Protocol
नोट: जीवित पशुओं का उपयोग कर सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा की और एक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी है और आधिकारिक तौर पर प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए तरीकों को मंजूरी दे दी पालन करना चाहिए किया जाना चाहिए। सभी dissections एक साफ लामिना का प्रवाह बेंच पर बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। दस्ताने और एक मुखौटा है, अगर वांछित, इस प्रक्रिया के दौरान पहना होना चाहिए।
भ्रूण माउस भीतरी कान की 1. विच्छेदन
- कोर्टी explant संस्कृतियों के अंग के लिए स्थापित:
- के बारे में 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश मोड़ से लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड जीवाणुरहित और प्रयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ सतह कीटाणुरहित। इसके अलावा, ठीक विच्छेदन उपकरण और आटोक्लेव के माध्यम से भ्रूण विच्छेदन के लिए या उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने से Sylgard लेपित बर्तन सहित सभी विच्छेदन उपकरणों बाँझ। एक साफ लामिना का प्रवाह clea में शुष्क हवा बर्तन और उपकरणों 70% इथेनॉल डालो और अनुमतिएन बेंच का उपयोग करने से पहले।
- तैयार करें बाँझ हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) / (4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड) HEPES के 10x HBSS और 0.5% का 10% जोड़ने और लगभग 7.2 पीएच को समायोजित करने और फिल्टर बाँझ द्वारा (HEPES) मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम समाधान और दुकान। बेहतर प्रक्रिया के दौरान ऊतक को संरक्षित करने के लिए ठंडा HBSS / HEPES के समाधान में सभी dissections बाहर ले।
- एक बाँझ 15 एमएल polypropylene ट्यूब में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 300 μl विभाज्य बाँझ (4 डिग्री सेल्सियस) ठंड Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 5 मिलीलीटर जोड़कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ कोट गिलास नीचे व्यंजन हैं। सामग्री vortexing द्वारा मिक्स और यह डिश के केंद्र में अच्छी तरह से वर्तमान पूरी संस्कृति को शामिल किया गया है ताकि प्रत्येक संस्कृति डिश के केंद्र के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-DMEM के मिश्रण के 150 μl जोड़ें। उपयोग करने से पहले कम से कम 45 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में व्यंजन और दुकान को कवर किया।
- वें में HBSS के ठंडा 4-5 मिलीलीटर डालोबाँझ योग्य polystyrene पेट्री डिश REE और हुड में बंद छोड़ दें।
- DMEM के 9 मिलीलीटर, एन 2 की खुराक की 100 μl, 10 ग्राम / मिलीलीटर सिप्रो और FBS के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक बाँझ 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
- भ्रूण के अलगाव:
नोट: भ्रूण चूहों से कर्णावत explants के संवर्धन के लिए इस प्रक्रिया में, फसल भीतरी कान भ्रूण दिन (ई) से निषेचन के बाद दिन के साथ 13 अस्थायी हड्डियों E1 के नौ रूप में माना जा रहा है। प्रोटोकॉल भी E12 से E18 के लिए शुरुआत भ्रूण माउस भीतरी कान के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।- सीओ 2 के साथ एक समय गर्भवती माउस euthanize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या उपयुक्त अनुमोदित प्रोटोकॉल द्वारा पशु बलि। टिशू कल्चर कमरे में बाँझपन बनाए रखने के लिए दूर लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड से euthanization बाहर ले।
- ऊपर का सामना करना पड़ पेट के साथ एक कागज तौलिया पर euthanized माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ पेट कीटाणुरहित।
- त्वचा हथियाने के द्वारा उदर गुहा खोलेंदूसरे हाथ का उपयोग कैंची के साथ midline के साथ घुमावदार एक हाथ से संदंश और कटौती एपिडर्मिस और मांसपेशियों के साथ। दोनों पक्षों पर दो सीधा कटौती करने और संदंश के साथ द्विपक्षीय गर्भाशय सींग ऊपर उठाने के द्वारा ध्यान से गर्भाशय से बाहर खींचने के लिए और संयोजी ऊतक का उपयोग कैंची के नीचे से यह अलग।
- लामिना का प्रवाह साफ बेंच के लिए ठंडा विच्छेदन समाधान (HbSS / HEPES के मिश्रण) और हस्तांतरण युक्त एक पेट्री डिश में भ्रूण श्रृंखला रखें।
- प्लेसेंटा से ध्यान से भ्रूण निकालें और विच्छेदन समाधान युक्त बाँझ पेट्री डिश में से एक में उन्हें जगह है। समाधान खूनी बदल जाता है, तो एक नया पेट्री डिश के लिए उन्हें स्थानांतरित।
नोट: इस बिंदु पर, भ्रूण एक Theiler मचान गाइड का उपयोग का मंचन किया जा सकता है। - साफ संदंश या कैंची की एक जोड़ी के साथ गर्दन क्षेत्र में बन्द रखो द्वारा भ्रूण सिर काटना और ठंडा विच्छेदन समाधान युक्त एक ताजा पेट्री डिश में सिर जगह है।
- भीतरी कान की विच्छेदन:
- जगह oठंड विदारक युक्त एक बाँझ Sylgard डिश में पूर्वोत्तर भ्रूण सिर
- समाधान। ~ 1.6x के एक बढ़ाई पर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कार्य करना, आंख क्षेत्र (चित्रा 1 ए) के आसपास या करीब Minutien पिन रखकर भ्रूण सिर स्थिर।
- बाँझ संदंश के दो जोड़े का प्रयोग सावधानी से त्वचा को हटाने और midline (चित्रा 1 बी) के साथ पृष्ठीय पक्ष पर खोपड़ी खुला। कपाल गुहा और लौकिक हड्डियों के भीतर स्थित भीतरी कान इस स्तर (चित्रा 1C, डी) में पहचाना जा सकता से मस्तिष्क निकालें। आम तौर पर भीतरी कान के आसपास मौजूद है जो रक्त वाहिका, की परत, इस स्तर (चित्रा -1) पर भीतरी कान की पहचान करने के लिए एक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
- ऊतक के नीचे संदंश रखने और ठंड विदारक समाधान युक्त एक नई डिश के लिए खोपड़ी और हस्तांतरण के आधार से भीतरी कान अलग से अस्थायी हड्डियों से भीतरी कान काटना (चित्रा 1E, एफ)।
कोर्टी explant संस्कृतियों का अंग 2. जनरेशन
नोट: विकास के इस स्तर पर, ऊतक उपास्थि है और आसानी से संदंश का उपयोग विच्छेदित किया जा सकता है।
- ओरिएंट उदर पक्ष (2A चित्रा) सामना करना पड़ रहा है और धीरे भीतरी कान (चित्रा 2 बी) के vestibular भाग के माध्यम से Minutien पिनों की तेज अंत डालने से भीतरी कान को स्थिर इतना है कि भीतरी कान।
- का प्रयोग ultrafine संदंश कोक्लीअ (चित्रा -2) से उपास्थि को हटाने ध्यान से अंडाकार खिड़की के पास संदंश के एक छोर का उपयोग कर और एक चीरा बनाकर overlying उपास्थि को खोलने में कटौती।
नोट: यह overlying उपास्थि कभी कभी यह नीचे scraping द्वारा अंतर्निहित कर्णावत वाहिनी से उपास्थि जारी करने के लिए बंद संदंश का उपयोग करने के लिए उपयोगी है, जो मामले में कर्णावत वाहिनी के साथ जुड़े हुए है के रूप में संदंश कार्टिलेज में भी गहराई से डाला नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है एसउपास्थि की urface। विकास के इस स्तर पर, कर्णावत सर्पिल लंबाई में एक मोड़ के केवल तीन तिमाहियों है। - अगला, आधार या बहुत शीर्ष पर, या तो कर्णावत वाहिनी के पसंदीदा क्षेत्र में संदंश रखकर संवेदी उपकला का पर्दाफाश, और धीरे कोक्लीअ (चित्रा 2 डी) की छत से बाहर खींच रहा है।
नोट: कोक्लीअ की छत यह विश्लेषण निरोधक संवेदी उपकला मुखौटा कर सकते हैं के रूप में पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए।
नोट: यह संवेदी उपकला फाड़ करने के लिए आसान है के रूप में इस प्रक्रिया को धीरे से किया जाना चाहिए। - कर्णावत explant के आधार समान रूप से फ्लैट इतना है कि एक अंतिम कदम के रूप में, ध्यान से अवगत कराया संवेदी उपकला से अंतर्निहित संयोजी ऊतक को हटा दें।
- संदंश का उपयोग भीतरी कान के vestibular हिस्से से विच्छेदित कोक्लीअ पृथक। इस से पहले या 2.4 कदम (चित्रा 2 ई) के बाद किया जा सकता है।
- एक तहखाने MEMBRA में विच्छेदित कर्णावत संवेदी उपकला स्थानांतरणपूर्वोत्तर मैट्रिक्स लेपित संस्कृति में अच्छी तरह से एक 1.5 मिमी बाँझ scooper (चित्रा 2 एफ) का उपयोग।
- ओरिएंट उपकला के lumenal सतह के साथ कर्णावत explant सामना करना पड़ रहा है और ध्यान से ऊतक समतल और धीरे पकवान को जोड़कर ताजा संस्कृति के माध्यम से 150 μl के साथ इसे बदलने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-DMEM के समाधान aspirate। केयर प्रत्येक explant लेपित गिलास coverslip करने के लिए अच्छी तरह से पालन करता है और मध्यम संस्कृति में तैर नहीं है कि सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। कर्णावत explant हानिकारक से बचने के गिलास में अच्छी तरह से करने के लिए affixing जबकि संदंश की नोक ऊपर की ओर इशारा किया है कि सुनिश्चित करें।
- धीरे समय के वांछित अवधि, इन विट्रो में आम तौर पर 3-6 दिनों (DIV) के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक बाँझ 150 मिमी संस्कृति डिश और जगह में संस्कृति पकवान हस्तांतरण। एक DIV के बाद, कर्णावत explant संस्कृति डिश के लिए अच्छी तरह से पालन किया है कि सुनिश्चित करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों की जांच।
- बाद मेंसमय के वांछित लंबाई के लिए इन विट्रो में cubation, संस्कृतियों immunohistochemistry के लिए कार्रवाई कर रहे हैं।
नोट: explant संस्कृतियों आमतौर पर विकास मंच, P0 के लिए बराबर है, जो 6 DIV के लिए incubated हैं। इन विट्रो में ऊष्मायन के बाद, संस्कृतियों immunohistochemistry की तरह आगे बहाव के अनुप्रयोगों (3B चित्रा) के लिए कार्रवाई की जा सकती, आरटी पीसीआर, सीटू संकरण, और / या पश्चिमी धब्बा में।
3. Electroporation की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण
- Electroporation के लिए स्थापित:
- Autoclaving या के बारे में 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने से एक 100 मिमी Sylgard लेपित गिलास पकवान जीवाणुरहित और प्रयोग करने से पहले एक साफ बेंच में शुष्क हवा की अनुमति देते हैं।
- उपयुक्त maxi- या मिडी-प्रस्तुत करने का किट का उपयोग कर पसंद की एक अभिव्यक्ति वेक्टर से डीएनए तैयार करें। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति वैक्टर pIRES2-Atoh1.EGFP और pCLIG-NeuroD1.EGFP हैं। डीएनए के अंतिम एकाग्रता बाँझ डीएनए में कम से कम एक माइक्रोग्राम प्रति / μl होना चाहिए /RNase मुक्त पानी।
- भ्रूण कर्णावत explants में डीएनए electroporating:
- एक ताजा 100 मिमी Sylgard लेपित पकवान प्लास्मिड डीएनए समाधान के 10 μl जोड़ें और डीएनए समाधान में (2.5 कदम से प्राप्त) एक पूरी तरह से विच्छेदित कर्णावत explant हस्तांतरण।
- यह डिश के हवाई जहाज को सीधा इतना है कि ऊपर का सामना करना पड़ उपकला के lumenal सतह के साथ, थोड़ा कोक्लीअ झुकाव।
- संवेदी उपकला और कोक्लीअ के आधार के निकट स्थित सकारात्मक चप्पू (एनोड) के प्रति नकारात्मक चप्पू (कैथोड) के साथ कोक्लीअ के दोनों तरफ इलेक्ट्रोड paddles के रखें।
नोट: डीएनए नकारात्मक आरोप लगाया है, यह सकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए और संवेदी उपकला से सटे जांच के कैथोड अंत रखकर नकारात्मक से migrates; डीएनए ज्यादातर संवेदी उपकला की सतह के माध्यम से जाना जाएगा। - Electroporator का प्रयोग, 24 एम वी के 9-10 दालों देने, टी पर पैर पेडल स्विच के साथ 30 मिसे नाड़ी अवधिवह electroporator, और फिर Electroporated कोक्लीअ के लिए गर्म संस्कृति के माध्यम से 100 μl जोड़ें।
- दोहराएँ सभी कर्णावत explants के लिए और ब्याज के सभी जीनों के डीएनए के लिए 3.2.1-4 कदम और (कदम 2.7) चढ़ाना के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित डिश में electroporated cochleae हस्तांतरण। फिर immunocytochemistry के लिए कार्रवाई की जाएगी, जो समय के वांछित लंबाई के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में संस्कृति सभी electroporated cochleae।
