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Medicine

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

doi: 10.3791/52261 Published: November 17, 2014

Summary

Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.

Abstract

Atemwegserkrankungen Studien beinhalten typischerweise die Verwendung von murinen Modellen als Ersatzsysteme. Es gibt jedoch signifikante physiologische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Atemwege, insbesondere in ihren oberen Atemwege (URT). In einigen Modellen können diese Unterschiede in der murinen Nasenhöhle einen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf und die Darstellung in der unteren Atemwege (LRT) haben bei Verwendung intranasale Instillation Techniken, die Nützlichkeit der Mausmodell limitierender um diese Krankheiten zu untersuchen. Aus diesen Gründen wäre es vorteilhaft, ein Verfahren, um Bakterien direkt in den Mäuselungen um LRT Erkrankung in Abwesenheit der Beteiligung des URT studieren vermitteln zu entwickeln. Wir haben diesen Lungen bestimmte Liefer Technik Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation bezeichnet. Dieses nichtinvasive Technik minimiert das Potential zur Instillation in die Blutbahn, die während invasiver Servier auftreten kannonal chirurgischen intratrachealer Infektion Ansätze, und begrenzt die Möglichkeit der zufälligen Verdauungstrakt Lieferung. IMIT ist ein zweistufiges Verfahren, bei dem Mäuse werden zunächst intubiert, mit einem Zwischenschritt, um die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu gewährleisten, gefolgt von Einführen einer stumpfen Nadel in den Katheter zur direkten Abgabe von Bakterien in den Lungen zu vermitteln. Dieser Ansatz ermöglicht eine> 98% Wirksamkeit der Zustellung in die Lunge mit hervorragenden Verteilung der Reagenzien in der gesamten Lunge. Somit stellt IMIT einen neuartigen Ansatz zur LRT Krankheit und therapeutische Abgabe direkt in die Lunge zu untersuchen, die Verbesserung bei der Fähigkeit, Mäuse als Surrogate für die menschliche Atemwegserkrankung zu untersuchen verwenden. Darüber hinaus macht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Abgabesystem es auch zugänglich Good Laboratory Practice Standards (GLPS), sowie die Lieferung von einer Vielzahl von Reagenzien, die hohe Effizienz in der Lunge erforderlich.

Introduction

Mäusen wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Krankheitserscheinungen, einschließlich einer Vielzahl von Erkrankungen der Atemwege zu modellieren. Surrogatkrankheitsmodelle sind häufig nicht in der Lage, alle Aspekte eines modellierten Erkrankung rekapitulieren, typischerweise aufgrund von wichtigen physiologischen oder Immun Unterschiede in den beiden Aufnahmemodelle. Somit ist ein Ziel der Verbesserung der Modellsysteme, um Ansätze, die Surrogate, enger spiegeln einen Krankheitsprozess oder Gastgeber Antwort als in der ursprünglichen Host-System beobachtet ermöglichen zu entwickeln. Es gibt mehrere wichtige physiologische Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen in der Mechanismus, durch den sie Luft zu begeistern. In diesen Unterschieden gehören bedeutende ratiometrische Größenunterschiede zwischen den URT und LRT. Es wurde geschätzt, dass Mäuse besitzen> 100 die URT Fläche bezogen auf den Menschen, normalisiert gegen totale Lungenkapazität 1,2 falten. Somit werden die Nasenmuscheln der Maus ermöglichen eine umfangreiche Filterung von eingeatmeten Luft, um eine viel größere Geschwindigkeit von breathi erleichternng, die einen erheblichen Einfluss auf Untersuchungen der Lungenentzündung aufweisen kann, wenn eine Infektion der Nasenhöhle spielt eine bedeutende Rolle bei der Progression der Erkrankung.

Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Bakterien in den Lungen von Mäusen vermitteln, um menschenähnliche Atemwegserkrankungen zu untersuchen. Die häufigste dieser Ansätze ist die intranasale Impfung, bei dem eine flüssige Suspension wird auf einer oder beiden Nasenlöchern einer Maus aufgetragen. Während relativ einfach, Vorbehalte wie Einträufeln Volumen und Art der Anästhesie verwendet wird, kann die Effizienz der Instillation über intranasale Impfung 3-5 in die LRT auswirken. Insbesondere Miller et al. haben gezeigt, dass die intranasale Applikation von Francisella tularensis in Mengen von weniger als 50 & mgr; l nicht in dem Einträufeln der Bakterien führen in die LRT 6 gezeigt. Sie weiterhin beobachtet besser LRT Instillation bei Verwendung inhalativen Isofluran im Gegensatz zu injiziert Ketamin / Xylazin für Anästhesie. Aber unsere experience mit Yersinia pestis intranasale Impfung zeigt konsequenter Impfung kann mit Ketamin / Xylazin erreicht im Vergleich zu Isofluran (MBL, unveröffentlichte Daten) werden. Diese Unterschiede könnten zurückzuführen verwendet Erreger oder bei Laborverfahren Vielfalt, aber wichtiger ist unterstreichen das Potenzial Variabilität in dieser Technik. Weiterhin Lungen kurz nach intranasaler Instillation zeigen, daß ein relativ geringer Prozentsatz der ursprünglichen bakteriellen Inokulums die Lunge erreicht geerntet (in dem Fall von Y. pestis, wurden nur 10% zurückgewonnen 1 h nach der Instillation 7), was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von Bakterien konnte in der URT beibehalten werden (oder in den GI-Trakt Verschlucken). In bestimmten Krankheitsmodellen kann dies signifikante Ablagerung von Bakterien auf der Schleimhaut URT unser Verständnis des Fortschreitens der Krankheit zu verwechseln, wenn der Organismus in der Lage, die Kolonisierung der murine Nasenhöhle in einer Weise, die dem menschlichen Krankheit ist. Zum Beispiel unter Verwendung von in vivo </ Em> Bildgebung, wurde beobachtet, dass Burkholderia pseudomallei, die den menschlichen URT nicht besiedeln wird, bewirkt eine überwiegende opportunistische Infektion der Nasenhöhle, wenn murine die intranasale Instillation Methode 8 geliefert.

Andere Verfahren zum Einträufeln Bakterien in den Lungen der Mäuse wurden auch in Infektionsforschung eingesetzt. Im Vergleich zu intranasale Instillation diese Methoden neigen jedoch dazu, mehr technisches Know-how und / oder teure Ausrüstung, ohne die Beseitigung der Potenzial für Infektion Einleitung an mehreren Standorten (zB Aerosol [URT und LRT] erfordern; transorale [Verdauungstrakt und LRT]; und chirurgische intratracheale [LRT und Blutstrom]). Angesichts der möglichen Komplikationen, die mit sekundären Standorten der Infektion in Verbindung gebracht werden konnte, haben wir versucht, eine intratracheale Ansatz, der die URT umgeht und liefert Erreger direkt in die Lunge von betäubten Mäusen zu entwickeln, sondern begrenzt auch unbeabsichtigte inoculatIon in den Blutstrom oder GI-Trakt. Zu diesem Zweck wurde Intubation vermittelte intratracheal (IMIT) Instillation als nicht-chirurgischen Verfahren, LRT Instillation Inokulum gewährleistet, indem ein Zwischenschritt zur richtigen Platzierung des Katheters vor dem Einträufeln überprüfen entwickelt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von Farbstoff-Instillation beschrieben visuell nachweisen breite Verteilung des Inokulums in der gesamten Lunge und P. aeruginosa Einträufeln in das hochwirksame Lieferung (> 98% des Inokulums) dieses Verfahrens in die Lunge nachzuweisen. Wichtig ist, während ursprünglich für bakterielle Liefer entwickelt, bietet IMIT auch ein wirksames Instrument für: i) Instillation verschiedener Moleküle für die Untersuchung von anderen Krankheitsmodellen Atem, ii) lungenspezifischen therapeutischen Lieferung und iii) Grundlungenfunktion Studien, einschließlich gezielter siRNA in die Lunge.

Protocol

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der University of Louisville Institutional Biosafety Committee (Protokoll # 13-056) und Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll # 13-064) zugelassen.

1. Herstellung der Farbstoff

  1. Verdünnter 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS und filtersterilisieren Verwendung eines 0,45 um-Spritzenfilter.

2. Herstellung von Pseudomonas aeruginosa Kultur

  1. 15 Stunden vor dem Einträufeln, impfen 3 ml Kulturbrühe mit einem einzigen Bakterienkolonie.
  2. Die Kultur 15 h bei 37 ° C auf einem Schüttler (200 rpm).
  3. Zentrifuge 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 12.000 × g für 30 sec.
  4. Entfernen des Mediums und Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS.
  5. Einen aliquoten des bakteriellen Stoffsuspension 1:10 in PBS und messen die OD 600 der verdünnten Bakteriensuspension auf die BestimmungBakterienkonzentration.
  6. Verdünnen der Bakterienstammsuspension in PBS auf die gewünschte Konzentration der bakteriellen Impfkultur, mit einem Fördervolumen von 50 & mgr; l für IMIT Inokulation.

3. IMIT Instillation

  1. Legen Sie eine Gruppe von Mäusen in Isofluran-Narkose Induktionskammer und betäuben mit einer 2 - 3% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch.
  2. Beim ersten Auftreten von Sedierung, scruff die Maus, die Maus aufrecht, und verwalten 10 ul einer 2% Lidocain-Lösung durch Sondennadel an der Rückseite des Halses und damit die Lösung auf der Epiglottis zu entleeren. Liefert die Maus an den Anästhesieraum.
    1. Warten Sie mindestens 5 Minuten, um das Lidocain erlauben volle Wirkung als Lokalanästhetikum zu nehmen.
  3. Bei Mäusen gewünschte Niveau der Sedierung erreicht (Atemgeschwindigkeit von ~ 60 min) und der Verringerung der Isofluran zu 2% bis Sedierung zu erhalten.
  4. Preload Farbstoff oder Bakterieninokulum in einen 250 ul gasdichtePräzisionsspritze fit mit einem 22 G lange stumpfe Nadel.
    1. Zunächst erarbeiten 150 l Luft, durch die Teflon Kolben der Spritze gemessen. Als nächstes erstellen 50 ul Inokulum durch Vorschieben des Teflon Kolben aus der 150 ul Marke, die dem 200 ul Markierung auf dem Spritzenkörper.
      HINWEIS: Wenn die Probe in einem intubierten Maus ausgestoßen wird, wird das 50 & mgr; l Suspension zuerst durch ein 150 & mgr; Luftkissen, das Inokulum in der gesamten Lunge verteilt werden geliefert, gefolgt.
  5. Entfernen Sie eine Maus aus der Induktionskammer und lag auf dem Rücken auf einer Intubation Plattform. Sichern Sie die Maus auf die Plattform durch Einhaken seine Schneidezähne mit einem O-Ring, um Klettband befestigt und das Klettband befestigen an der Plattform. Heben Sie die Maus auf eine 45 ° Neigung.
  6. Mit Hilfe eines Mikro Baumwolle Applikator, zurückzuziehen die Zunge mit einer rollenden Bewegung, mit der dominanten Hand.
  7. Mit der nicht-dominanten Hand, verwenden Sie ein Operations-Otoskop fit mit einer Intubation Trichter sowohl maintain Zungenretraktion und Visualisierung der Stimmritze.
  8. Mit der dominanten Hand, verwenden Sie ein Führungsdraht durch eine 20 G-Katheter eingeschraubt, um die Maus zu intubieren, Sitz den Katheter auf eine 10 mm Tiefe in die Maus Trachea (Katheter ist fit mit einer Silikonmanschette mit 10 mm der Katheter). Entfernen Sie das Otoskop / Spekula.
  9. Bestätigen Sie, dass die Maus wurde korrekt durch die Sicherung der Katheter mit dem dominanten Hand, während kurz Anbringen eines Luer angeschlossenen Länge 1/16 "durchsichtigen Schlauch enthält einen Farbstoff intubiert.
    HINWEIS: Der Farbstoff wird schnell hin und her wandern in Reaktion auf die Atmung.
  10. Nicht mit den nachfolgenden Schritten fort, wenn eine Bestätigung der Intubation hat an dieser Stelle nicht etabliert. Wenn die Intubation fehlgeschlagen versuchten Zurücksetzen der Katheter und Führungsdraht für einen zusätzlichen Versuch Intubation.
    HINWEIS: Es ist nicht ratsam, mehr als zwei intubations einer Maus in einer Sitzung ohne Trauma der Maus versuchen.
  11. Weitersichern Sie den Katheter mit dem dominanten Hand, während Sie den Präzisionsspritze / stumpfe Nadel, die die flüssige Suspension / Luftpolster.
  12. Abgeben der Flüssigkeit / Luft direkt in die Lunge in einer einzigen fließenden Bewegung und entfernen Sie sofort die Nadel / Katheter von der Maus.
  13. Liefert die Maus an einen Käfig und eine Wiederherstellung aus der Narkose.

4. Charakterisierung von IMT Liefer

  1. Nach IMIT Einträufeln einschläfern die Maus durch CO 2 Asphyxie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Inokulation.
  2. Sichern Sie die eingeschläfert Maus auf eine Dissektion Bord und genießen Sie die Brust und Bauch mit 70% EtOH mit Spritzflasche.
  3. Wenn die Bewertung Verteilung eines Bildgebungsmittel in der gesamten Lunge, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik und zeigt die Lunge als angemessen für die Bildgebung.
    HINWEIS:. Lungs können für zusätzliche histologische Färbetechniken durch geeignete Fixierung oder Kryokonservierung vorbereitet werden </ Li>
  4. Wenn die Beurteilung der bakteriellen Belastung von infizierten Lungengewebe, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik. Platz Lunge in eine sterile, vorgewogen 1 Unze Probenbeutel. Weigh und nimmt das Gewicht des Probenbeutel + Lunge.
    1. 1 ml sterilem 1x PBS zu jeder Probe bag + Gewebe. Reseal Probenbeutel.
    2. Homogenisieren Geweben durch sanftes Rollen einer 25 ml serologische Pipette über dem Probenbeutel + Gewebe.
    3. Generieren serielle Verdünnungen des Lungenhomogenat in sterilem PBS und Teller auf Agar-Platte (LB, oder gegebenenfalls an die Bakterienarten untersucht):
      1. Führen Sie eine sechsfache serielle Verdünnung in einem U-Boden 96 Well-Platte mit Mehrkanalpipette dann Platte dreifachen Proben von Mehrkanal auf der Agarplatte.
    4. Inkubieren Agarplatten über Nacht bei 37 ° C und aufzuzählen koloniebildenden Einheiten des nächsten Tages.

Representative Results

Um die Verteilung des Materials über die instilliert IMIT Verfahren zu visualisieren, wurden 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue-Farbstoff in die Lungen eines anästhesierten Maus eingeimpft. Die Maus wurde sofort getötet und die Lungen wurden durch sterile Nekropsie entnommen. 1 zeigt, dass der Farbstoff zu allen Lappen der Lunge zugeführt.

Um die Menge der Bakterien in die Lunge über den IMIT Verfahren geliefert, drei Gruppen von Mäusen (n = 3) wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen von P. eingeflößt bestimmen, aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, und 1,21 x 10 6 koloniebildenden Einheiten [CFU] pro 50 ul). Unmittelbar nach IMIT Instillation wurden die Mäuse getötet, die Lungen entfernt und Bakterienzahlen wurden gezählt und auf die Impfkulturen (2) verglichen. Lieferung des Inokulums ist hoch effizient mittels diesem Verfahren bei> 98% des Inokulums von den Lungen zurückgewonnen von eingeflößtTiere. Weiterhin wurde IMIT Instillation unabhängig von der Konzentration des Inokulums (R 2 = 0,9951) hoch reproduzierbar.

Figur 1
Abbildung 1: IMIT Instillation verteilt Inokulum in den Lungen von Lungen von Mäusen, die mit 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue zeigen blaue Farbstoff in allen Lappen verteilt tropft..

Figur 2
Abbildung 2:. IMIT Einträufeln von Bakterien in die Lungen Mäuse wurden mit P. eingeflößt aeruginosa und die Anzahl der Bakterien in die Lunge eingeträufelt (Log 10 CFU - gewonnen) wurden auf die geschätzte Inokulum Vergleich (Log 10 CFU - geliefert). Jeder Kreis stellt die CFU / Lunge eines einzelnen Maus (n = 3 für jedeBakteriendosis).

Discussion

IMIT Einträufeln bietet wichtige Verbesserungen an bestehenden Modellen Atemwegserkrankungen in der Fähigkeit, reproduzierbar einzuflößen Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle Annäherung, die ideal für ein Team von zwei Forschern, von denen man es schafft die Logistik der Anästhesie und Käfighaltung liegt, und die andere, die das IMIT Technik führt. 3 min pro Maus - Große Studien können unter Verwendung IMIT mit einem durchschnittlichen Zeitaufwand von 2 durchgeführt werden. Da der Ansatz nutzt Isofluran als Anästhetikum, Mäuse erholen sich rasch aus der Narkose, die Verringerung der Haltungszeit der Überwachung Tiere durch Erholung.

Die technisch schwierigste Aspekt der IMIT Verfahren ist der erste Schritt der Intubation Mäusen. Menschen lernen IMIT auszuführen in der Lage sind, auf diesem ersten Schritt der Platzierung des Katheters und die Gewährleistung, dass die Intubation wurde durch die visuelle Bestätigung der Farbstoffbewegung erreicht konzentrieren. Der Vorteil des Ansatzes ist, dass Lungen-specific Einträufeln wird durch die Verwendung der Bestätigung der Intubation, die das Vertrauen sowohl der neue Forscher sowie der Experte versucht den schwierigen Tier intubieren erhöht garantiert. Die wichtigsten Elemente der Optimierung der Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation sind: i) Erreichung einer tiefen Sedierung, genügend Arbeitszeit zu ermöglichen, ii) die korrekte Platzierung des Trichtern in den Mund, um eine gute Visualisierung des Kehldeckels ermöglichen, iii) gute Tiefe Platzierung der Trichter, so daß die Zunge bleibt während des Verfahrens zurückgezogen wird, und iv) die Verwendung der Kipp-Plattform, um die Hände des Forschers zu unterstützen, so dass das Verfahren entspannt und mit einem stetigen Ansatz durchgeführt.

Eine der Einschränkungen des IMIT Verfahren wird auf die Frequenz des IMIT Instillation Ereignissen. Aufgrund der möglichen Trauma mit einer verpassten Intubation verbunden sind, ist es nicht empfehlenswert, dass mehr als zwei Intubationsbemühungen (bis zu zwei Fehlschüsse) in einer einzigen Sitzung durchgeführt werden. IMIThat ein ausgezeichnetes Potenzial in seiner Fähigkeit verwendet werden, um Therapeutika in das murine Lungen liefern kann jedoch Therapieschemata, die Verwendung von sehr häufige Abgabe von Reagenz in die Lunge zu nicht geeignet für IMIT sein. Es ist möglich, dass IMIT konnte täglich verwendet, um Reagenzien in eine murine Lungen ohne bedeutende Trauma zu liefern, aber nur, wenn sie durch einen hochqualifizierten Forscher durchgeführt, da die Mehrheit der Trauma Intubation assoziiert ist gedacht, um mit einem verpassten Intubation Ereignis zugeordnet werden . Solche Hochfrequenz IMIT sollte mit lokalen Tierärzten und IACUC diskutiert werden.

Eine zusätzliche Einschränkung des potentiellen IMIT ist die Größe der Maus, wobei intubiert wird. 22 g, bei einer 20-g-Katheter wurde gefunden, daß eine geeignete Größe für die Luftröhre von Mäusen in diesem Größenbereich sind - das oben beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung IMIT Mäusen von etwa 17 entwickelt. Größere Kathetern wurden erfolgreich in älteren Mäusen verwendet; die anfängliche Entwicklung von IMIT made Verwendung einer 18 G-Katheter in BALB / c-Mäusen, die> 20 g sind. Wichtig ist, dass, wenn alternative Kathetergrößen verwendet werden, sollten stumpfen Nadeln stammen, welche das Lumen des Katheters zu passen und mit einer Länge, die gerade über die Katheterspitze 1 mm erstreckt getrimmt werden. Intubation von Mäusen kleiner als 17 g ist möglich, wird aber nicht durch die erforderliche Fachwissen empfohlen und würde die Verwendung von kleineren Kathetern und Spekula als oben beschrieben erforderlich.

Wir haben IMIT für die Lieferung von mehreren Atemwegspathogene neben P. verwendet aeruginosa, einschließlich B. pseudomallei 9 und Klebsiella pneumoniae 10. Die IMIT Modell hat wichtige Fortschritte in unseren Studien von B. gemacht pseudomallei Atemwegserkrankungen, nachdem festgestellt, dass die intranasale Impfung bewirkt eine frühe, URT-Morbidität von Mäusen statt der systemischen Erkrankung Endpunkt in menschlichen Erkrankungen 9 beobachtet. B. pseudomallei ist ein Tier 1 Select Agent der Abwehr von Biowaffen Auswirkungen, und als solche, Modelle Atemwegserkrankungen werden für Aerosolexposition entwickelt, welche Modelle ein potenzieller Biodefense bezogenen Route der Eintrag für waffenKrankheitsErreger. Da aktuelle Aerosolmodelle führen zu Infektion sowohl der URT und LRT, das gleiche Potential früh Morbidität Phänotypen haben wir für die intranasale Modell von B. identifiziert pseudomallei Atemwegserkrankung kann dem Aerosol Modell anzuwenden. Eine zukünftige Anpassung der IMIT Modells könnte eine Intubation vermittelte Aerosolabgabe (IMAD), in dem Mäuse werden für die Zielaerosolabgabe nur in die Lunge intubiert werden. Mechanische Ventilatoren derzeit zur Verfügung stehen Isofluran-Narkose, die angepasst werden kann, um eine aerosolierten, anstatt auf Flüssigkeitsbasis, Erreger Herausforderung liefern zu halten.

IMIT wurde zunächst als ein Ansatz entwickelt, um die Abgabe von Bakterien in der Lunge zu optimieren, sondern findet auch Anwendung für die Lieferung von anderen Reagenzien in der Mäuselunge. Als disoben diskutiert, intranasale Verabreichung von Verbindungen in Mäuse führt zu einer geringen Effizienz, sehr variable Lieferung von Reagenzien in das Zielorgan Lunge. Intranasale Verabreichung von Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung Reagenzien zu der Mäuselunge ergab eine 40% Liefereffizienz 11, während wir haben gezeigt, dass IMIT bietet eine hervorragende Alternative zu anderen Lungenliefer nähert mit> 98% Liefer Wirksamkeit und multilobäre Verteilung. Diese Verbesserung in der zielgerichteten Abgabe an die Lunge hat das Potential, die Reproduzierbarkeit der therapeutischen Abgabe zur Behandlung von Lungenerkrankungen. IMIT könnte ähnlich Vorteile anbieten, um Studien über: i) die Auswirkungen von Umweltlungenreizstoffe, ii) Lungenkrebs phänotypische Studien, iii) lungenspezifischen siRNA knock-down.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rodent, Tilting WorkStand Hallowell EMC 000A3467 Base should be detached when working in a BSC
Operating Otoscope Head Welch Allyn 21700
Otoscope 3.5 V Li Battery Welch Allyn 71900
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable Hallowell EMC 200A3589S
Incisor Loops Hallowell EMC 210A3490A
Cotton fine tip applicator Puritan 871-PC DBL  Used for tongue retraction
I.V. Catheter, 20 G Exel Int 26741 Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface
Gas tight syringe, 250 ul Hamilton 81120 Used for delivery of liquid inoculum by IMIT
Blunt Needle, 22 G Hamilton 91022 Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) TheFiberOpticStore.com FOF .50 Cut to 6" length: used as guide wire for intubation
Tuberculin syringe, 1 ml Becton Dickinson 309659 Assemble with fiber optic wire as guide wire
Brilliant Blue R (Coomassie) Sigma B0149
Tygon tubing, 1/16" Saint Gobain ALC00002 
Male Luer 1/16" barb Cole Parmer 45503-22
Female Luer 1/16" barb Cole Parmer 45500-00
Lidocaine, USP Spectrum LI102 pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0
Sample bag, 1 oz Whirl-Pak B01067
U-bottom 96 well plate, sterile Greiner 650161

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References

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Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System
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Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. J. Vis. Exp. (93), e52261, doi:10.3791/52261 (2014).More

Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. J. Vis. Exp. (93), e52261, doi:10.3791/52261 (2014).

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