Protocol
1. Генерация OVCAR-3 человека рак яичников клеток, стабильно трансдуцированную Лентивирусов Содержащие SOX2 регуляторной области Reporter Construct
- Создание лентивирусные частиц от трансфекции HEK 293T-упаковочную линию клеток с корреспондентом конструкции признании нормативно область Sox2, как описано 10,21.
ПРИМЕЧАНИЕ: репортер построить дополнительно содержит дестабилизации домен ProteoTuner Shield System вперед белка флуоресценции tdTomato. Shield1 связывается с доменом дестабилизации тем самым предотвращая протеасомы ухудшить флуоресценции белка 22. - Трансдукции OVCAR-3 клетки с лентивирусов частиц в течение периода времени от 24 ч. После удаления вируса супернатант и промыть клетки забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и культивировали в полной среде (RPMI, дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина).
- 48 ч позже, 10 мкг / мл PuroMYCIN добавляли к культурам и выдерживали в течение 5 дней, чтобы позволить выбор правильной трансдуцированных клеток.
2. Подготовка сортировки клеток и покрытия
- Добавить Shield1 1: 1000 разбавление 24 ч до сортировки клеток. Используйте стабильно трансдуцированные OVCAR-3 клетки без лечения Shield1 в качестве отрицательного контроля (рисунок 1). Аспирируйте носитель из колбы, промыть клетки 1х PBS и Trypsinize клетки с 0,05% трипсин-ЭДТА в течение 3 мин.
- Остановка с помощью трипсина полную среду (смотри выше), рассчитывать количество клеток, центрифуги клетки при 300 мкг при комнатной температуре (15 - 25 ° С) в течение 5 мин.
- Слить супернатант и ресуспендирования клеток тщательно 0,5 - 1 мл стерильной PBS.
- Используйте ячейки фильтра крышку фильтра 40 мкм для получения одного суспензии клеток.
- Отрегулируйте количество клеток до 5 миллионов клеток на мл.
- Подготовка сверхнизкой крепления 96-луночных планшетах с 100 мкл сфер средний (MEGM с добавлением факторов роста, цитокинов и дополнений,B-27, гепарин натрия; или DMEM / F12, дополненной факторами роста, цитокины, и добавки, В-27, гепарина-натри с добавлением или без добавления 1% метилцеллюлозы, смотри также таблицу 1). При желании добавить антибиотики в среде в концентрации 100 U / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, чтобы свести к минимуму риск возможного загрязнения.
- Сортировка ППП + и RFP- клетки в подготовленные 96-луночных планшетах сверху, 1 клетка на лунку (одна ячейка на основе анализа сферы) и 100 клеток на лунку (мульти сферы клеток основе анализов), соответственно. Выполните сортировку по коммерчески доступного клеточного сортера (см Материалы), используя режим Single Cell, отсортируйте установки: 100 μ сопла, давление оболочка 20 фунтов на квадратный дюйм, и выход маски 0, маски чистота 32, фазовой маски 16.
- Оценка эффективности нанесения покрытия путем микроскопом совершение лунки, содержащие клетки (для одной ячейки на основе анализа) и подсчетом числа клеток в отдельных лунках (для нескольких клеток на основе анализа; фиг.2
- Инкубируйте клетки при стандартных условиях в сферах среднего (для состава увидеть шаг 2,6) при 37 ° С и 5% СО 2. Дополнение ежедневно bFGF (20 нг / мл) и EGF (20 нг / мл).
- После одной недели, рассчитывать количество новых сфер опухолевые с помощью стандартного микроскопа с 4-кратным или 10-кратным увеличением и флуоресцентным микроскопом для обнаружения сигнала флуоресценции от интегрированной системы репортера. Граф сферы с диаметром, превышающим 100 мкм, как «больших» сфер и сферы диаметром 50 - 100 мкм, как «малых» сфер (рис 3). Будьте уверены, что вы считаете реальные сферы, а не кластеры клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отдельных клеточных анализов сфера образования легче забить микроскопически после 10 (по сравнению с 7) дней культуры. - Рассчитать долю сферы формирования клеток в RFP + и соответственно RFP- клеток в отдельных анализов на основе клеток (один 96-луночный планшет для каждого отдельного эксперимента) или нескольких клеток-баSED сферы анализы (одна скважина для каждого отдельного эксперимента), представленные Шоу и др. 16
Примечание: Доля сферы образования клеток (%) = (число сфер) / (количество посеянных клеток) × 100
3. Серийные пассажи сфер
- Поместите содержимое каждой лунки в соответствующей стерильную пробирку и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Для многоуровневая ячейка на основе сфер анализов, собрать воедино сферы из одной ямы. Вымойте хорошо 3 - 5 раз PBS и центрифуга 2 мин дольше. Для одиночных клеток на основе сфер анализов, собирать отдельные сферы. Из-за низкой числа клеток, используют 1,5 мл пробирки для центрифугирования и промывки этапов.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА.
- Для достижения оптимального разделения клеток, инкубировать клеточную суспензию при 37 ° С в течение 5 мин в мягкую шейкере. Оптимизация трипсинизации время для вашего клеточной линии к более низкой ставке гибели клеток: если нет большойсферы видна растирают мягко, используя наконечник пипетки на 100 мкл. В случае крупные шарики по-прежнему присутствуют, инкубировать с трипсином еще 3 мин, а затем переходите к шагу тритурационного. В случае одного анализы на основе клеток убедитесь, оптимизировать время для оптимального выхода клеток живых клеток во время стадии обработки трипсином.
- Для инактивации трипсина, добавляют 500 мкл полной среды и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин, в случае отдельных анализов клеток, центрифуги в течение дополнительных 2 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток тщательно сферах среде.
- Используйте ячейки фильтра крышку фильтра 40 мкм, чтобы получить один-клеточной суспензии.
- В случае использования RFP + и RFP- клеток в нескольких клеточных bassed анализов, оценить процент флуоресцирующих клеток в каждую лунку после ресуспендирования с помощью проточной цитометрии анализа.
- Для последовательных replating анализов отдельных клеток, семян 1 клеток на лунку в новый ультра низкой крепления 96-луночного планшета, полученных, как описано выше, С одной отдельной сфере, семян около 20 отдельных скважин. Для replating анализов на основе клеток нескольких первичных сфер, семена клеток, полученных из одной скважины первичных сфер в новый 96-луночного планшета и подсчитать число клеток на следующий день с помощью микроскопа.
- Оценка доли сферы клеток, образующих в средних сфер анализов, используя формулу, описанную в шаге 2.11.
4. Результат анализа
- Анализ результатов экспериментов, проведенных в независимых трижды и использовать T-Test Двусторонние Студенческая проанализировать нормально распределенных значений и иным Манна-Уитни тесты для статистического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В обычных сфер анализов, почти 40% ЗП + OVCAR-3 клеток против 20% RFP- клеток привело к индивидуальной сфере опухоли в первичных сфер анализа (рис 4а). Кроме того, сферы, образованные ППП + клеток были больше по размеру, чем те, которые образованы путем RFP- клеток.
При посеве в отдельных клеточных анализов, RFP + клетки образуются также больше сфер, чем RFP- клеток, что подтверждает результаты выше. Тем не менее, существует тенденция к генерации меньшего количества сфер в высевали в единый по сравнению с несколькими клеток на основе анализа (фиг.4А, В), что указывает, что в этом анализе формирования сферы могут быть смещены с помощью технических артефактов, таких как механическое слияние сферы или диссоциации в неприлипающими культуральной среде.
Для дальнейшего изучения этих аспектов, мы сравнили влияние плотности клеток покрытия на формирование сферах. Мы покрытием клеток с использованием предельного разбавления от 1000 клеток на 1 клетку в яме в 96Ну пластины и обнаружили, что номера развивающихся сфер в значительной степени зависят от количества изначально посеянных клеток. Удивительно, но более высокие количества сфер подсчитывали с меньшим количеством плакированных клеток в обеих MGEM и DMEM / F12 на основе информации, демонстрируя, что на самом деле обшивки модальности высоко Результаты уклон в этом анализе (фиг.5). В противоположность этому, когда клетки иммобилизовали добавлением 1% метилцеллюлозы в DMEM / F12 на основе сфер среднего 23,24 эффективность формирования сферы в основном зависит от плотности клеток.
