Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52259

Protocol

OVCAR-3 insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde 1. Üretim Stabil Lentivirüsler Sox2 düzenleyici bölge, haberci yapı İçeren kalıt

  1. Tarif 10,21 bir Sox2 düzenleyici bölgesini tanıyan bir raportör yapısı ile HEK 293T paketleme hücre hattı transfekte edilmesiyle lentiviral parçacıkları oluşturur.
    Not: raportör yapısının ayrıca ileride tdTomato floresan protein ProteoTuner kalkan sisteminin dengesizleşmesine alanı içerir. Shield1 böylece floresan proteini 22 aşağılamak için proteasom engelleyen istikrarsızlaştırma etki bağlanır.
  2. 24 saatlik bir süre boyunca, lentiviral parçacıklarla OVCAR-3 hücreleri nakletmek. Daha sonra, viral süpernatant kaldırmak ve tam ortamda fosfat tamponlu tuz (PBS) ve kültürlenmiş hücreleri yıkayın (RPMI, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 100 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş).
  3. 48 saat sonra, 10 ug / ml puromycin kültürlere ilave edildi ve uygun bir şekilde kalıt aktarımlı hücrelerin seçimine izin vermek için 5 gün için muhafaza edilmiştir.

Hücre Sorting ve Kaplama 2. Hazırlık

  1. 1 at Shield1 ekleyin: hücre sıralama öncesinde 1,000 seyreltme 24 saat. Negatif kontrol olarak Shield1 tedavisi (Şekil 1) bir stably transduse OVCAR-3 hücreleri kullanır. Şişeden aspire ortam, 3 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile hücreler 1 x hücrelerin PBS ile yıkayın ve trypsinize.
  2. 5 dakika - (25 ° C 15) oda sıcaklığında 300 xg'de hücre sayıları, santrifüj hücreleri saymak, (yukarıya bakınız) tam orta kullanarak tripsin durdurun.
  3. Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri dikkatli bir 0,5-1 ml steril PBS.
  4. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın.
  5. Ml başına 5000000 hücrelere hücre sayımı ayarlayın.
  6. , MEGM büyüme faktörleri, sitokinler ve ek takviye (100 ul ortam ultra düşük bağlanma, 96 gözlü levhalar küreler hazırlanmasıB-27, heparin-sodyum; ya da büyüme faktörleri, sitokinler ve ek B-27, ya da% 1 metilselüloz eklenmeden heparin-sodyum ile desteklenmiş DMEM / F12), aynı zamanda Tablo 1 e bakınız. İsteğe bağlı olarak mümkün kontaminasyon riskini en aza indirmek için, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin bir konsantrasyonda ortam antibiyotik ekleyin.
  7. Sıralama TTT + ve yukarıda hazırlanan 96 oyuklu plakalara RFP- hücreleri, oyuk başına 1 hücre (tek hücre bazlı küreler deneyi), sırasıyla oyuk başına 100 hücre (çoklu hücre bazlı küreler deneyi). 100 μ meme, kılıf basıncı 20 psi ve verim maskesi 0, saflık maskesi 32, faz maskesi 16: Tek hücreli modu, kurulum sırala kullanarak (Malzeme) sıralama ticari olarak temin hücre sıralayıcı gerçekleştirin.
  8. Mikroskopik olarak (tek bir hücre bazlı deney için) hücreler içeren kuyu puanlama ile ve çoklu hücre bazlı tahlilde (bireysel çukurlarındaki hücre saymak suretiyle kaplama verimlilik değerlendirmek; Şekil 2,
  9. Orta alanda standart koşullar altında kuluçkaya bırakılır, 37 ° C'de ve% 5 CO2 (bileşim için adım 2.6). Günlük bFGF (20 ng / ml) ve EGF (20 ng / ml), Supplement.
  10. Bir hafta sonra, entegre muhabiri sisteminden floresan sinyal tespit etmek 4X veya 10X büyütme ve floresan mikroskop ile standart mikroskop kullanılarak tümör küreler ortaya çıkan numaralarını saymak. "Küçük" küreler olarak 100 mikron (Şekil 3) - çapı 50 ile "büyük" küreler olarak 100 mikron aşan bir çapa sahip küreler ve küreler Kont. Gerçek küreler saymak ve kümeler hücre değil emin olun.
    NOT: Tek hücre bazlı deneylerde küre oluşumu kültür 10 (7 karşı) gün sonra mikroskopik olarak puan daha kolaydır.
  11. TTT + küre-oluşturucu hücre ve tek bir hücre bazlı deneylerde, sırasıyla RFP- hücreleri (her bir deney için, bir 96-yuvalı plaka) ve çok hücre-ba oranını hesaplamakShaw ve arkadaşları tarafından sunulan sed küreler deneyler (her bir deney için, bir oyuk). 16
    Not: küre oluşturan hücrelerin (%) = (küre sayısı) / (tohumlanmıştır hücre sayısı) oranı 100 x

