Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52260

Protocol

OPMERKING: Alle protocollen waarbij levende dieren moeten worden beoordeeld en door een Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd en moet volg officieel goedgekeurde methoden voor de verzorging en het gebruik van de proefdieren. Alle secties worden uitgevoerd met steriele techniek op een schone laminaire stroming bank. Handschoenen en een masker desgewenst worden gedragen tijdens deze procedure.

1. Dissectie van de embryonale Mouse Inner Ear

  1. Instellen voor orgaan van Corti explantkweken:
    1. Steriliseer de laminaire stroming weefselkweek kap instelling door UV licht gedurende ongeveer 30 minuten en desinfecteren van het oppervlak met 70% ethanol voorafgaand aan gebruik. Bovendien steriliseren alle dissectie instrumenten, waaronder fijne dissectie instrumenten en Sylgard beklede schalen voor embryo dissectie via autoclaaf of door onderdompeling in 70% ethanol gedurende ten minste 20 minuten voor gebruik. Giet 70% ethanol en laat de gerechten en instrumenten aan de lucht drogen op een schone laminaire stroming clean bench voor gebruik.
    2. Bereid steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES) mengsel door toevoeging van 10% van 10x HBSS en 0,5% HEPES en de pH op ongeveer 7,2 en filter steriliseren eindoplossing en bewaar bij 4 ° C. Voeren alle dissecties in gekoeld HBSS / HEPES oplossing voor het weefsel tijdens de gehele procedure beter te bewaren.
    3. Coat glazen bodem gerechten met basaalmembraan matrix door toevoeging van 5 ml koude (4 ° C) steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 300 ul aliquot van basaalmembraan matrix in een steriele 15 ml polypropyleen buis. Meng door vortexen inhoud en voeg 150 ul van de basaalmembraan matrix-DMEM mengsel aan het midden van elke kweekschaal, dat voordien de gehele kweekputje aanwezig in het midden van de schaal. Dek de gerechten en op te slaan in een 37 ° C incubator voor ten minste 45 minuten vóór gebruik.
    4. Giet 4-5 ml gekoeld HBSS in three steriele polystyreen petrischalen en laat sloot in de kap.
    5. Bereid kweekmedium in een steriele 15 ml polypropyleen buis door toevoeging van 9 ml DMEM, 100 pl N2 supplementen, 10 g / ml Cipro en 1 ml FBS.
  2. Isolatie van embryo:
    OPMERKING: In deze procedure voor het kweken van cochleaire explants uit embryonale muizen, oogst innerlijke oren uit embryonale dag (E) 13 rotsbeenderen met de dag na de bevruchting wordt beschouwd als E1 9. Het protocol kan ook gebruikt worden met embryonale muis binnenoren beginnen vanaf E12 tot E18.
    1. Euthanaseren een getimede-zwangere muis met CO 2 en offeren van dieren door cervicale dislocatie of passend goedgekeurde protocollen. Voeren euthanization weg van laminaire stroming weefselkweek kap om de steriliteit in de weefselkweek kamer te behouden.
    2. Plaats geëuthanaseerd muis op papier handdoek met de buik naar boven en desinfecteren buik met 70% ethanol.
    3. Open de buikholte door grijpen huidmet gebogen tang met één hand en gesneden opperhuid en de spieren langs de middellijn met een schaar met behulp van een andere hand. Maak twee loodrecht snijdt aan beide zijden en trek de baarmoeder voorzichtig door het optillen van bilaterale baarmoederhoorns met een pincet en maak het van onderaf bindweefsel met een schaar.
    4. Plaats de embryonale ketting in een petrischaaltje met gekoelde dissectie oplossing (HBSS / HEPES mengsel) en transfer naar het laminaire stroming schone werkbank.
    5. Verwijder embryo voorzichtig uit placenta en plaats ze in een van de steriele platen met dissectie oplossing. Als de oplossing blijkt bloedige, verhuizen ze naar een nieuwe petrischaal.
      LET OP: Op dit punt, kan embryo's worden opgevoerd met behulp van een Theiler enscenering gids.
    6. Onthoofden embryo door knijpen in de nek met een paar schone tang of schaar en plaats de kop in een verse petrischaal met gekoelde dissectie oplossing.
  3. Dissectie van de innerlijke oren:
    1. Plaats one embryo hoofd in een steriele Sylgard schotel met koud dissectie
    2. oplossing. Werken onder een dissectie microscoop bij een vergroting van ~ 1,6X, immobiliseren het embryo hoofd door het plaatsen Minutien kunnen rond of dichterbij oog (Figuur 1A).
    3. Met behulp van twee paren van een steriel pincet voorzichtig de huid te verwijderen en het openstellen van de schedel op de dorsale zijde over de middellijn (Figuur 1B). Verwijder hersenen uit schedelholte en innerlijke oren zich binnen rotsbeenderen kunnen worden geïdentificeerd in dit stadium (figuur 1C, D). De voering van het bloedvat, dat gewoonlijk aanwezig rond het binnenoor kan worden gebruikt als een landmark voor het identificeren van het binnenoor in dit stadium (figuur 1D).
    4. Prepareer het binnenoor van de temporale bot door het plaatsen van de tang onder het weefsel en isoleren van het binnenoor van de basis van de schedel en overbrengen in een nieuw schaaltje met koud ontleden oplossing (Figuur 1E, F).

2. Generatie van het Orgaan van Corti explantkweken

Opmerking: In dit stadium van ontwikkeling, het weefsel kraakbeen en kan gemakkelijk worden ontleed met behulp van een tang.

  1. Orient het binnenoor, zodat ventrale zijde naar boven is gericht (Figuur 2A) en het stabiliseren van het binnenoor door voorzichtig het plaatsen van de scherpe einde van Minutien pinnen via het evenwichtsorgaan gedeelte van het binnenoor (Figuur 2B).
  2. Met behulp van ultrafijne tang opengesneden de bovenliggende kraakbeen door het maken van een incisie met behulp van het ene uiteinde van een tang in de buurt van het ovale venster en verwijder voorzichtig het kraakbeen van het slakkenhuis (figuur 2C).
    Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat forceps niet te diep worden ingebracht in het kraakbeen bovenliggende kraakbeen soms versmolten met de cochleaire kanaal waarbij het nuttig gesloten tang om kraakbeen los van de onderliggende cochleaire kanaal door schrapen onder de sppervlakte van het kraakbeen. In dit stadium van ontwikkeling, de cochleaire spiraal slechts driekwart omwenteling lengte.
  3. Vervolgens blootstellen het sensorische epitheel door het plaatsen van de tang op het gewenste gebied van de cochleaire kanaal, ofwel de base of op zijn apex en zachtjes te trekken uit het dak van de cochlea (figuur 2D).
    OPMERKING: Het dak van het slakkenhuis moet volledig worden geschrapt omdat zij de zintuiglijke epitheel de analyse belemmeren kan maskeren.
    Opmerking: Deze procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd zoals het is gemakkelijk om de sensorische epitheel scheuren.
  4. Als laatste stap, verwijder voorzichtig het onderliggende bindweefsel van de blootgestelde sensorische epitheel, zodat de basis van de cochleaire explant is over het algemeen vlak.
  5. Isoleer de ontleed slakkenhuis van het vestibulair gedeelte van het binnenoor behulp van een tang. Dit kan worden uitgevoerd voor of na stap 2.4 (figuur 2E).
  6. Breng de ontleed cochleair zintuiglijke epitheel in een kelder membrane-matrix gecoate cultuur goed met behulp van een 1,5 mm steriele scooper (figuur 2F).
  7. Plaats de cochleaire explantatie de luminale oppervlak van het epitheel naar boven en zuig de basaalmembraan matrix-DMEM oplossing zorgvuldig plat het weefsel en vervangen door 150 ul vers kweekmedium door voorzichtig toevoegen van de schotel. Men dient ervoor te zorgen dat elk explantaat goed hecht aan de beklede glazen dekglaasje en niet drijvend in het kweekmedium. Zorg ervoor dat de punt van de tang wordt gewezen terwijl aandient door op het glas goed te voorkomen dat schade aan het cochleair explant.
  8. Zacht overdracht de kweekschaal in een steriele 150 mm kweekschaal en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsperiode, gewoonlijk 3-6 dagen in vitro (DIV). Na 1 DIV, onderzoekt de culturen onder een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het cochleair explant goed heeft gehandeld op grond van de cultuur schotel.
  9. Na incubation in vitro gewenste tijdsduur worden de kweken verwerkt voor immunohistochemie.
    OPMERKING: De explantkweken meestal geïncubeerd 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro kweken kunnen worden verwerkt voor toepassingen later als immunohistochemie (Figuur 3B), RT-PCR, in situ hybridisatie en / of Western blot.

3. elektroporatie gemedieerde genoverdracht

  1. Instellen voor elektroporatie:
    1. Steriliseren een 100 mm Sylgard gecoate glazen schaal autoclaaf of onderdompelen in 70% ethanol gedurende 20 minuten en laat aan de lucht drogen op een schone werkbank voor gebruik.
    2. Bereid DNA van een expressievector keuze met behulp van geschikte maxi- of midi-prep kits. De expressie vectoren die in dit protocol zijn pIRES2-Atoh1.EGFP en pCLIG-NeuroD1.EGFP. De eindconcentratie van DNA moet ten minste 1 ug / ul in steriele DNA /RNase-vrij water.
  2. Electroporating DNA in embryonale cochleaire explants:
    1. Voeg 10 ul van plasmide-DNA-oplossing een nieuwe 100 mm Sylgard gecoate schaal en breng een volledig ontleed cochleair explantaat (verkregen uit stap 2.5) in de DNA-oplossing.
    2. Met luminale oppervlak van het epitheel naar boven kantelen van de cochlea licht zodat het loodrecht op het vlak van de schaal.
    3. Elektrode schoepen aan beide zijden van de cochlea met negatieve peddel (kathode) naar de sensorische epitheel en de positieve peddel (anode) aangrenzend aan de basis van de cochlea.
      OPMERKING: Aangezien DNA negatief geladen, migreert van negatief naar positief elektrode en door het plaatsen van de kathode uiteinde van de sonde naast het sensorische epitheel; het DNA zal vooral gaan door het oppervlak van het sensorische epitheel.
    4. Met behulp van electroporator, leveren 9 tot 10 pulsen van 24 mV, 30 msec pulsduur met het voetpedaal schakelaar op tHij electroporator en voeg 100 pl warm kweekmedium de geëlektroporeerd slakkenhuis.
    5. Herhaal de stappen 3.2.1-4 voor alle cochleair explants en voor DNA van alle genen van belang en de overdracht van de geëlectroporeerd cochleae in het basaal membraan-matrix gecoate schotel voor plating (stap 2.7). Cultuur alle geëlektroporeerd cochleae in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator voor de gewenste tijdsduur die vervolgens worden verwerkt voor immunocytochemie.
      OPMERKING: Het slakkenhuis van een hele nest van CD1 muis (ongeveer 8-12 pups) kunnen worden geïsoleerd, gemicrodissecteerde, geëlectroporeerd en vergulde in <4 uur.

4. Analyse van Cochlear explantkweken

OPMERKING: De kweken worden gewoonlijk gedurende 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro, worden de kweken gefixeerd en verwerkt voor immunocytochemie.

  1. Na de gewenste lengte van incubation verwijderen kweekmedium en snel spoel de cochleaire explantaat in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd in 4% paraformaldehyde (bereid in PBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
  2. Was het fixeermiddel door toevoeging van PBS en spoelen met PBS driemaal gedurende 15 min.
  3. Permeabilize met PBS-T (PBS + 0,5% Tween) gedurende 30 minuten voor het blokkeren met PBS-T met 10% geit serum.
  4. Incubeer in primaire antilichaam oplossing die primair antilichaam in PBS-T met 1% geit serum overnacht bij 4 ° C.
  5. Was de cochlea driemaal bij kamertemperatuur met PBS-T 15 minuten elk voor het toevoegen van geschikte Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen.
  6. Sinds het cochleair explant is gekweekt op glazen dekglaasje kan individueel worden behandeld door het isoleren van het dekglaasje van de schotel en montage op een dia. Dit kan worden bereikt door het weken de kweekschaal in OS30 oplosmiddel gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met behulp van de steriele scheermesje, los het dekglaasje van het dish en monteren op een glijbaan en visualiseren onder een tl-microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle cellen in het membraneuze labyrint van de muis binnenoor zoals zintuiglijke, nonsensory en de spiraal ganglion neuronen zijn alle afgeleid van placodally afgeleide otocyst gelegen naast de achterhersenen van het ectoderm, rond E8 10-14. Op E11, het ventrale gebied van de otocyst uitstrekt tot de cochleaire ductus en als ontwikkeling gaat, een groep van epitheelcellen in de cochlea, en in andere gebieden van de otocyst, worden gespecificeerd als prosensory pleisters die vervolgens tot geeft verschillende soorten mechanosensorische haarcellen en steuncellen nonsensory. In de ontwikkelingslanden slakkenhuis, kan één rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen worden geïdentificeerd rond E15.5 en door E17, patroonvorming is in wezen compleet met enkele rij binnenste haarcellen, pijler cellen en drie rijen buitenste haarcellen . In een tijdsperiode die reikt van E11 bij de cochleaire buis eerst begint te groeien door E17 alle diflende cel beslissingen over het lot en patroonvorming optreden binnen het ontwikkelen van epitheel om een ​​opvallende cellulaire patroon met een normale aantal haarcellen en steuncellen genereren. Verlies van haar cellen en / of ondersteuning cellen is de belangrijkste oorzaak van slechthorendheid. Aangezien deze celtypen worden gegenereerd alleen tijdens een vrij compacte periode tijdens de embryonale ontwikkeling, is het cruciaal om de moleculaire en genetische pathways dat elk van deze celtypen die moet leiden tot een aanzienlijke inzicht in regeneratieve strategieën opgeven begrijpen.

Cochleaire kweken en elektroporatie technieken ontwikkeld om genexpressie in ontwikkelingslanden muis manipuleren. In deze video, hebben we aangetoond kweken technieken voor het genereren van primaire explantaten en een elektroporatie techniek voor gen delivery in gekweekte embryonale muizen orgaan van Corti. De primaire explantaten op deze wijze bereid kunnen worden gehandhaafd gedurende 7-10 dagen in vitro. Cochlear explants can worden gebruikt om genexpressie te manipuleren door farmacologische benaderingen die ons in staat zal stellen om de mechanismen die ontwikkelingsprocessen, zoals het lot specificatie, betrokkenheid, differentiatie en patronen reguleren begrijpen. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de analyse van ontwikkelings-fenotypes van mutante embryonale muizen die niet overleven verleden E12.

De blokgolf elektroporatie-gemedieerde genoverdracht procedure verschaft een mechanisme voor het manipuleren van genexpressie in sensorische haarcellen, steuncellen en cellen in GER en LER regio's om hun lot ex vivo visualiseren. Met deze procedure kunnen we neerwaarts reguleren of ectopisch tot expressie specifieke genen in prosensory cellen haarcellen en / of steuncellen in een overigens wildtype achtergrond en hun specifieke effecten op lot specificatie en differentiatie analyseren. Dit zal ons in staat stellen om specifiek gen functie binnen de zich ontwikkelende slakkenhuis begrijpen. Bijvoorbeeld, zoals getoond in 2,4 of NeuroD1 8 in cellen binnen GER of LER leidt tot de vorming van ectopisch haarcellen en neuronen respectievelijk. Daarnaast laat deze techniek meerdere kandidaatgenen 6,7 elektroporatie en onderzoeken hun effect op sensorische haarcellen en ondersteunende vorming cel differentiatie en de organisatie. Genoverdracht techniek die adenovirale vectoren biedt een brede expressie en zijn met succes gebruikt in het binnenoor 15,16. Deze techniek is afhankelijk van de vaardigheid genereren en zuiveren de virussen die vaak tijdrovend.

Hoewel cochear culturen al E12, elektroporatie van cochleaire explantaten jonger dan E12.5 kan worden vastgesteld / E13 leidt tot schade aan het weefsel waardoor het lastig voor analyse. Bovendien, de promotor van de expressievector gebruikt, bepaalt welke cellen worden getransfecteerd in de cochleaire duct. Bijvoorbeeld, de menselijke cytomegalovirus promoter bevatten expressievectoren levert robuuste transfectie in Kollikers 'orgaan, terwijl het gebruik van de CMV vroege enhancer / chicken beta actine promoter resulteert in hogere efficiëntie van transfectie in cellen in het sensorische epitheel. De problemen die zich bij de elektroporatie van de embryonale cochleaire explantaten buitensporig celdood en / of beschadiging van het weefsel en slechte transfectie-efficiëntie. De juiste afstand tussen de elektroden en DNA-concentratie speelt een cruciale rol bij het verkrijgen van minimale beschadiging en hogere transfectie-efficiëntie. Samengevat, deze technieken verbetert ons vermogen om genexpressie te manipuleren via winst of verlies van functie strategieën en farmacologische manipulaties en enorm helpen bij het ontleden van signalen die patronen en lot van de cel beslissingen te beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 14065-056
HEPES Gibco 15630-080
Dulbecco’s Modified Medium Gibco 12430-054
Fetal bovine serum Gibco 10082
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
Ciprofloxacin hydrochloride Cellgro 61-277-RF
Glass Dish 60 mm Kimble Chase 23062-6015/23064-6015
Glass Dish 100 mm Kimble Chase 23064-10015/23062-10015
Minutien pins Fine Science Tools 26002-15
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10
Pulse generator Protech International Inc CUY21Vivo-SQ
Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0-10-C
Matrigel matrix BD Biosciences 356237
Culture dish, 60 x 15 mm Becton Dickinson 353037
Tissue culture dishes Greiner Bio-one 639160
Phosphate buffered saline Gibco 10010-023
OS-30 Dow Corning 4021768
Fluoromount Southern Biotech 0100-01
Conical tubes, 15 ml Greiner Bio-one 188261
Myosin 6 Proteus Biosciences Inc 25-6791
Myosin 7a Proteus Biosciences Inc 25-6790
TuJ1 Sigma T2200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
  2. Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
  3. Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
  4. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  5. Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
  6. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  7. Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
  8. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
  9. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
  10. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
  11. Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
  12. Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
  13. Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
  14. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
  15. Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
  16. Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).

Tags

Developmental Biology sensorische epitheelcellen orgaan van Corti cochleair explantkweken elektroporatie gehoor lot van de cel specificatie differentiatie
Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, More

Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation. J. Vis. Exp. (95), e52260, doi:10.3791/52260 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter