Protocol
OBS: Alla protokoll som använder levande djur måste granskas och godkännas av en Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och måste följa officiellt godkända metoder för skötsel och användning av laboratoriedjur. Samtliga dissektioner bör utföras genom användning av steril teknik på en ren laminärflödesbänk. Handskar och en mask, om så önskas, skall bäras under denna procedur.
1. Dissektion av embryonala Mouse innerörat
- Inställning för organ Corti Explantation kulturer:
- Sterilisera laminärt flöde vävnadsodling huva genom att slå på UV-ljus under ca 30 min och desinficera ytan med 70% etanol före användning. Dessutom sterilisera alla dissektion instrument inklusive fina dissektion verktyg och Sylgard-belagda rätter för embryo dissekering via autoklav eller genom blötläggning i 70% etanol i minst 20 minuter före användning. Häll av 70% etanol och låt disken och instrument lufttorka i en ren laminärt flöde clean bänk före användning.
- Förbered steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) / (4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra) (HEPES) blandning genom att tillsätta 10% av 10x HBSS och 0,5% HEPES och justera pH till cirka 7,2 och filtersterilisera den slutlig lösning och förvara vid 4 ° C. Utför alla dissektioner i kyld HBSS / HEPES-lösning för att bättre bevara vävnaden under hela förfarandet.
- Coat glas botten rätter med basalmembranmatris genom att lägga till 5 ml kall (4 ° C) steril Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) till en 300 | il alikvot av basalmembranmatrisen i en steril 15 ml polypropylenrör. Omskakas innehållet och lägga 150 ìl av basalmembranet matris DMEM blandningen till mitten av varje odlingsskål så att den täcker hela kulturen väl närvarande i mitten av skålen. Täck disken och lagra i en 37 ° C inkubator i minst 45 minuter före användning.
- Häll 4-5 ml kyld HBSS i paree sterila polystyren petriskålar och ledighet stängd i huvan.
- Förbered odlingsmedium i en steril 15 ml polypropylenrör genom tillsats 9 ml DMEM, 100 pl av N2 kosttillskott, 10 g / ml Cipro och 1 ml FBS.
- Isolering av embryon:
OBS: I detta förfarande för odling cochlea explants från embryonala möss, skörd inre öron från embryonala dag (E) 13 tidsmässiga ben med dagen efter befruktningen betraktas som E1 9. Protokollet kan också användas med embryonal mus inre öron börjar från E12 till E18.- Euthanize en tidsinställd-gravid mus med CO 2 och offra animaliska halsdislokation eller lämpliga godkända protokoll. Utför euthanization ifrån laminarflowanordningen vävnadsodling huva för att upprätthålla sterilitet i vävnadsodlingsrummet.
- Placera avlivas musen på pappershandduk med buken uppåt och desinficera buken med 70% etanol.
- Öppna bukhålan genom att ta tag hudmed böjda pincett med ena handen och skära epidermis och muskler längs mittlinjen med en sax som använder en annan hand. Gör två vinkelräta snitt på båda sidor och dra ut livmodern försiktigt genom att lyfta upp bilaterala livmoderhornen med pincett och ta bort den från undersidan bindväv med sax.
- Placera embryonala kedjan i en petriskål med kyld dissektion lösning (HBSS / HEPES blandning) och transfer till laminärt flöde ren bänk.
- Ta bort embryon försiktigt från placenta och placera dem i en av de sterila petriskålar som innehåller dissektion lösning. Om lösningen blir blodigt, flytta dem till en ny petriskål.
OBS: Vid denna punkt, kan embryon iscensatt med hjälp av en Theiler iscensättning guide. - Halshugga embryon genom att klämma på halsregionen med ett par rena pincett eller sax och placera huvudena i en fräsch petriskål med kyld dissektion lösning.