Kürelerin 3. Seri Pasajlanması

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de uygun bir steril tüp ve santrifüj her bir oyuğa içeriğini yerleştirin. Çok hücre tabanlı küreler tahliller için, birlikte iyi biri küreler toplamak. PBS ve uzun santrifüj 2 dakika ile 5 kez - KUYU 3 yıkayın. Tek hücre tabanlı küreler tahliller için, bireysel küreler toplamak. Nedeniyle hücrelerin düşük sayıda, santrifüjleme ve yıkama adımları için 1.5 ml tüpler kullanmaktadır.
  2. % 0.05 tripsin-EDTA, 200 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
  3. Optimal hücre ayrılmasını sağlamak amacıyla, yumuşak bir çalkalayıcı içinde 5 dakika için 37 ° C 'de bir hücre süspansiyonu inkübe edilir. Alt hücre ölümü oranı cep hattı için trypsinization zaman Optimize: hiçbir büyük olursaküreler yavaşça 100 ul pipet kullanarak görünür çiğnemek olduğunu. Durumunda büyük küreler, hala mevcut başka bir 3 dakika tripsin ile kuluçkaya ve daha sonra toz haline getirme adıma geçin. Tek durumunda hücre tabanlı deneyler trypsinization adımı sırasında canlı hücrelerin optimum hücre verimi için zaman optimize etmek emin olun.
  4. Tripsin inaktive tek hücre tahlilleri, ilave bir 2 dakika boyunca santrifüj halinde, 10 dakika boyunca 300 x g'de 500 ul komple ortam ve santrifüj ekleyin.
  5. Küreler orta dikkatle süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
  6. Bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın.
  7. TTT + ve çoklu hücre-bassed deneylerde RFP- hücrelerin kullanılması durumunda, analiz akış sitometresi aracılığı ile her bir göze daha sonra süspansiyon içinde flüoresan hücrelerin yüzdesini değerlendirmek.
  8. Yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırlanan tek hücre seri şarjı tahlilleri, tohum oyuk başına 1 hücre, bir ultra düşük bağlanma, 96 oyuklu bir plakaya için. Tek bir kişi alandan yaklaşık 20 ayrı kuyu tohum. Çoklu hücre bazlı primer kürelerin şarjı tahlilleri için, tohum hücreleri yeni bir 96 oyuklu bir plakaya birinci küre bir kuyudan elde edilen ve mikroskopi ile hücre sayıları ertesi gün sayısı.
  9. Adım 2.11 tarif edilen formüle göre ikincil küreler tahlillerinde küre oluşturan hücrelerin oranını değerlendirmek.

4. Sonuç Analizi

  1. Bağımsız üçlü olarak yapılan deneylerden elde edilen sonuçları analiz ve iki taraflı Student t-testi istatistiksel analiz için normal dağılıma değerleri ve aksi Mann-Whitney-Testleri analiz için kullanabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geleneksel küreler deneylerinde, RFP + OVCAR-3 hücrelerinin genel RFP- hücrelerin% 20, yaklaşık% 40, birincil küreler deneyi (Şekil 4A) 'de tek bir tümör alanına yol açmıştır. Ayrıca, RFP + hücreleri tarafından oluşturulan küreleri RFP- hücrelerden oluşan daha büyük boyutta olmuştur.

Tek bir hücre bazlı deneylerde kaplama olduğunda, TTT + hücreleri aynı zamanda, yukarıda sonuçları teyit RFP- hücrelerden daha fazla küreler oluşturulur. Bununla birlikte, çok hücre bazlı tahlilde (Şekil 4A, B) göre tek kaplanmıştır başına daha az sayıda küreler üretimine doğru bir eğilim bu deney küre oluşumunda, mekanik küre füzyon ya da ayrışma gibi teknik eşya boyunca eğimli olabilir belirten orada yapışmayan bir kültür ortamında.

Ayrıca bu yönlerini keşfetmek için, biz küreler oluşumuna hücre kaplama yoğunluğu etkisi karşılaştırıldı. Biz, 96, oyuk başına 1 hücre 1000 hücrelerinden sınırlayıcı seyreltme kullanılarak hücrelerin kaplamaeh plakaları ve gelişmekte olan küreler sayıları başlangıçta kaplama hücre sayısı son derece bağımlı olduğunu gördük. Şaşırtıcı bir şekilde, kürelerin yüksek sayılar gösteren MGEM ve DMEM / F12-esaslı ortam hem de kaplama daha düşük sayıda hücre sayılmıştır ki bu deneyde gerçekten kaplama yöntemleri yüksek eğilim sonuçlar (Şekil 5). Hücreler DMEM / F12-tabanlı küreler% 1 metilselüloz ekleyerek immobilize edildi aksine, orta 23,24 küre oluşumu etkinliği hücre yoğunluğu çoğunlukla bağımsız oldu.

CSC özelliklerine küreler kültür koşullarının etkisini araştırmak için, küreler deneyde kuluçkalamadan 7 gün sonra, kızıl flüoresans sinyali ifade eden hücrelerin yüzdesini analiz ettik. Biz onlar düşündüren, çok hücre bazlı küreler kültürlerde RFP + kürelerden hücrelerin yaklaşık% 35 kültür (Şekil 6A) yedi gün sonra onların kırmızı floresan sinyali kayıp bulundu undergbir farklılaşma, ise% 65 kendini yenileme kapasitesini düşündüren bir RFP + sinyal korudu. Bunun aksine, başlangıçta RFP- hücrelerden üretilen kürelerden hücreler bu koşullar altında, kök hücre potansiyeli yeniden tesis edilemez olduğunu belirten TTT negatif (Şekil 6A) kalmıştır.

Tek hücrelerden üretilen küreler üzerinde yapılan floresan mikroskopi tek küreler RFP türetilmiş + RFP- hücrelerden türetilmiş küreler kırmızı sinyal için negatif kalırken hücreler RFP + ve RFP- hücreleri hem içerdiği gösteren bu sonuçlar doğruladı.

Benzer sonuçlar, her iki şart şarjı deneylerde gözlenmiştir.