Чтобы изучить влияние условий сферы культуры на свойства CSC, мы проанализировали процент клеток, экспрессирующих красный флуоресцентный сигнал после 7 дней инкубации в анализе сферах. Мы обнаружили, что в нескольких клеточных основе сфер культур примерно 35% клеток от RFP + сфер утратили красный флуоресцентный сигнал после семи дней культивирования (6А), предполагая, что они имеют undergодно дифференцирование, в то время как 65% сохранили RFP + сигнал с предложением самообновлению мощности. В отличие от этого, клетки из сфер, полученных от первоначально RFP- клеток оставались RFP отрицательный (фиг.6А), что указывает, что они не могут восстановить потенциал стволовых клеток в этих условиях.
Флуоресцентная микроскопия осуществляется на сферах, полученных от отдельных клеток подтвердили эти результаты, показывающие, что отдельные сферы происходит RFP + клеток, содержащихся как RFP + и RFP- клетки, а сферы, полученные из RFP- клеток оставалось отрицательным для красного сигнала.
Аналогичные результаты были получены в replating анализах обоих условий.
Рисунок 1. Workflow лентивирусных трансдукции, выбор и сортировка RFP + и RFP- клеток. После лентивирусным преобразования и положительного отбора успешно трансдуцированных клеток через пуромицин воздействия, RFP- и RPF + клетки сортируются по FACS на отдельные лунки 96-луночного планшета в сферах среды. Для многоуровневая ячейка на основе сфер анализов, 100 клетки помещают в одну лунку. Покрытие эффективность оценивается с помощью микроскопа, выполняемых после сортировки. Сферы были забиты под микроскопом после семи до десяти дней, распадается на отдельные клетки, а также анализ с помощью проточной цитометрии и пересевали во вторичные сферах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Визуализация отсортированного RFP + и RFP- клеток после металлизации. Single ППП + и RFP- клеток, отсортированных в каждую лунку 96-луночного планшета анализируются для правильного покрытия посредством использования (флуоресцентный микроскоп).w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Формирование Рисунок 3. Анализ формирования сферы, в отдельных клеточных анализов. Сферы анализируется после семи до десяти дней. () Большой (диаметр> 100 мкм) и (В) маленький (диаметр 50 - 100 мкм). Сферы отличаются микроскопически в зависимости от размера Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Эффективность опухоли сферы образования из ЗП +и RFP- OVCAR-3 клетки в нескольких по сравнению с сфер анализов отдельных клеток на основе. Сравнение первичной и вторичной эффективности сферы от OVCAR-3 клеток, анализировали в Multi (А) по сравнению с Single Cell на основе сфер анализов (B). Пожалуйста, нажмите здесь для просмотра большего размера этой цифры.
Рисунок 5. Сотовый покрытие плотность сильно влияет сфера насчитывает от OVCAR-3 клеток в нескольких клеток на основе сфер анализа, проведенного в жидкости, но не в метилцеллюлозных дополнить культур. Использование различных плотностей клеток и питательных сред были зарегистрированы в литературе для рака яичников Сферы анализов. Для анализа возможных погрешностей, вносимых этих переменных, клетки высевают на differeNT плотности в 200 мкл различных сфер культуры средств массовой информации (MGEM, DMEM / F12 со всеми дополнениями как указано в разделе протокола или DMEM / F12 со всеми дополнениями и содержащих 1% метилцеллюлозы) и формирование сфера забил после 7 дней (A) , Показано в позиции (В) являются микроскопические фотографии клеток высевали при различных плотностях, взятых через один день после посева в DMEM / F12 сферы культуральную среду без метилцеллюлозы. Обратите внимание на клеточные кластеры возникающих при высокой клеточной плотности, в отличие от отдельных клеток видели в низких пластин плотности. Масштабная линейка для картин:. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Анализ ППП сигнала в сферах опухолевых формируется из ППП + и respectivЭли RFP- OVCAR-3 клетки () методом проточной цитометрии анализа для RFP сигнала в диссоциированных сферах, полученных из клеток RFP + и RFP- (многоуровневая ячейка на основе сферах анализ).; (B) микроскопия сфер, полученных из ППП + и RFP- клеток (одна ячейка на основе сферы анализа) показывает гетерогенный RFP сигнал в сферах, полученных из ЗП +, но не от RFP- клеток. Фотографии были сделаны на 7 дней для обычных сфер и 10 день для одиночных клеток на основе анализа сферы. Обратите внимание на больший размер сфер, полученных из ППП + предполагаемых ЦОНов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Яичника человека источником раковых клеток | Щелочной среде | Дополнения | Авторов |
| OVCAR-3, CaOv-3, первичный материал | MEGM | 20 нг / мл rEGF, 20 нг / мл bFGF, В-27, 4 мкг / мл гепарина, гидрокортизон, инсулин (SingleQuot комплект) | Bareiss и др. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл rEGF, 10 нг / мл bFGF, 12 нг / мл LIF, 0,3% БСА | Ли Ма и др. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 мкг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 2% B-27, 0,4% БСА | Haiwei Ван и др. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 мкг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 10 нг / мл bFGF, 2% B-27, 1 нг / мл гидрокортизона | Yong-рую Du и др. |
| A2780, первичный материал | DMEM / F12 | 5 мкг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 10 нг / мл bFGF, 0,4% БСА | Т. Сян и др. |
| Основной материал | DMEM / F12 > | 5 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл rEGF, 10 нг / мл bFGF, 12 нг / мл LIF, 0,3% БСА | Те Лю и др. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 нг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 20 нг / мл bFGF, 2% B-27 | Soritau и др. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 мг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 20 нг / мл bFGF, 2% B-27 | MF Ши и др. |
| Основной материал | DMEM / F12 | 5 мкг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF, 10 нг / мл bFGF, 0,4% БСА | Шу Чжан и др. |
| Основной материал | EBM-2 или X-VIVO | 5 мкг / мл инсулина, 20 нг / мл rEGF | Илона Kryczek и др. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 нг / мл rEGF, 20 нг / мл bFGF, В-27, 4 мкг / мл гепарина | Dongming Лян и др. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сферы культуры являются широко используемый метод для анализа стволовых клеток рака потенциал и обогащения стволовых клеток, как в широком диапазоне человеческих опухолевых клетках 15,25,26. В этих условиях культивирования, раковые клетки, которые не имеют самообновления, как ожидается, способность дифференцировать и в конечном итоге подвергаются клеточной гибели. Хотя они могут сначала образуют клеточные кластеры или даже опухоли сферы, особенно в начальных анализов, они не в состоянии поддерживать сферу формирования способностью на последовательный replating из-за отсутствия самообновляющихся свойствами. Сферы анализы используются в качестве суррогатных анализов для выявления CSCs и оценить их частоту в целом популяциях опухолевых клеток.
Тем не менее, значительная вариабельность можно наблюдать между сферами анализами, выполненными следующие различные опубликованные протоколы 5,10,27-35 (таблица 1). В нашей лаборатории мы ранее опубликована образование сферу из яйцеклеток карциномы человека с помощью MEGM с добавлением B-27, BFGF, гепарин и SingleQuot TM (содержащий инсулина, rEGF и гидрокортизон). Другие лаборатории используют всю DMEM / F12 среде, а некоторые добавляют только B-27 и rEGF. В этом докладе, мульти сферы на основе клеток пробирного OVCAR-3 клетки, поэтому выполняется с использованием различных условий. Использование MEGM или DMEM / F12 со всеми добавок никаких существенных различий в формировании сферы не наблюдалось в этих клетках (Фиг.5А). Кроме того, некоторые лаборатории полагают, что EGF и FGF может быть быстро деградирует и установили протоколов Добавление этих факторов роста в день в среду. Поэтому по сравнению сфер тесты, выполненные в среде, в который был добавлен только EGF и FGF в начале сфер анализов с ежедневной добавкой EGF и FGF в клеточной культуре, и мы находим этих анализов с получением эквивалентных результатов в OVCAR-3 клеток (данные не показаны), что свидетельствует о том, что дорого и трудоемко в день добавок с EGF и FGF не всегда может быть необходимым. Ли эти результатыприменимы к клеткам от других яичников раковых клеток линий или первичных проб, или при различных экспериментальных условиях остается определить.