- Dissektion av inre öron:
- Placera one embryo huvudet i en steril Sylgard maträtt som innehåller kallt dissekera
- lösning. Arbeta under ett dissekera mikroskop med en förstoring av ~ 1,6X, immobilisera embryot huvudet genom att placera Minutien stift runt eller närmare ögonregionen (Figur 1A).
- Med hjälp av två par av steril tång försiktigt bort huden och öppna upp skallen på ryggsidan längs mittlinjen (Figur 1B). Ta bort hjärnan från hjärnskålen och inre öron ligger inom tidsmässiga ben kan identifieras i detta skede (Figur 1C, D). Fodret av blodkärlet, som vanligtvis är närvarande runt de inre öron, kan användas som ett landmärke för identifiering innerörat i detta skede (figur 1D).
- Dissekera innerörat från tidsmässiga ben genom att placera pincetten under vävnaden och isolera innerörat från nacken och förflyttas till en ny maträtt som innehåller kall dissekera lösning (Figur 1E, F).
2. Generering av organ Corti explant kulturer
OBS: I detta skede av utvecklingen, är vävnaden brosk och kan lätt dissekeras med pincett.
- Orient innerörat så att ventrala sidan är vänd uppåt (figur 2A) och stabilisera innerörat genom att försiktigt föra den vassa änden av Minutien stift genom den vestibulära delen av innerörat (Figur 2B).
- Använda ultrafina pincett skära upp den överliggande brosket genom att göra ett snitt genom att använda den ena änden av tång nära ovala fönstret och försiktigt bort brosk från cochlean (figur 2C).
OBS: Det är viktigt att se till att pincett inte in för djupt in i brosket som liggande brosk ibland smält med cochlea kanalen i vilket fall är det bra att använda slutna pincett för att frigöra brosk från den underliggande cochlea kanalen genom skrapning nedanför surface av brosket. I detta skede av utvecklingen, är cochlea spiralen endast tre fjärdedelar av en sväng i längd. - Nästa, utsätta sensoriska epitelet genom att placera pincetten vid drog regionen av cochlea kanalen, antingen basen eller åtmin apex, och försiktigt dra ut taket på snäckan (figur 2D).
OBS: Taket på snäckan måste avlägsnas fullständigt som den kan maskera det sensoriska epitelet hindrar analysen.
OBS: Denna procedur måste göras försiktigt eftersom det är lätt att riva det sensoriska epitel. - Som ett sista steg, försiktigt bort den underliggande bindväv från den exponerade sensoriska epitel så att basen av cochlea Explantation är jämnt plan.
- Isolera dissekerade snäckan från vestibulära delen av innerörat med pincett. Detta kan utföras före eller efter steg 2,4 (Figur 2E).
- Överför dissekerade cochlea sensoriska epitel i en källare Membrane matris belagda kulturen väl med hjälp av en 1,5 mm steril scooper (Figur 2F).
- Orient cochlea Explantation med lumenala ytan av epitelet uppåt och aspirera basalmembranet matris DMEM lösning försiktigt platta till vävnaden och ersätta den med 150 pl färskt odlingsmedium genom att försiktigt lägga till skålen. Försiktighet bör vidtas för att se till att varje explantat vidhäftar väl till det belagda glaset täck och är inte flytande i odlingsmediet. Se till att spetsen på pincetten pekas upp medan fästa till glas väl för att undvika skador på cochlea Explantation.
- Försiktigt överföra odlingsskålen i en steril 150 mm odlingsskål och placera i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO2 under önskad tidsperiod, vanligtvis 3-6 dagar in vitro (DIV). Efter 1 DIV, undersöka kulturer under ett dissekera mikroskop för att se till att cochlea Explantation har anslutit sig väl till kulturen skålen.
- Efter icubation in vitro för önskade längder av tid, kulturer behandlas för immunohistokemi.