Şekil 1,
Şekil lentiviral transdüksiyon, seçim 1. İş Akışı ve lentiviral transdüksiyon ve olumlu seçimden sonra. RFP + ve RFP- hücrelerin sıralama puromisin pozlama, RFP- ve RPF + hücreleri ile başarılı bir şekilde transdüksiyona uğramış hücreler küre ortamında 96 oyuklu bir plakanın her bir gözeneğine içine FACS ile sıralanır. Çoklu hücre bazlı küreler tahlilleri için, 100 hücre, bir yuva içine yerleştirilir. Kaplama verimliliği sıralama sonra yapılan mikroskobu ile değerlendirilir. Küreler, yedi ile on gün sonra mikroskobu ile attı akış sitometri ile analiz ve ikincil küreler içine replated tek hücreler içine ayrışmış edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Kaplama. Tek RFP + ve her bir oyuğa, 96 oyuklu bir plakaya kriteri RFP- sonra hücreler sıralanmış TTT + ve RFP- hücrelerin Şekil 2. görüntülenmesi, (floresan) mikroskobu ile doğru kaplama için analiz edilir.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3,
Tek bir hücre bazlı deneylerde küreler oluşum Şekil 3. Analiz. Küreler formasyonu yedi ila on gün sonra analiz edildi. (A) Büyük (çap> 100 mikron) ve (B) küçük (50 çap - 100 mikron). Küreler mikroskobik boyutuna göre ayırt edilir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 4,
Tümörün Şekil 4. Verimlilik RFP gelen oluşumunu küreler +ve RFP- OVCAR-3, tek bir hücre-esaslı tahliller küreler (B) göre, çok (A) 'de analiz edilmiş olarak OVCAR-3 hücreleri, birincil ve ikincil alan verimliliği tek hücre bazlı tahlillerde küreler karşı çok. Karşılaştırma hücreler. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 5,
Şekil 5. Hücre kaplama yoğunluğu güçlü etkiler küre sıvı yapılan çoklu hücre bazlı küreler deneyde OVCAR-3 hücrelerinin sayar, ancak farklı hücre yoğunlukları ve büyüme ortamı olup metilselüloz takviye kültürlerde. Kullanımlar yumurtalık kanseri için literatürde bildirilmiştir tahlilleri küreler. Bu değişkenler tarafından tanıtıldı olası önyargıları analiz etmek, hücreler differe olarak ekilirFarklı küreler kültür ortamı 200 ul (MGEM, tüm takviyeleri ile protokol bölümünde, ya da DMEM / F12 ayrıntılı ve% 1 metilselüloz içeren tüm takviyeleri ile DMEM / F12) ve küre oluşumu 7 gün sonra atılırsa nt yoğunlukları (A) . DMEM / F12 içinde kaplama bir gün sonra alınan farklı yoğunluklarda kaplama hücrelerinin mikroskop görüntü (B) 'de gösterilmiştir metilselüloz olmayan bir kültür ortamı küreler. Düşük yoğunluklu tabaklarda görülen tek hücre karşı yüksek hücre yoğunluğunda ortaya çıkan hücre kümeleri edin. Resimler için Ölçek çubuğu:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 6,
Tümör alanlarda sinyal RFP + ve respectiv oluşan Analiz RFP Şekil 6.ely RFP- OVCAR-3 hücreleri (A) RFP + ve RFP- hücrelerinden elde edilen ayrışmış alanlarda RFP sinyali için sitometri analizi (çoklu hücre bazlı küreler tahlil) Akış.; TTT + ve RFP- hücreleri (tek hücre bazlı küreler deneyi) elde edilen küreler (B) Mikroskobi heterojen RFP RFP türetilen alanlarda sinyalin + ancak RFP- hücrelerden ortaya koymaktadır. Resimlerde bir hücre bazlı küre deneyleri için geleneksel küreler ve gün 10 7. günde alınmıştır. RFP + varsayılan CSCS türetilen kürelerin daha büyük boyutta Not. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İnsan yumurtalık kanseri hücre kaynağı Temel ortam Takviyeler Yazarlar
OVCAR-3, Caov-3, birincil malzeme MEGM 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparin, hidrokortizon, insülin (SingleQuot kiti) Bareiss ve diğ.
SKOV3 DMEM / F12 / Ml insülin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml, LİF,% 0.3 BSA, 5 ug Li Ma ve diğ.
A2780 DMEM / F12 5 ug / ml insülin, 20 ng / ml rEGF,% 2 B-27,% 0.4 BSA Haiwei Wang ve diğ.
SKOV3 DMEM / F12 5 ug / ml insülin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF,% 2 B-27, 1 ng / ml hidrokortizon Yong-Rui Du ve ark.
A2780, birincil malzeme DMEM / F12 5 ug / ml insülin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF,% 0.4 BSA T. Xiang ve diğ.
Birincil malzeme DMEM / F12 > / Ml insülin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml, LİF,% 0.3 BSA, 5 ug Te Liu ve ark.
MLS DMEM / F12 10 ng / ml insülin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF,% 2 B-27 Soritau ve diğ.
3AO DMEM / F12 1 mg / ml insülin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF,% 2 B-27 MF Shi ve ark.
Birincil malzeme DMEM / F12 5 ug / ml insülin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF,% 0.4 BSA Shu Zhang ve ark.
Birincil malzeme EBM-2 ya da X-VIVO 5 ug / ml insülin, 20 ng / ml rEGF Ilona Kryczek ve diğ.
OVCAR-3 MEGM 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparin Dongming Liang ve ark.
"ontent> önceki raporlarda yumurtalık küreleri tahliller için kullanılan farklı hücre kaynaklarından (hücre hatları ve birincil hasta-türetilmiş dokusu), medya ve takviyeleri 1. örnekler Tablo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Küreler kültürleri kanser kök hücre potansiyeli tahlil, insan tümör hücrelerinin 15,25,26 geniş bir kök-benzeri hücreler için zenginleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu kültür koşulları altında, kendini yenileme yeteneğinden yoksun kanser hücreleri ayırt etmek ve en sonunda hücre ölümü beklenmektedir. Başlangıçta hücre kümeleri veya özellikle ilköğretim tayinlerde bile tümör küre oluşturabilir rağmen, onlar yüzünden kendini yenileyen özellikleri eksikliği seri şarjı üzerine küre oluşturan yeteneğini sürdürmek mümkün değildir. Küreler deneyler CSCS tespit ve bütün tümör hücresi popülasyonu içinde kendi frekansını değerlendirmek için temsili tahliller olarak kullanılır.

