分析は、細胞生存率に対する実験条件の先行および負の影響を行ってきたことにより、細胞密度が除外されていない限り、実行される単一の細胞ベース球アッセイをお勧めします。しかし、単一の細胞ベースの球アッセイは、多くの労力を要し、より高価であり、各実験の設定で必要とされない場合があります。メチルセルロース補足マルチセルベース球アッセイは、いくつかの実験的な設定で別の代替を表すことができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
