Abstract
Estudos de doenças respiratórias envolvem tipicamente a utilização de sistemas de modelos murinos como substitutos. No entanto, existem diferenças fisiológicas significativas entre os sistemas respiratório humano e murino, especialmente em suas vias respiratórias superiores (URT). Nalguns modelos, estas diferenças na cavidade nasal de murino podem ter um impacto significativo sobre a progressão da doença e na apresentação do trato respiratório inferior (LRT) quando se utiliza técnicas de instilação intranasal, limitando potencialmente a utilidade do modelo de rato para estudar estas doenças. Por estas razões, seria vantajoso desenvolver uma técnica para instilar bactérias directamente para os pulmões do rato, a fim de estudar a doença de LRT na ausência de envolvimento do TRS. Temos chamado este específico intratraqueal técnica entrega intubação mediada (IMIT) instilação de pulmão. Esta técnica não invasiva minimiza o potencial para a instilação para a corrente sanguínea, o que pode ocorrer durante traditi mais invasivaonal abordagens cirúrgicas intratraqueais infecção, e limita a possibilidade de entrega do aparelho digestivo incidental. IMIT é um processo de duas etapas em que ratinhos são entubados em primeiro lugar, com um passo intermédio para assegurar a colocação correcta do cateter para dentro da traqueia, seguido da inserção de uma agulha romba para dentro do cateter para mediar a entrega directa das bactérias para o pulmão. Esta abordagem facilita uma eficácia de> 98% de entrega para os pulmões com uma excelente distribuição de reagente ao longo pulmão. Assim, IMIT representa uma nova abordagem para estudar a doença de LRT e entrega terapêutica directamente no pulmão, após a melhorar a capacidade de usar ratos como substitutos para estudar a doença respiratória humana. Além disso, a precisão e reprodutibilidade deste sistema de entrega também faz com que seja passível de Boas Práticas de Laboratório (BPL) Normas, bem como a entrega de uma ampla gama de reagentes que requerem a entrega de alta eficiência para o pulmão.
Introduction
Os ratinhos foram usados para modelar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo uma miríade de doenças respiratórias. Modelos de doenças substitutos são frequentemente incapazes de recapitular todos os aspectos de uma doença modelado, normalmente devido a diferenças fisiológicas importantes ou imunes nos dois modelos de acolhimento. Assim, o objetivo de melhorar os sistemas de modelos é desenvolver abordagens que permitem substitutos para espelhar mais de perto um processo de doença ou resposta do hospedeiro, como observado no sistema host original. Existem várias diferenças fisiológicas principais entre os ratos e os seres humanos no mecanismo pelo qual eles inspirar ar. Incluídos nestes diferenças são diferenças raciométrica significativas de tamanho entre a URT e LRT. Estimou-se que os ratos possuem> 100 vezes a área de superfície TRS relação aos seres humanos, normalizados contra 1,2 capacidade pulmonar total. Assim, os cornetos nasais do mouse permitem mais ampla filtragem do ar inspirado para facilitar uma maior taxa de breathing, o que pode ter um impacto significativo sobre os estudos de pneumonia se a infecção da cavidade nasal desempenha um papel significativo na progressão da doença.
Várias abordagens diferentes têm sido empregues para incutir bactérias nos pulmões de ratos para estudar a doença respiratória semelhante à humana. A mais comum destas abordagens é a inoculação intranasal, no qual uma suspensão líquida é aplicada em uma ou ambas as narinas de um rato. Embora relativamente simples, advertências como volume instilação e tipo de anestesia utilizada pode afetar a eficiência da instilação no LRT via intranasal inoculação 3-5. Especificamente, Miller et al. demonstraram que a instilação intranasal de Francisella tularensis em volumes de menos de 50 ul não resultou em instilação das bactérias no LRT 6. Eles observaram ainda melhor LRT instilação ao usar isoforane ao contrário de injetado cetamina / xilazina para anestesia. No entanto, o nosso experience com Yersinia pestis inoculação intranasal indica a inoculação mais consistente pode ser conseguida utilizando cetamina / xilazina, em comparação com isoflurano (MBL, dados não publicados). Estas diferenças podem ser atribuídas ao patógeno utilizado ou à variação nos procedimentos de laboratório, mas importante destacar a variabilidade potencial desta técnica. Além disso, os pulmões colhidos logo após a instilação intranasal mostram que uma percentagem relativamente baixa do inoculo bacteriano inicial atinge o pulmão (no caso de Y. pestis, apenas 10% foram recuperados 1 h após a instilação 7), sugerindo que um grande número de bactérias pode ser retida no TRS (ou engolido no tracto GI). Em certos modelos de doenças, esta deposição significativa de bactérias na mucosa URT pode confundir o nosso entendimento da progressão da doença, se o organismo é capaz de colonizar a cavidade nasal murino de forma incompatível com a doença humana. Por exemplo, usando in vivo </ Em> imagiologia, tem-se observado que Burkholderia pseudomallei, que não colonizar o TRS humano, provoca uma infecção oportunista esmagadora da cavidade nasal de murino quando entregue pelo método de instilação intranasal 8.
Outros métodos de instilação de bactérias nos pulmões de ratos também foram empregues na pesquisa de doenças infecciosas. No entanto, em comparação com instilação intranasal estes métodos tendem a exigir mais conhecimentos técnicos e / ou equipamentos caros, sem eliminar o potencial de iniciação infecção em vários locais (por exemplo, aerosol [URT e LRT]; transoral [trato digestivo e LRT]; e intratraqueal cirúrgico [LRT e sangue]). Dadas as potenciais complicações que poderiam estar associados com sites secundários de infecção, buscou-se desenvolver uma abordagem intratraqueal que ignora a URT e entrega patógeno diretamente para os pulmões de ratos anestesiados, mas também limita inoculat inadvertidaíon na corrente sanguínea ou do trato gastrointestinal. Para este fim, intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação foi desenvolvido como um procedimento não-cirúrgico que garante LRT instilação de inoculo por inclusão de um passo intermediário para verificar a colocação do cateter adequado antes da instilação. Este método é descrito usando corante de instilação para demonstrar visualmente ampla distribuição do inoculo em todo o pulmão, e P. aeruginosa instilação para demonstrar a entrega altamente eficaz (> 98% do inoculo) do presente método para o pulmão. É importante ressaltar que, enquanto originalmente desenvolvido para entrega bacteriana, IMIT também oferece uma ferramenta eficaz para: i) a instilação de várias moléculas para o estudo de outros modelos de doenças respiratórias, ii) a entrega terapêutica específica do pulmão, e iii) os estudos de função pulmonar de base, incluindo alvo siRNA entrega ao pulmão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20 G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250 ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22 G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
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