Bununla birlikte, önemli bir değişkenlik farklı yayınlanmış protokollere 5,10,27-35 (Tablo 1), aşağıdaki küreler tahliller arasında gerçekleştirilir gözlenebilir. Laboratuvarımızda, daha önce B-27 ile takviye MEGM kullanılarak insan yumurtalık kanseri hücrelerinden küre oluşumunu yayınladıBFGF, heparin ve SingleQuot TM (insülin, rEGF ve hidrokortizon içeren). Bazıları sadece B-27 ve rEGF eklerken Diğer laboratuarları, tüm DMEM / F12 Orta kullanın. Bu raporda, OVCAR-3 hücrelerinin de çok hücreye dayalı küreler tahlil bu nedenle, farklı koşullar kullanılarak yapıldı. Küre oluşumunda önemli bir fark bu hücrelerin (Şekil 5A) gözlendi tüm takviyeleri ile MEGM veya DMEM / F12 kullanma. Buna ek olarak, bazı laboratuvarlar EGF ve FGF hızla bozulmuş olabileceğini iddia ve orta günlük bu büyüme faktörleri ekleyerek protokolleri kurduk. Bu nedenle, EGF ve FGF hücre kültürüne günlük EGF eklenmesi ve FGF küreler deneyleri başlangıcında sadece ilave edildiği bir ortamda gerçekleştirilir küreler tahlilleri göre ve OVCAR-3 hücrelerinin de denk sonuçlar elde etmek için bu deneyleri bulmak EGF ve FGF pahalı ve zahmetli günlük takviyesi her zaman gerekli olmayabilir göstermektedir (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuçlar olsunDiğer yumurtalık kanseri hücre kuşakları ya da birincil örneklerinden veya farklı deneysel koşullar halinde hücrelere uygulanabilir tespit edilmesi gerekmektedir.

Ancak, başka bir test değişken, hücre kaplama yoğunluğu ile tanıtıldı attı küre sayısında önemli bir önyargı gözlendi. Daha düşük sayıda hücre kürelerin yüksek sayıda görülmesine Şaşırtıcı bir şekilde, kuyu tohumlanır. % 1 metilselüloz ile sınırlandırılması hücre hareketliliği, ilk kaplama hücrelerin sayısından bağımsızdır küre oluşumu, aynı verimi ile sonuçlanmıştır. Bu sonuçlar, hücre topaklanma ve küre füzyon ya da parçalanma küre numaraları değiştirme ve çoklu hücre bazlı küreler deneylerde yanlış sonuçlara yol oluşabilir öneririz. Hücreler uygun bir yoğunlukta plakalanır, çoklu hücre bazlı deneyler, ancak tek bir hücre bazlı küre deneylerde toplanan verilerin oldukça benzer sonuçlar (Şekil 4) yol açar. Ayrıca bu sonuçları araştırmak için biz tek ve çoklu hücre bazlı göreBir Sox2 düzenleyici bölge 10 için bir süre önce yayınlanan lentiviral RFP ifade muhabiri sistemi ile varsayılan CSCS ayrılır yumurtalık kanseri hücreleri kullanarak tahliller. Aslında, her iki deneyler, RFP geliştirilmiş birincil ve ikincil alan oluşturma kapasitesi teyit + RFP- hücrelerine karşın (Şekil 4A, B). Daha da önemlisi, TTT + hücreleri gözlenen kürelerin yüksek sayılar Sox2 uyarılmasının gösteren önceki sonuçlarla uyumludur Sox2 ifade eden hücrelerin yüksek çoğalma kapasitesine (veriler gösterilmemiştir), bağlı olmayan hızlandırıcı olmayan küre oluşumunu ve in vivo tümöre neden olarak teşvik hücre döngüsü ilerlemesi 10.