नोट: CD1 माउस (लगभग 8-12 पिल्ले) के एक पूरे कूड़े से कोक्लीअ, पृथक microdissected, electroporated और <4 घंटा में चढ़ाया जा सकता है।
4. विश्लेषण Cochlear explant संस्कृतियों की
नोट: संस्कृतियों आमतौर पर विकास मंच, P0 के लिए बराबर है, जो 6 DIV के लिए incubated हैं। इन विट्रो में ऊष्मायन के बाद, संस्कृतियों तय कर रहे हैं और immunocytochemistry के लिए संसाधित।
- इंक के वांछित लंबाई के बादubation, संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और जल्दी से फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कर्णावत explant कुल्ला और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए (पीबीएस में तैयार) 4% paraformaldehyde में सेते हैं।
- 15 मिनट के लिए तीन बार जोड़ना पीबीएस द्वारा लगानेवाला धो और पीबीएस में कुल्ला।
- 10% बकरी सीरम युक्त पीबीएस टी के साथ अवरुद्ध होने से पहले 30 मिनट के लिए पीबीएस-टी (पीबीएस + 0.5% के बीच) का उपयोग permeabilize।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 1% बकरी सीरम के साथ पीबीएस टी में प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में सेते हैं।
- उपयुक्त एलेक्सा संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने से पहले पीबीएस टी 15 मिनट प्रत्येक का उपयोग कर कमरे के तापमान पर कोक्लीअ तीन बार धोएं।
- कर्णावत explant गिलास coverslip पर सुसंस्कृत है के बाद से यह पकवान से coverslip के अलग और एक स्लाइड पर बढ़ते द्वारा व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। इस कमरे के तापमान पर कम से कम एक घंटा के लिए विलायक OS30 में संस्कृति डिश भिगोने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। बाँझ धार का प्रयोग, डी से coverslip के अलगish और एक स्लाइड पर माउंट और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कल्पना।
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Discussion
सहित माउस भीतरी कान की झिल्लीदार भूलभुलैया के भीतर सभी कोशिकाओं संवेदी, nonsensory और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स सभी E8 10-14 के आसपास है, बाह्य त्वक स्तर के hindbrain के निकट स्थित otocyst placodally व्युत्पन्न से निकाली गई है। E11 पर, otocyst के उदर क्षेत्र कर्णावत वाहिनी के लिए फार्म का विस्तार और विकास जारी है, के रूप में बन कोक्लीअ के भीतर उपकला कोशिकाओं है, साथ ही में otocyst के अन्य क्षेत्रों के एक समूह, बाद में वृद्धि करने के लिए दे देंगे कि prosensory पैच के रूप में निर्दिष्ट mechanosensory बालों की कोशिकाओं और nonsensory का समर्थन कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के। विकासशील कोक्लीअ में, इनर बालों की कोशिकाओं की एक पंक्ति और बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों E15.5 के आसपास है और E17 के द्वारा पहचाना जा सकता है, patterning के भीतरी बालों की कोशिकाओं, स्तंभ कोशिकाओं और बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों की एक पंक्ति के साथ अनिवार्य रूप से पूरा हो गया है । कर्णावत वाहिनी पहले E17 के माध्यम से अलग से बाहर के सभी विकसित करने के लिए शुरू होता है जब E11 से spans कि समय की अवधि मेंअलग सेल भाग्य का निर्णय और patterning के बालों की कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं का एक सामान्य पूरक के साथ एक हड़ताली सेलुलर पैटर्न उत्पन्न करने के लिए विकासशील उपकला भीतर होते हैं। बालों की कोशिकाओं और / या समर्थन कोशिकाओं के नुकसान श्रवण का प्रमुख कारण है। इन प्रकार की कोशिकाओं केवल भ्रूण के विकास के दौरान एक काफी कॉम्पैक्ट समय अवधि के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं के बाद से, यह पुनर्योजी रणनीति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व चाहिए जो इन प्रकार की कोशिकाओं में से प्रत्येक को निर्दिष्ट है कि आणविक और आनुवंशिक रास्ते को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
कर्णावत संवर्धन और electroporation तकनीक को विकसित करने के लिए माउस में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए विकसित किया गया है। इस वीडियो में, हम प्राथमिक explants और Corti के सुसंस्कृत भ्रूण murine अंग में जीन डिलीवरी के लिए एक electroporation तकनीक पैदा करने के लिए तकनीक संवर्धन का प्रदर्शन किया है। इस फैशन में तैयार प्राथमिक explants इन विट्रो में 7-10 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है। कर्णावत explants can इस तरह भाग्य विनिर्देश, प्रतिबद्धता, भेदभाव, और patterning के रूप में विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले तंत्र को समझने के लिए हमें सक्षम हो जाएगा, जो औषधीय दृष्टिकोण से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इसके अलावा, इस विधि E12 अतीत जीवित नहीं है कि उत्परिवर्ती भ्रूण चूहों की विकासात्मक phenotypes के विश्लेषण की सुविधा।
वर्ग की लहर electroporation की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण प्रक्रिया उनके भाग्य पूर्व vivo कल्पना करने के क्रम में संवेदी बालों की कोशिकाओं, समर्थन कोशिकाओं, और जीईआर और LER क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक तंत्र प्रदान करता है। इस प्रक्रिया का उपयोग करना, हम downregulate या ectopically एक अन्यथा जंगली प्रकार पृष्ठभूमि में prosensory कोशिकाओं, बालों की कोशिकाओं और / या समर्थन करने की कोशिकाओं में विशिष्ट जीन व्यक्त करने और भाग्य विनिर्देश और भेदभाव पर उनकी विशिष्ट प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं। यह विकासशील कोक्लीअ के भीतर विशिष्ट जीन समारोह को समझने के लिए हमें सक्षम हो जाएगा। उदाहरण के लिए, के रूप में दिखाया
Cochear संस्कृतियों के रूप में जल्दी E12, E12.5 की तुलना में छोटी कर्णावत explants की electroporation के रूप में स्थापित किया जा सकता है / E13 के विश्लेषण के लिए यह बोझिल बनाने के ऊतकों को नुकसान में परिणाम होगा। इसके अलावा, अभिव्यक्ति वेक्टर के प्रमोटर प्रकार की कोशिकाओं कर्णावत डु भीतर ट्रांसफ़ेक्ट हैं, जो निर्धारित करता है इस्तेमाल कियासीटी। उदाहरण के लिए, अभिव्यक्ति वैक्टर युक्त मानव cytomegalovirus के प्रमोटर, Kollikers 'अंग में मजबूत अभिकर्मक पैदावार जबकि संवेदी उपकला के भीतर कोशिकाओं में अभिकर्मक के उच्च दक्षता में सीएमवी जल्दी बढ़ाने / चिकन बीटा actin के प्रमोटर परिणामों का उपयोग करें। भ्रूण कर्णावत explants की electroporation के दौरान सामना आम समस्याओं अत्यधिक कोशिका मृत्यु और / या ऊतक और गरीब अभिकर्मक दक्षता का नुकसान कर रहे हैं। इलेक्ट्रोड और डीएनए एकाग्रता का उपयुक्त अंतराल कम से कम नुकसान और उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सारांश में, इन तकनीकों का लाभ या समारोह रणनीतियों और औषधीय जोड़तोड़ की हानि के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर और बहुत patterning और सेल भाग्य निर्णयों को प्रभावित संकेत है कि विदारक में सहायता करने की हमारी क्षमता को बढ़ाता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
- Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
- Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
- Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
- Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
- Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
- Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
- Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
- Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
- Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).