OBS: explantatet kulturerna vanligtvis inkuberas under 6 DIV vilket motsvarar utvecklingsstadiet, P0. Efter inkubation in vitro kan kulturer behandlas för ytterligare nedströms tillämpningar som immunohistokemi (Figur 3B), RT-PCR, hybridisering in situ och / eller Western blöt.
3. Elektroporation genöverföring
- Inställning för elektroporering:
- Sterilisera en 100 mm Sylgard belagd glasskål genom autoklavering eller blötläggning i 70% etanol i ca 20 min och låt lufttorka i en ren bänk före användning.
- Förbered DNA från en expressionsvektor enligt val med hjälp av lämpliga maxi- eller midi-prep kit. De expressionsvektorer som används i detta protokoll är pIRES2-Atoh1.EGFP och pCLIG-NeuroD1.EGFP. Den slutliga koncentrationen av DNA bör vara minst 1 ug / ul i sterilt DNA /RNAs-fritt vatten.
- Electroporating DNA i embryonala hörsel explants:
- Tillsätt 10 ìl av plasmid-DNA-lösning till en ny 100 mm Sylgard belagd skålen och överför en fullt dissekeras cochlea Explantation (erhållen från steg 2.5) i DNA-lösning.
- Med lumenal yta av epitel uppåt, luta snäckan något så att det är vinkelrätt mot planet av skålen.
- Placera elektrod paddlar på vardera sidan av snäckan med negativ paddel (katod) mot det sensoriska epitelet och den positiva paddel (anod) placerad angränsande till basen på snäckan.
Anmärkning Eftersom DNA är negativt laddat, vandrar den från negativ till positiv elektrod och genom att placera katod änden av sonden intill den sensoriska epitelet; DNA kommer mestadels gå genom ytan av det sensoriska epiteliet. - Använda elektroporator, leverera 9 till 10 pulser av 24 mV, 30 ms pulslängd med fotpedalen omkopplaren på tHan elektroporator, och sedan lägga till 100 l varmt odlingsmedium till elektroporerade snäckan.
- Upprepa steg 3.2.1-4 för alla cochlea explantaten och för DNA av alla gener av intresse och för över elektrohörselsnäckor i källaren membranmatrisen belagda skålen för plätering (steg 2,7). Kultur all elektrohörselsnäckor i en 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator för önskade längder av tid som sedan kommer att behandlas för immuncytokemi.
OBS: koklea från en hel kull av CD1 mus (approximativt 8-12 valpar) kan isoleras, microdissected, elektroporeras och ströks ut i <4 tim.
4. Analys av Cochlear explant kulturer
OBS: Kulturerna vanligen inkuberas 6 DIV vilket motsvarar utvecklingsstadiet, P0. Efter inkubation in vitro kulturerna fixeras och bearbetas för immunocytokemi.
- Efter önskad längd incubation, ta bort odlingsmedium och snabbt skölja cochlea explantatet i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera i 4% paraformaldehyd (framställd i PBS) under 15 min vid rumstemperatur.
- Tvätta fixativ genom tillsats PBS och skölj i PBS tre gånger under 15 min.
- Permeabilisering med användning av PBS-T (PBS + 0,5% Tween) under 30 min före blockering med PBS-T innehållande 10% getserum.
- Inkubera i primär antikroppslösning innehållande primär antikropp i PBS-T med en% getserum natten vid 4 ° C.
- Tvätta koklea tre gånger vid rumstemperatur med användning av PBS-T 15 min vardera före tillsats lämpliga Alexa-konjugerade sekundära antikroppar.
- Eftersom cochlea explantatet odlas på täckglas kan hanteras individuellt genom att isolera täck från skålen och montering på en bild. Detta kan uppnås genom blötläggning av odlingsskålen i OS30 lösningsmedel under minst en timme vid rumstemperatur. Använda sterila rakblad, lossa täck från dish och montera på en bild och visualisera under ett fluorescerande mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla cellerna i membranös labyrint av musen innerörat inklusive sensoriska, nonsensory och de spiral ganglieneuroner härleds alla från placodally härledda otocyst belägen intill bakhjäman av ektoderm, runt E8 10-14. På E11, sträcker den ventrala regionen av otocyst att bilda cochlea kanalen och som utvecklingen fortsätter, en grupp av epitelceller i snäckan, liksom i andra regioner i otocyst, blivit angiven som prosensory patchar som senare kommer att ge upphov till olika typer av mechanosensory hårceller och nonsensory stödjande celler. I utvecklings snäckan, kan en rad av inre hårceller och tre rader av yttre hårceller identifieras runt E15.5 och E17, är i huvudsak komplett med enda rad av inre hårceller, pelaren celler och tre rader av yttre hårceller mönstring . I en tidsperiod som sträcker sig från E11 när cochlea kanalen börjar först växa ut genom E17 alla av difka cell öde beslut och mönstring ske inom utvecklings epitel att generera en slående cellulär mönster med en normala utrustning av hårceller och stödceller. Förlust av hårceller och / eller stödceller är den vanligaste orsaken till hörselnedsättning. Eftersom dessa celltyper genereras endast under en ganska kompakt tidsperiod under fosterutvecklingen, är det viktigt att förstå de molekylära och genetiska vägar som anger var och en av dessa celltyper som bör leda till betydande insikt i regenerativa strategier.
Cochlear odling och elektroporering tekniker har utvecklats för att manipulera genuttryck i utvecklings musen. I den här videon, har vi visat att odla tekniker för att generera primära explantat och en elektrotekniken för genleverans i odlade embryonala murina organ Corti. De primära explantat som framställts på detta sätt kan bibehållas under 7-10 dagar in vitro. Cochlea explantat can användas för att manipulera genuttryck genom farmakologiska metoder som gör det möjligt för oss att förstå de mekanismer som reglerar utvecklingsprocesser såsom ödet specifikation, engagemang, differentiering och mönstring. Dessutom underlättar denna metod analys av utvecklings fenotyper av mutant embryonala möss som inte överlever förbi E12.
Den fyrkantsvåg elektroporering genöverföring förfarande tillhandahåller en mekanism för att manipulera genuttryck i sensoriska hårceller, stödceller och celler inom GER och LER regioner för att visualisera sitt öde ex vivo. Med hjälp av denna procedur, kan vi nedreglera eller ectopically uttrycker specifika gener i prosensory celler, hårceller och / eller stödjande celler i en annars vildtyp bakgrund och analysera deras specifika effekter på ödet specifikation och differentiering. Detta gör det möjligt för oss att förstå specifika geners funktion inom utvecklings snäckan. Till exempel, såsom visas i
Även kan fastställas cochear kulturer så tidigt som E12, elektroporering av cochlea explantat yngre än E12.5 / E13 kommer att resultera i skador på vävnaden vilket gör det besvärligt för analys. Dessutom, promotorn av uttrycksvektorn som används avgör vilka celltyper transfekterade inom kokleära duct. Till exempel, den humana cytomegalovirus-promotorn innehållande expressionsvektorer ger robusta transfektion i Kollikers 'orgel, medan användning av CMV tidig förstärkare / kyckling-beta-aktin-promotor resulterar i högre effektivitet för transfektion i celler inom det sensoriska epitelet. De vanligaste problemen som uppstått under elektroporering av embryonala cochlea explantat är död driven cell och / eller skador på vävnaden och dålig transfektionseffektivitet. Den lämpliga avstånd mellan elektroderna och DNA-koncentrationen spelar en avgörande roll för att få minimal skada och högre effektivitet transfektion. Sammanfattningsvis dessa tekniker ökar vår förmåga att manipulera genuttryck via vinst eller förlust av funktionsstrategier och farmakologiska manipulationer och kraftigt stöd i dissekera signaler som påverkar mönstring och cell öde beslut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
- Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
- Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
- Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
- Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
- Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
- Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
- Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
- Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
- Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).
