Protocol
NOT: canlı hayvanlar kullanarak tüm protokolleri gözden ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve resmi laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yöntemler onaylı takip gerekir gerekir. Bütün tahlil temiz bir laminer akış tezgahı üzerinde, steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır. Eldiven ve maske, istenirse, bu işlem sırasında giyilmelidir.
Embriyonik Fare İç Kulak 1. Diseksiyon
- Corti eksplant kültürlerin organ için ayarlama:
- Yaklaşık 30 dakika, UV ışık yakarak laminer akış doku kültürü kapağı sterilize ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bir yüzeyin dezenfekte edilmesi. Buna ek olarak, ince diseksiyon araçları ve otoklav yoluyla embriyo diseksiyon veya kullanımdan önce en az 20 dakika süreyle% 70 etanol iliklerine Sylgard kaplı yemekleri dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletleri sterilize. Temiz bir laminer akış clea hava kurumaya yemekleri ve araçlar% 70 etanol dökün ve izinn tezgah kullanmadan önce.
- Hazırlama steril Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) / (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), HEPES 10x HBSS ve% 0.5% 10 eklenmesi ve yaklaşık pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve filtre sterilizasyonu ile (HEPES) karışımı 4 ° C'de, nihai çözelti saklayın. Daha iyi prosedür boyunca doku korumak için soğutulmuş HBSS / hepes çözeltisi içinde tüm diseksiyonları uygulayın.
- 15 ml'lik steril bir polipropilen tüp içinde taban membran matrisi bir 300 ul'lik bölüntü, steril (4 ° C) soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 5 ml ilave etmek suretiyle taban membran matrisi ile kaplayın cam alt yemekler. Içeriğini vorteks ile karıştırın ve kasesinin ortasına kadar mevcut tüm kültür kapsar, böylece her bir kültür kabı merkezine bazal membran matris DMEM karışımından 150 ul ilave edin. Kullanımdan önce en az 45 dakika süre ile 37 ° C inkübatör yemekleri ve mağaza örtün.
- Th içine HBSS soğutulmuş 4-5 ml dökünSteril polistiren petri kapları REE ve kaput kapalı bırakın.
- DMEM 9 ml N2 takviyeleri 100 ul, 10 ug / ml Cipro ve FBS, 1 ml ilave edilerek steril bir 15 ml'lik polipropilen bir tüp içinde kültür ortamı hazırlanır.
- Embriyoların izole edilmesi:
NOT: embriyonik farelerden alınan koklear eksplantlarm Bu prosedürde, hasat iç kulaklar embriyonik gün (E) den gübreleme gün sonra 13 temporal kemik E1 9 olarak kabul ediliyor. protokol de E12 dan E18 başlayan embriyonik fare iç kulakları ile kullanılabilir.- CO 2 ile zamanlanmış gebe fare Euthanize ve servikal dislokasyon veya uygun onaylanmış protokoller ile hayvan kurban. Doku kültürü odasında sterilite korumak için uzak laminer akış doku kültürü kaputu gelen euthanization yürütmek.
- Yukarı bakacak şekilde karın kağıt havlu üzerine ötenazi fare koyun ve% 70 etanol ile karın dezenfekte edin.
- Cildi kapma karın boşluğu açınBaşka bir el kullanılarak makas ile orta hat boyunca kavisli bir eliyle forseps ve kesme epidermis ve kas ile. Her iki tarafta iki dik kesim yapmak ve forseps ile bilateral uterin boynuz kaldırarak dikkatle rahim çekin ve bağ dokusu kullanılarak makas altından ayırmak.
- Laminer akışlı temiz bir tezgah soğutulmuş diseksiyon çözeltisi (HBSS / hepes karışımı) ve transfer ihtiva eden bir petri tabağına embriyonik zinciri yerleştirin.
- Plasenta dikkatlice embriyolar çıkarın ve diseksiyon çözeltisi içeren steril Petri kapları birine yerleştirin. Çözüm kanlı dönerse, yeni bir Petri kabı taşıyabilirsiniz.
NOT: Bu noktada, embriyolar, bir Theiler evreleme kılavuzunu kullanarak sahnelenecek edilebilir. - Temiz forseps veya makasla ile boyun bölgesinde kısma embriyolar başını kesmek ve soğutulmuş diseksiyon çözeltisi içeren taze Petri kabındaki başkanları yerleştirin.
- İç kulak Diseksiyon:
- Yeri oSoğuk diseksiyon içeren bir steril sylgard çanak ne embriyo baş
- Çözelti. ~ 1.6x bir büyütmede bir mikroskop altında çalışarak, göz bölgesi (Şekil 1A) etrafında ya da daha yakın Minutien işaretçilerini yerleştirerek embriyo baş hareketsiz.
- Steril forseps iki çift kullanarak dikkatli bir şekilde cilt kaldırmak ve orta hat (Şekil 1B) boyunca sırt tarafında kafatasını açmak. Kranial kavite ve temporal kemiklerin içinde yer alan iç kulaklar, bu aşamada (Şekil 1C, D) tespit edilebilir beyni çıkarın. Genellikle, iç kulak çevresine mevcut kan damarı, astar, bu aşamada (Şekil 1D), iç kulak belirlemek için bir işaret olarak kullanılabilir.
- Dokuda altına forseps yerleştirerek ve soğuk diseksiyon çözüm içeren yeni bir çanak kafatası ve transfer tabanından iç kulak izole ederek zamansal kemiklerden iç kulak incelemek (Şekil 1E, F).
Corti Eksplant Kültürler Organ 2. Nesil
NOT: Bu gelişme aşamasında, doku kıkırdak ve kolayca forseps kullanılarak disseke edilebilir.
- Orient ventral yüzü (Şekil 2A) yukarı bakacak ve yavaşça iç kulak (Şekil 2B) vestibüler bölümü ile Minutien pim keskin ucunu takarak iç kulak stabilize böylece iç kulak.
- Kullanımı ultra ince forseps koklea (Şekil 2C) kıkırdak kaldırmak dikkatlice oval pencereye yakın forseps bir ucunu kullanarak ve bir kesi yaparak örten kıkırdak kesip.
NOT: Bu örten kıkırdak bazen altına kazıma ile altta yatan koklear kanal gelen kıkırdak serbest bırakmak için kapalı forseps kullanmak yararlı olduğu durumda koklear kanal ile kaynaşmış olarak forseps kıkırdak içine çok derin takılı olmadığından emin olmak için önemlidir sKıkırdak, sert bir yere. Bu gelişme aşamasında, koklear spiral uzunluğu bir dönüş sadece dörtte üçü olduğunu. - Sonraki baz ya da çok apeks de ya koklear kanal tercih edilen bölgede forseps koyarak duyusal epitel maruz ve yavaşça koklea (Şekil 2B) çatısı çekerek.
NOT: Kokleanın çatı o analizini engelleyen duyusal epitel maske gibi tamamen kaldırılmalıdır.
NOT: duyusal epitel gözyaşı kolay olduğu gibi bu işlem nazikçe yapılmalıdır. - Koklear eksplant tabanı eşit düz böylece son adım olarak, dikkatle maruz duyusal epitel yatan bağ doku kaldırmak.
- Forseps kullanarak iç kulak vestibüler kısmından disseke koklea izole edin. Bu, daha önce ya da aşama 2.4 (Şekil 2E) sonra gerçekleştirilebilir.
- Bir bodrum membra içine disseke koklear duyusal epitel aktarınne matris kaplı kültür de bir 1,5 mm steril scooper (Şekil 2F) kullanılarak.
- Orient epitel lümenal yüzeyi ile koklear eksplant yukarı bakacak ve dikkatle doku dümdüz ve hafifçe çanak ekleyerek taze kültür ortamı 150 ul ile değiştirmek için bazal membran matris-DMEM çözüm aspire. Bakım, her eksplant kaplamalı cam lamel iyi yapışır ve kültür ortamı içinde yüzen olmadığından emin olmak için alınmalıdır. Koklear eksplant zarar vermemek için cam kuyuya yapıştırılması sırasında forseps ucu kadar sivri olduğundan emin olun.
- Yavaşça İstenilen bir zaman, in vitro olarak, genellikle 3-6 gün (DIV),% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir steril 150 mm kültür çanağı ve yerine kültür kaplarına transfer. 1 DIV sonra, koklear eksplant kültürü çanak iyi yapışmış emin olmak için bir mikroskop altında kültürleri incelemek.
- Sonrasıistenen zaman uzunlukları için in vitro cubation, kültürler imünohistokimya için işlenir.
Not: eksplant kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler, immünohistokimya gibi, daha aşağıda uygulama (Şekil 3B) için işlenebilir, RT-PCR, in situ hibridizasyon ve / veya Western blot.
3. Elektroporasyon aracılı gen transferi
- Elektroporasyon için ayarlama:
- Otoklavda veya yaklaşık 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatılarak bir 100 mm Sylgard kaplı cam tabak sterilize ve kullanımdan önce temiz bir tezgah içinde kurumaya bırakın.
- Uygun maksi veya Midi-prep kitleri kullanılarak seçim bir ifade vektörü DNA hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ifade vektörleri pIRES2-Atoh1.EGFP ve pCLIG-NeuroD1.EGFP vardır. DNA nihai konsantrasyon steril DNA, en az 1 ug / ul olmalıdır /RNAse içermeyen su.
- Embriyonik koklear eksplantlarından içine DNA electroporating:
- Taze 100 mm Sylgard kaplı çanak plazmid DNA çözeltisinin 10 ul ekle ve DNA çözeltisi (adım 2.5 de elde edilmiş), tam kesilmiş koklear eksplant aktarın.
- Çanak düzlemine dikey olacak şekilde yukarı bakacak şekilde epitelyum lümenal yüzeyi ile hafifçe koklea yatırın.
- Duyusal epiteli ve koklea tabanına bitişik bulunan pozitif raket (anot) doğru negatif kürek (katot) ile koklea iki tarafında elektrot kürekler yerleştirin.
Not: DNA, negatif yüklü olduğu için, pozitif elektrot ve duyu epitel bitişik sonda katot ucuna yerleştirilerek negatiften göç; DNA, çoğunlukla duyusal epitel yüzeyine geçer. - Elektro-kullanma, 24 mV 9-10 darbeler teslim, t ayak pedalı ile 30 msn darbe süresiO Electroporator ve ardından Electroporated cochlea'ya sıcak kültür ortamı 100 ul ekleyin.
- Tekrar tüm koklear eksplant ve ilgi tüm genlerin DNA için 3.2.1-4 adımları ve (adım 2.7) kaplama için bazal membran matris kaplı çanak içine electroporated cochleae aktarın. Daha sonra, bağışıklık kimyası için işlenecektir arzu edilen bir zaman uzunlukları için 37 ° C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde kültür Electroporated cochleae.
NOT: CD1 fare (yaklaşık 8-12 yavru) bütün bir çöp gelen koklea, izole microdissected, Electroporated ve <4 saat içinde kaplama olabilir.
4. Analiz Koklear Eksplantın Kültürlerin
Not: kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler sabitlenmiş ve immünolojik hücre kimyası için işlendi.
- Inc istenilen uzunlukta sonraubation, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) 'de koklear eksplant yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (PBS içerisinde hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid içinde inkübe edilir.
- 15 dakika boyunca üç kez ekleyerek PBS ile fiksatif yıkayın ve PBS içinde durulayın.
- % 10 keçi serumu içeren PBS-T ile bloke önce 30 dakika için PBS-T (PBS +% 0.5 Tween) ile geçirgenliği.
- 4 ° C de bir gece boyunca,% 1 keçi serumu ile PBS-T ile primer antikor ihtiva eden birincil antikor çözelti içinde inkübe edilir.
- Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor ilave edilmeden önce PBS-T her biri 15 dakika kullanılarak oda sıcaklığında koklea üç kez yıkayın.
- Koklear eksplant cam lamel kültüre olduğundan, çanak lamel izole ve bir slayt monte edilerek tek tek ele alınabilir. Bu, oda sıcaklığında en az 1 saat için çözücü, OS30 kültür çanağı ıslatılmasıyla elde edilebilir. Steril jilet kullanarak, d lamel ayırmakish ve bir slayt monte ve bir floresan mikroskop altında görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dahil olmak üzere, bir fare, iç kulağın membranöz labirent içindeki tüm hücreler duyusal duyunun ve spiral gangliyon nöronlarının her E8 10-14 civarında, ektodermin Beyin bitişiğinde yer otocyst placodally türevi elde edilir. E11 içinde otocyst ventral bölgesi koklear kanal oluşturmak üzere uzanır ve geliştirme devam ederken haline koklea içindeki epitel hücreleri yanı sıra otocyst diğer bölgelerinde bir grup, daha sonra ortaya çıkaracaktır prosensory yamalar olarak belirtilen mechanosensory saç hücreleri ve duyunun destekleyici hücrelerin farklı. Gelişmekte olan koklea, iç saç hücreleri bir satır ve dış saç hücrelerinin üç sıra E15.5 etrafında ve E17 ile tespit edilebilir, desenlendirme iç saç hücreleri, ayağı hücreleri ve dış saç hücrelerinin üç satır tek satır ile esasen tamamlandı . Koklear kanal ilk olarak E17 ile dif tüm dışarı büyümeye başlar E11 dan yayılan bir süre içindeferent hücre kaderi kararları ve desenlendirme saç hücreleri ve destek hücreleri normal bir tamamlayıcısı olan bir çarpıcı hücresel desen oluşturmak için gelişmekte olan epitel içinde ortaya çıkar. Saç hücreleri ve / veya destek hücrelerinin kaybı işitme önde gelen nedenidir. Bu hücre tipleri yalnızca embriyonik gelişim sırasında oldukça kompakt bir dönemde üretilen bu yana, rejeneratif stratejileri içine önemli fikir gitmelidir bu hücre tiplerinin her belirtmek moleküler ve genetik yollar anlamak önemlidir.
Koklear kültürleme ve elektroporasyon teknikleri gelişen farenin içinde gen ekspresyonunu değiştirmek için geliştirilmiştir. Bu videoda, birincil eksplantlar ve Corti kültürlü embriyonik fare organ haline gen aktarımı için bir elektroporasyon tekniği üretilmesi için teknikleri kültürleme göstermiştir. Bu şekilde hazırlanan primer eksplantlan, in vitro olarak 7-10 gün boyunca muhafaza edilebilir. Koklear eksplantlar can böyle kaderi şartname, bağlılık, farklılaşma ve desenlendirme gibi gelişimsel süreçleri düzenleyen mekanizmaları anlamak için bize sağlayacak farmakolojik yaklaşımlarla gen ifadesini işlemek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem E12 geçmiş hayatta olmayan mutant embriyonik farelerin gelişim fenotip analizi kolaylaştırır.
Kare dalga elektroporasyon aracılı gen transferi prosedürü kendi kaderini ex vivo olarak görselleştirmek için duyusal saç hücreleri, destek hücreleri ve GER ve LER bölgeleri içindeki hücrelerde gen ifadesinin işlemek için bir mekanizma sağlar. Bu prosedürü kullanarak, azaltan veya ektopik bir başka doğal tipte arka prosensory hücreler, saç hücreleri ve / veya destek hücrelerin spesifik genleri ifade ve kaderi özellikleri ve farklılaşması üzerinde spesifik etkileri analiz edilebilir. Bu gelişmekte olan koklea içinde belirli gen fonksiyonlarını anlamak için bize sağlayacaktır. Örneğin, gösterildiği gibi,
Cochear kültürleri gibi erken E12, E12.5 daha küçük koklear eksplant elektroporasyon gibi tespit edilebilir, ancak / E13 analizi için hantal hale dokuya hasar görmesine neden olur. Buna ek olarak, ifade vektörünün hızlandırıcı hücre tipleri koklear du içinde transfekte olduğunu tespit kullanılanct. Örneğin ekspresyon vektörleri içeren insan sitomegalovirüs promoteri, Kollikers 'organı sağlam transfeksiyon elde edilir ise duyu epitel içinde hücreler içinde transfeksiyonuyla yüksek etkinlik CMV erken güçlendirici / tavuk beta aktin promotörü sonuçlanır. Embriyonik koklear eksplant elektroporasyon sırasında karşılaşılan ortak sorunlar, aşırı hücre ölümü ve / veya doku ve zayıf transfeksiyon verimliliği hasar vardır. Elektrotlar ve DNA konsantrasyonu uygun boşluklar en az hasar ve daha yüksek transfeksiyon verimi elde edilmesinde önemli bir rol oynar. Özetle, bu teknikler kazanç veya fonksiyon stratejileri ve farmakolojik manipülasyonlar kaybı yoluyla gen ifadesini işlemek ve büyük ölçüde desenleme ve hücre kaderi kararlarını etkileyen sinyaller diseksiyon yardımcı yeteneğimizi geliştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
- Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
- Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
- Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
- Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
- Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
- Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
- Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
- Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
- Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).