Тем не менее, мы наблюдали значительное смещение в количестве забитых шаров, введенных еще проверяемой переменной, плотность клеток покрытия. Удивительно, колодцы затравку меньшее число клеток показали более высокие цифры сфер. Ограничение подвижности клеток на 1% метилцеллюлозы в результате одной и той же эффективности формирования сферы, независимой от количества изначально посеянных клеток. Эти результаты показывают, что клетки слипания и сфера слияние или классификация может произойти изменение числа сферы и приводит к неточным результатам в нескольких клеточных основе сфер анализов. Когда клетки высевают при правильной плотности, мульти анализы на основе клеток, однако, привести к результатам, а сопоставимых с данными, собранными в одну ячейку на основе анализа сферы (рисунок 4). Для дальнейшего изучения этих результатов мы сравнили с одним и несколькими на основе клетоканализ с использованием карциномы яичников клетки, отсортированные в предполагаемых ЦОНов по недавно опубликованной лентивирусный RFP выражения репортера системы регуляторной области SOX2 10. Действительно, оба анализы подтвердили повышенную первичную и вторичную сферу, образующую емкость ППП + по сравнению с RFP- клеток (4А, В). Важно отметить, что более высокие числа сфер наблюдается с ППП + клеток не было связано с более высокой пролиферативной активности Sox2 клеток, экспрессирующих (данные не показаны), который находится в соответствии с предыдущими результатами, показывающими, что индукция SOX2 способствует формированию сферы и в естественных условиях туморогенности без ускорения прогрессия клеточного цикла 10.
Взятые вместе, одиночные сферы на основе клеток Анализы более трудоемким и дорогим, но они приводят к более точных данных, что также подтверждается высокой воспроизводимости результатов между опытами. Так плотности покрытия высоко воздействий приводит в нескольких клеток-BASред подвеска сферы анализы, заранее титрование адекватной плотности покрытия требуется для каждого типа опухолевых клеток перед анализом образование сферу с помощью этих анализов. С другой стороны, более точные единичные анализы на основе клеток могут быть использованы заранее, или метилцеллюлоза добавки для повышения точности результатов за счет уменьшения механических артефактов. Если формирование сфера сравнению между условиями, где генетическая модификация или медикаментозное лечение может серьезно изменить жизнеспособности клеток, тем самым уменьшая плотность клеток, одноклеточные основе анализов сфера может быть обязательным, чтобы избежать ложных положительных результатов.
Таким образом, при соответствующих экспериментальных условиях как многоуровневая ячейка на основе сферы анализа и одного сферы на основе клеток для анализа могут указывать на различия в сфере потенциала между различными популяциями клеток (стволовых клеток и без стволовых клеток). Тем не менее, мульти сферы на основе клеток анализы, которые обычно выполняются в жидких культурах, более восприимчивы к электроннойrrors введенные опытно-конструкторских через плотности покрытия. Дополнение метилцеллюлозы (1%) до нескольких клеточных анализов может ограничить артефактов, связанных с клеточной слипания и сферы синтеза. Основываясь на этих данных, мы рекомендуем одноклеточные основе сферы анализы должны быть выполнены, если детальный анализ титрования не были выполнены первоначальные и негативное влияние экспериментальных условиях на жизнеспособность клеток и тем самым плотность клеток была исключена. Тем не менее, единичные сферы на основе клеток анализы более трудоемким и более дорогим, и, возможно, не потребуется в каждой экспериментальной установки. Метилцеллюлозы с добавкой многоуровневая ячейка на основе сферы анализы могут представлять другую альтернативу в некоторых экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