Birlikte ele alındığında, bir hücre bazlı deneyler, küreler daha zahmetli ve pahalıdır fakat, aynı zamanda deney sonuçları arasında yüksek tekrarlanabilirliği ile teyit edilir, daha doğru veri ile sonuçlanır. Çok hücreli-bas kaplama yoğunluğu yüksek etkiler sonuçları yanaed süspansiyon deneyleri, yeterli kaplama yoğunluğunun belirgin titrasyon bu deneyler kullanılarak küre oluşumunu değerlendirilmesinden önce, her bir tümör hücresi türü için gerekli olan küreler. Seçenek olarak ise, daha hassas bir hücre bazlı deneyler, açık kullanılabilir, ya da metilselüloz takviyesi mekanik kusurları azaltmak sonuçlarının hassasiyetinin geliştirilmesi için. Genetik modifikasyon veya ilaç tedavisi ciddi ve böylece hücre yoğunluğu azalan, hücrelerin canlılığını değiştirebilir nerede küre oluşum koşulları arasında karşılaştırıldığında ise, tek hücre tabanlı küre deneyleri yanlış pozitif sonuçları önlemek için zorunlu olabilir.

Özet olarak, uygun bir deney koşulları altında çok hücreye dayalı küreler deneyi ve bir hücre bazlı deney, küreler, her iki farklı hücre popülasyonlarında (sap ve non-kök hücre) ile küre gerilim farklarını gösterebilmek için, bulunmaktadır. Ancak, genel olarak, sıvı kültürler içinde gerçekleştirilmiştir çok hücre bazlı deneyler, küreler e karşı daha hassastırkaplama yoğunluğu ile deney tasarımı ile tanıtıldı rrors. Çoklu hücre bazlı deneylere metilselüloz (% 1) ilavesinin kümelenmesini ve küre füzyon hücre ile ilgili eser sınırlayabilir. Bu verilere dayanarak, biz detaylı titrasyon analizleri hücre canlılığı üzerindeki deneysel koşullar ayarlıyoruz ve olumsuz etkilerini yapılmıştır ve böylece hücre yoğunluğu ekarte edilmiş olmadıkça, tek hücre tabanlı küreler tahliller yapılabilir öneririz. Bununla birlikte, tek bir hücre bazlı deneyler, küreler daha zahmetli ve fazla pahalı ve her deneysel ortamda gerekli olabilir. Metilselüloz-takviye edilmiş çok hücre bazlı küreler deneyler, deneysel ortamlarda başka bir alternatif de sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-attachment plate Corning 3474
MEGM Lonza CC-3151
Insulin Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
Hydrocortisone Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Sigma E9644 end concentration: 20 ng/ml
FGF PeproTech 100-18B end concentration: 20 ng/ml
B-27 Invitrogen/ Gibco 17504-044 end concentration: 1X
Heparin-Natrium-25000 IE Ratiopharm N68542.02 dilution 1:1,000
Pen/Strep Gibco 15140-122
FCS Gibco 10500-064
RPMI 1640 Gibco 21875-034
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Dulbecco’s PBS (1X) Gibco 14190-094
Shield1 Clontech 632189 dilution 1:1,000
DMEM/F12 Gibco 21041-025
DMEM/F12 (powder) Gibco 42400-010
Methyl cellulose Sigma M0387
Puromycin dihydrochloride Applichem A2856
Cell sorter BD Aria III cell sorter
FACS analyser BD Accuri c6 flow cytometer
Microscope Olympus IX50 Osiris

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).

Tags

Tıp Sayı 95 Kanser kök hücreler tahlil yumurtalık tek bir hücre Sox2 küreler yumurtalık kanseri
Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. More

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. J. Vis. Exp. (95), e52259, doi:10.3791/52259 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter