Summary
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.
Introduction
Souches pluripotentes (iPS) induites sont un type de cellules souches pluripotentes dérivées par la reprogrammation des cellules adultes avec des facteurs extrinsèques 1. En revanche, les cellules souches embryonnaires (CSE), un autre type de cellules souches pluripotentes, sont générés à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste 3.2. Malgré leurs origines différentes, les cellules iPS et les CES sont comparables dans leur capacité illimitée de reproduire in vitro et dans leur capacité à se différencier en tout type de cellule 4-5. Ces caractéristiques de cellules iPS en font des candidats idéaux pour des applications en médecine régénérative personnalisée. Récents efforts de recherche sont axées sur l'élaboration de protocoles de différenciation robustes pour produire des cellules adultes spécialisées, y compris épithélium pigmentaire rétinien (EPR) 6-11.
Pour les applications cliniques potentielles de cellules iPS dérivées, une différenciation dirigée pour ce type de cellule spécifique est indispensable. Il existe différentes méthodespublié pour la différenciation dirigée des deux cellules iPS en CES et RPE qui varie grandement dans leur efficacité 6-7, 12-16. Nous ne savons pas encore beaucoup d'événements moléculaires qui régissent le sort de cellules / tissus au cours du développement ou de la différenciation. Au cours des dernières années, des efforts ont été faits pour développer le protocole de différenciation qui peut imiter le développement embryonnaire dans la mesure du possible. Pendant la phase de blastocyste, non engagé population de cellules souches sont ensemble dans un micro-environnement en trois dimensions. Ainsi, diverses stratégies ont été appliquées pour rendre les cellules ESC / iPS assemblés et les cultiver en trois dimensions. Ces agrégats de cellules souches sont appelées corps embryoïdes (EBS). Des études ont montré que la différenciation EB de cellules souches imiter stade précoce du développement embryonnaire et peut spontanément donner lieu à endoderme primitif sur sa surface extérieure. Plus tard, le développement EB progresse, les phénotypes de cellules différenciées de tous les trois lignées germinales apparaissent 17-18. Therefore, protocoles de différenciation basée EBS ont attiré beaucoup d'attention à la différenciation in vitro de cellules ESC / iPS et sont un bon candidat pour la production de l'EPR à partir de cellules souches pluripotentes 13.
EB peuvent être faites en utilisant plusieurs méthodes à partir de cellules / iPS ESC. Initialement, EB ont été faites par raclage des colonies adhérentes et les maintenir dans une culture en suspension non adhérent. Cependant, cette approche donne population hétérogène de EB qui entraîne une faible reproductibilité. Hanging culture cellulaire de chute et micropuits formation EB base existe d'autres techniques populaires pour la formation EB qui donnent EB homogènes de tailles définies qui sont hautement reproductible. En outre, la technique de microtitration peut produire un grand nombre d'agrégats avec moins d'effort.
Différenciation des cellules à l'intérieur EB est régulée par un multiplex de signaux morphogéniques de l'microenvironnement extracellulaire et intracellulaire. Contrairement à la différenciation dans un LUN.Format olayer, EBS fournir une plate-forme pour l'assemblage complexe de cellules et de signalisation intercellulaire de se produire 17. Fait intéressant, le nombre de cellules souches pluripotentes utilisés pour fabriquer EB individuels a été observée pour influencer le destin des cellules. Par exemple, dans une étude de la différenciation hématopoïétique des CES humains, il a été observé que 500 cellules EB une différenciation vers la lignée myéloïde des cellules alors que 1000 EB poussé vers lignée érythroïde 20. Dans une autre étude, les petites EB favorisé la différenciation de l'endoderme alors que les grandes EB promus vers la différenciation neuro-ectoderme 11, 17.
Ces études antérieures suggèrent fortement que le nombre de cellules ESC / iPS utilisés pour fabriquer EB individuels affecte les EB différenciation en fonction de tous les types de cellules. Cependant, à notre connaissance, il ne existe pas d'études actuelles qui ont élucidé l'impact de la taille EB dans sa propension à se différencier vers RPE. Le but de cette étude est de caractériser l'influence deEB taille sur souches pluripotentes induites (iPS) - l'épithélium pigmentaire rétinien (iPS-RPE) différenciation et d'identifier le nombre de cellules optimale pour faire EBS pour la différenciation dirigée vers RPE lignée.
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Protocol
1. Préparation des réactifs culture et la culture Plaques
- Préparer milieu de culture cellulaire de la tige sans alimentation par addition de 100 ml de supplément gratuit de sérum 5x à 400 ml de cellules souches milieu de base. Le milieu est stable à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois.
- Ajouter 10 uM solution de rho-associée, à enroulement en spirale contenant la protéine kinase (Rock) inhibiteur disponible dans le commerce corps embryoïdes (EB) support de formation (Y-27362).
- Préparer un milieu de différenciation par addition de 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 10% de remplacement de sérum KO (KSR) et 10 ug / ml de gentamicine pour Modified Eagle Medium l'Mélange / nutritive de Dulbecco F-12 (DMEM / F12).
- Préparer milieu iPS-RPE en ajoutant 1x N1 supplément, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, 13 ng sel de sodium / ml de triiodo-L-thyronine, de 20 ng / ml d'hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine et 15% de sérum bovin fœtal (FBS) <sup> 21 à milieu essentiel minimum de Eagle (MEM). Ajuster le pH à 7,4.
- Préparer le sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Dissoudre 1 mg de sel de sodium triiodo-L-thyronine à 1 N d'hydroxyde de sodium en remuant doucement. Ajouter 49 ml de MEM pour faire 50 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans du milieu de culture final.
- Préparer hydrocortisone solution stock. Solubiliser 1 mg d'hydrocortisone dans 1 ml d'éthanol 100% par agitation douce. Ajouter 19 ml de MEM pour faire 20 ml de 50 pg / ml de solution d'hydrocortisone stock. Aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final.
- Préparer une solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans du DMEM / F12.
- Préparation de plaques de matrice revêtu
- Préparer matrice de protéine extraite de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellules de sarcome soi dans DMEM / F12 à 0,08 mg / ml. Manteau de chaque puits d'une plaque à 6 puits avec 1 ml de la solution de la matrice. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1 heure.
- Après l'incubation de 1 h, aspirer l'excédent DMEM / F12. Ajouter 0,5 ml de souches milieu de culture cellulaire dépourvu d'alimentation-pour éviter le dessèchement des puits. Les plaques de matrice revêtu sont prêts à l'emploi.
- Préparer des plaques de microtitration, en rinçant chaque puits avec 2 ml de DMEM / F12. Retirer DMEM / F12 et ajouter 0,5 ml de milieu de formation EB complété avec un inhibiteur de rock à chaque puits. Centrifuger la plaque à 2000 g pendant 5 min pour éliminer les bulles d'air.
- Préparer du tampon de coloration FACS en mélangeant 2% de FBS et 0,09% d'azide de sodium dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajuster le tampon à pH 7,4.
- Préparer la solution de neutralisation de la trypsine par addition de 10% de FBS DMEM / F12.
2. iPS Culture
- Avant iPS cellules ensemencement, chaleureux souches milieu de culture cellulaire dépourvu d'alimentation à 37 ° C, et ont la matrix plaques enduites de prêt.
- Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-1 dans un bain d'eau à 37 C °. Ensuite, retirez le cryo-flacon du bain d'eau et essuyez le flacon avec 70% d'éthanol. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agglomérats de cellules.
- Ajouter 5 ml de milieu de culture chaude cellules souches sans alimentation à cellules goutte à goutte et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension attentivement les amas de cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire de la tige sans chargeur-et épépiner les amas de cellules dans les puits de la plaque de matrice revêtu. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d'humidité.
- Changer le milieu de culture de cellules iPS quotidienne. Observez colonies indifférenciées de cinq à sept jours après l'ensemencement. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense) sous un microscope optique.
3. Le repiquage des cellules iPS
- Au passage les cellules iPS Avant de commencer, réchauffer la solution de dispase, DMEM / F12 et la tige milieu de culture cellulaire dépourvu d'alimentation à 37 ° C au bain-marie.
- Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et en aspirant le milieu. Rincer soigneusement les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12.
- Ajouter 1 ml de 1 mg / ml de dispase à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer le dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM / F12 deux fois. Après rinçage, ajouter 2 ml de milieu de culture de cellules souches des liaisons de connexion dans chaque puits.
- L'utilisation d'une pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des amas de cellules. Transférer les amas de cellules individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter souches milieu de culture cellulaire dépourvu de chargeur-suffisante pour ensemencer le prochain passage de cellules.
4. Génération d'EBS Utilisation Micropuits Plaques
- Préparation d'une suspension cellulaire unique de cellules iPS
- Retirez le medium à partir des cellules iPS et rincer les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12. Ajouter 750 pi de Accutase à cellules iPS à chaque puits de la plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque (environ 5 à 10 min).
- Utiliser une pipette pour dissocier doucement toutes les cellules restantes et à détacher les cellules restant sur la surface de la plaque. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml. Rincer la plaque avec 5 ml de DMEM / F12 et combiner le DMEM / F12 avec rincé les cellules dans le tube conique. Faire passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour éliminer les grumeaux de cellules résiduelles possibles.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante pour enlever le Accutase. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de formation EB sorte que la concentration en cellules est d'environ 0,5 à 1,0 x 10 7 cellules / ml.
- Déterminer le nombre de cellules viables par comptage des cellules avec du bleu trypan et un hémocytomètre.
- Adjustindensité cellulaire g dans des micropuits pour former EB grandeur contrôlée
- Ajuster le nombre de cellules dans chaque puits de la plaque à micropuits pour générer les tailles désirées EB. Ajouter des cellules dans les puits des plaques préparées à l'étape 1.9, Répartir les cellules par pipetage doucement les cellules à plusieurs reprises.
NOTE: Nombre de cellules nécessaires par puits = désiré nombre de cellules par EB x nombre de micropuits par puits. - Réglez le support de formation EB complété avec un inhibiteur de rock dans les puits à un volume final de 2,0 ml. Redistribuer les cellules par pipetage doucement chaque puits. Centrifuger les microplaques à 100 g pendant 3 min. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d'humidité pendant 24 heures.
- Ajuster le nombre de cellules dans chaque puits de la plaque à micropuits pour générer les tailles désirées EB. Ajouter des cellules dans les puits des plaques préparées à l'étape 1.9, Répartir les cellules par pipetage doucement les cellules à plusieurs reprises.
- EB de récolte des microplaques
- Récolte EB de micropuits par pipetage milieu des puits de haut en bas avec une micropipette 1 ml pour éliminer la plupart des EBS. Passez la suspension EB à travers une cellule de 40 um inversépassoire sur le dessus d'un tube conique de 50 ml, pour éliminer les cellules simples.
- Laver la microplaque cinq fois avec 1 ml de DMEM / F12 pour supprimer tous les EBS. Recueillir lavages et passez le tamis cellulaire inversée. Tournez le tamis cellulaire droite jusqu'à un nouveau 50 ml tube conique. Recueillir les EB par lavage avec un milieu de formation EB. Comptez EBS pour déterminer le rendement.
5. Placage EB et différenciation Initier
- EBS sur les plaques à matrice protéique revêtu des plaques six puits (comme à l'étape 1.8.1) à une densité de <1000 EB / puits dans du milieu de formation EB inhibiteur de roche, plus de 10 uM. Incuber les EB à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d'humidité pendant 24 heures.
- 24 heures après EB placage, remplacer par un milieu de différenciation pour initier la différenciation. Changer la moitié du milieu de différenciation tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules sont collectées pour analyse ultérieure.
- Prélever des échantillons à jour 6, 17, 29 et 60 à faire RT-PCR, immunocytochemistry et FACS pour valider l'expression des gènes et des protéines caractéristiques de l'EPR.
6. Extraction de l'ARN et PCR
- Extraire l'ARN à partir des échantillons EB selon les instructions fournies dans le kit disponible dans le commerce. Déterminer la concentration de l'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
- Effectuer transcription inverse sur 100 ng d'ARN total selon l'ARN disponible dans le commerce à l'ADNc kit de transcription inverse.
- Effectuer la PCR avec 10 ng d'ADNc en utilisant les amorces suivantes (tableau 1) à une concentration de 10 umol / 10 ng d'ADNc. Régler la PCR comme suit: dénaturation de l'ADN à 95 ° C pendant 5 min, 35 cycles avec amplifier à 95 ° C pendant 15 sec, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 1 min, suivi d'un cycle final à 72 ° C pendant 10 min. Exécuter le produit de PCR sur un gel d'agarose à 1%.
7. Immunocytochimie
- Laver les EB avec du PBS deux fois à la température ambiante. Fixer les EBS RT chez 4% paraformaldehyde pendant 10 min. Rincer une fois avec PBS à température ambiante. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu'à utilisés pour la coloration.
- Le jour coloration, traiter les cellules fixes avec fixation et perméabilisation réactifs. Incuber les échantillons avec une solution de blocage (sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation) pendant 1 heure à température ambiante.
- Effectuer immunochimie dans du sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation en utilisant les anticorps primaires suivants aux dilutions indiquées: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), et anti- ZO1 (1: 100). Incuber les échantillons avec des anticorps O / N correspondant à 4 ° C.
- Le lendemain, retirez l'anticorps primaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois avec PBS. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore pendant 1 heure à température ambiante.
- Retirer l'anticorps secondaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois dans du PBS. Montez le couvercle glisse sur des lames de verre avec du DAPI contenant un milieu de montage et permettent de mettre en échantillons O / N dans une chambre sombre.Utilisation d'un microscope à fluorescence pour visualiser la coloration.
8. coloration pour l'analyse FACS
- Laver les EB cultivées en PBS deux fois. Incuber les EB avec 0,5 ml de trypsine à 0,25% pendant 5-10 min pour obtenir une suspension cellulaire unique. Neutraliser la trypsine avec une solution de neutralisation de la trypsine (1 ml / puits).
- Transférer la suspension cellulaire unique dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 600 g pendant 10 min.
- Jeter le surnageant et ajouter 10 ml de DMEM / F12 pour les cellules dans le tube. Inverser doucement pour mélanger les cellules. Centrifugeuse à 600 x g. Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS.
- Comptez le nombre total de cellules. Centrifuger à 600 g pendant 10 min. Après centrifugation Rejeter le surnageant. Fixer les cellules immédiatement en ajoutant 0,5 ml de paraformaldéhyde 4%. Mélangez bien au vortex douce. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 20 min.
- Centrifuger à 600 g pendant 10 min et retirez lasurnageant. Vortex doucement à perturber le culot cellulaire. Perméabiliser les cellules en ajoutant 1 ml de solution de perméabilisation refroidi. Vortex légèrement pour bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Centrifuger à 600 g pendant 10 min et éliminer le surnageant. Ajouter 3 ml de FACS tampon de coloration et remettre en suspension. Répétez cette étape pour une fois de plus. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml.
- Transférer 100 pl de la suspension de cellules (0,5 x 10 6 cellules) à chacun des tubes de microcentrifugation et ajouter le volume recommandé de l'anticorps primaire. Pour Pax6, ajouter 5 ul de PE anti-Pax6 dans 100 ul de suspension cellulaire. Pour MITF, ajouter 5 ul d'anti-MITF dans 100 ul de suspension cellulaire.
- Mélanger et incuber à température ambiante pendant 60 min. Ajouter 3 ml de tampon de coloration FACS. Mélanger et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et répéter 8,16 pour deux fois supplémentaires.
- Pour MITF coloration, incuber les cellules dans Antibo secondairedy, de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 à une dilution de 1: 2000 pendant 1 heure à 4 ° C. Pour Pax6 coloration, éviter cette étape.
- Laver les cellules avec 5 ml de tampon de coloration FACS et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Répétez le processus pour deux fois plus.
- Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de coloration FACS et vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire. Les échantillons sont prêts pour l'analyse par cytométrie en flux.
9. iPS-RPE Isolement et culture
- Au jour 29, couper soigneusement autour des colonies pigmentées sélectionnés de la plaque de culture à l'aide d'une pipette de 200 pi. Transférer les colonies flottantes dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les colonies à 600 g pendant 10 min à température ambiante et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension les colonies de cellules dans 10 ml de DMEM / F12 et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Eliminer le surnageant.
- Préparer une suspension de cellules uniques en faisant incuber les colonies avec 2 ml de trypsine à 0,25% à 37 ° C pendant 7-10 min. Vortexer doucement la suspension de cellules de dissocier les colonies.
- Neutraliser le trypsine en ajoutant 2 ml de milieu iPS-RPE. Centrifuger à 600 g pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules individuelles dans 2 ml de milieu iPS-RPE. Transférer les cellules dans une matrice protéique recouvert de plaque à 6 puits et placer dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité.
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Representative Results
Dans cette expérience, les cellules iPS ont été cultivées et différenciées dans la lignée de l'EPR d'EBS. EbS de tailles contrôlées ont été formés en utilisant des plaques micropuits. Comme on le voit sur la figure 1 la formation EB était homogène dans les plaques de microtitration. Ces EB ont ensuite été recueillies et étalées sur des plaques à 6 puits (figure 2).
RPE peuvent être identifiées par leur morphologie hexagonale classique, la pigmentation, et l'expression de marqueurs de RPE. Après 12 semaines de culture, les 200 cellules EB avait développé astrocytes et la morphologie des fibroblastes. Aucune pigmentation a été observée dans ces cellules (figure 3A). Agrandir EB ont développé une monocouche de morphologie RPE classique et la pigmentation (figure 3B et C) immunocytochimie pour détecter les marqueurs RPE, MITF et ZO1 révélé co-expression de ces protéines qui ont été dérivées à partir de 500 cellules et 3000 cellules EB (Figure 4) .
Expressions du champ visuel et les gènes RPE ont été contrôlées par PCR. La figure 5 montre le profil d'expression génique de neuroectodermique, des précurseurs de champ visuel, et des marqueurs RPE dans différentes tailles d'EBS. Surtout, le marqueur spécifique de l'EPR, RPE65 a été détectée à partir de 17 jours.
Pour quantifier le rendement en cellules qui avaient différenciées en RPE lignée, une analyse FACS a été effectuée pour détecter les précurseurs et neuroectodermiques RPE marqueurs, PAX6 et MITF respectivement. La figure 6A montre marqueur neuroectodermique PAX6 dans différentes tailles de EB à différents points dans le temps. Environ 50% des cellules analysées étaient positifs pour Pax6 le jour 6 de la culture dans les EB-3000 cellules. En outre, une analyse FACS de RPE terrain, MITF de tailles variées EB a révélé que 20% des cellules MITF exprimé par jour 60 de la différenciation.
Cultured RPE sont également caractérisées par leur capacité à perdre leur pigment et la morphologie polygonale et obtenir unfibroblastes phénotype sur des passages. Par conséquent, pour déterminer si les iPS dérivées RPE possèdent ces caractéristiques, nous mécaniquement isolées et des passages les cellules. La figure 7A montre les cellules nouvellement à des passages ont perdu pigment et gagné la morphologie des fibroblastes. En outre, ces cellules ont proliféré et ont regagné la morphologie polygonale classique sur confluent (Figure 7B). En quelques semaines, ces cellules ont retrouvé leur pigmentation (Figure 7C).
| Gène | Référence NICB | Séquence (5'-3 ') | Taille (pb) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | Fa | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | Fa | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | Fa | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | Fa | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | Fa | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCACCCACCCTGTTG CTGTA |
Tableau 1. séquences d'amorces PCR pour les gènes Pax6, RPE65, RX, MITF et GAPDH.
Figure 1. Formation d'EBS avec microplaques. Chaque micropuits contient (A) 100 cellules, (B) 200 cellules, (C) 500 cellules, et (D) 3000 cellules. Les cellules ont été incubées 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 pour la formation d'EBS. (Grossissement 100X, barre d'échelle = 400 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. EB récoltées à partir de microplaques. (A) 200 cellules EB, (B) 500 cellules EB, (C) 3000 cellules EB, et (D) 15 000 cellules EB. (Grossissement 200X, barre d'échelle = 200 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. iPS dérivées RPE de différentes tailles d'EBS. EB ont été cultivées pendant 12 semaines. (A) 200 cellules EB ne avait astrocytes et la morphologie des fibroblastes sans pigmentation développé; tandis que 80% - 90% des cellules dans les cellules EB-500 (B et C) a développé une monocouche de cellules pigmentées polygonales. (A & B: grossissement 100X, barre d'échelle= 400 um; (C):. Grossissement 200X, barre d'échelle = 200 de um) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Co-expression de MITF et ZO1. 500 et 3000 cellules EB exprimé MITF et ZO1 après 17 jours de différenciation. (Grossissement 400X, barre d'échelle = 20 mm). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Profil d'expression génétique de différentes tailles de EB à différents points de temps de différenciation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. FACS analyse de la taille EB varié pour la différenciation des RPE. (A) FACS données de marqueur de neuroectodermique PAX6 dans différentes tailles d'EBS cours de la différenciation. (B) d'analyse FACS de marqueur de RPE MiTF sur la taille EB variés au jour 60 de la différenciation. Le plus haut niveau de MITF a atteint 20% et a été constante entre la taille EB de 500, 3000 et 15 000 cellules.
Figure 7. Suite culture de RPE isolé manuellement. (A) a été repiquée RPE et a acquis fibroblastes morpholoGY après passage. (B & C) Les cellules développées morphologie polygonale et la pigmentation au fil du temps. (Grossissement 100X, barre d'échelle = 400 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour réaliser pleinement les promesses des cellules souches pluripotentes pour la thérapie cellulaire, il est nécessaire de réglementer leur différenciation d'une manière cohérente et reproductible. Ce rapport décrit les protocoles pour former EB grandeur contrôlée en utilisant la technologie de la plaque micropuits, engager la différenciation vers EPR et identifier des marqueurs de protéines et de gènes de RPE. Pour synchroniser la différenciation in vitro, tailles homogènes d'EBS ont été formés par un nombre connu de cellules iPS centrifugés dans des plaques de micropuits par agrégation forcé. Immunocytochimie et transcription inverse réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR) sont utilisés pour surveiller les protéines expressions de l'EPR et de gènes expliquées. Enfin, l'efficacité de la différenciation de différentes tailles d'EBS a été analysé par analyse FACS. Ces techniques peuvent faciliter la différenciation des cellules iPS en RPE pour les applications futures.
Il ya plusieurs points cruciaux dans cette méthode qui doit être soigneusement exécutées à l'eNsure le succès de ce protocole et la réalisation des données précises. La première étape clé se produit pendant la culture des cellules iPS. cellules iPS doivent être maintenus dans un état pluripotent de maintenir leur caractère souche. Les cellules doivent avoir changé le milieu tous les jours afin de maintenir des niveaux appropriés de bFGF et être soigneusement inspectés quotidiennement pour des signes de différenciation. Cellules iPS indifférenciées poussent comme des colonies multicellulaires compactes. Les cellules doivent avoir une haute nucléaire ratio de cytoplasme et nucléoles proéminents. Les colonies iPS sont caractérisés par une frontière distincte, avec plusieurs couches de cellules au centre. Les signes de différenciation comprennent la perte de frontières définies de colonies, la morphologie cellulaire non-uniforme, et l'apparition de types de cellules évidentes, telles que les neurones et les fibroblastes. Les cellules individuelles qui se sont différenciés peut être éliminé par rinçage et la dispase, cependant, les colonies présentant ces caractéristiques doivent être retirées manuellement à partir de la culture 22. Préparation d'une seule cellule iPS suspension for la formation de la EB est la prochaine étape critique. Il est important de préparer une suspension sans agrégats cellulaires afin de délivrer de façon précise le nombre désiré de cellules de la plaque de micropuits et préparer la taille désirée EB. préparations d'ARN pour l'analyse par PCR sont également importants. Incompatible qualité de l'ARN est une source importante de la variabilité dans les données PCR. extraction de l'ARN doit céder peu dégradé ARN pour de meilleurs résultats. Extraction de l'ARN réussie donnera ARN total avec une dégradation minimale et libre de tout contaminant RNases. Après détermination de la concentration d'ARN par spectrophotométrie à 260 nm, la pureté de l'échantillon doit être déterminée à 230 et 280 nm pour détecter la contamination avec des polysaccharides ou des protéines. Le 230: 260: 280 pour l'ARN rapport doit être de 1: 2: 1 pour indiquer l'ARN de haute qualité, sans contamination 23. Enfin, il est important de fixer correctement les cellules pendant coloration FACS. Au cours de cette étape de fixation, les cellules doivent être séparées pour éviter l'agglutination. Insufficient remise en suspension cellulaire avant perméabilisation conduira à l'agglutination des cellules et la coloration inexacte.
Nous recommandons que le protocole soit suivi comme décrit cependant quelques modifications peuvent être apportées si nécessaire. Lors de la génération d'EBS décrit dans l'étape 4, le nombre de cellules par EB peut être comprise entre 500 et 3000 pour obtenir un rendement élevé de cellules différenciées en RPE. Si le nombre de cellules iPS est limité, EB-500 cellules RPE produiront comparables aux cellules EB-3000. Un soin particulier doit être pris au cours du processus d'extraction d'ARN décrit à l'étape 6. Les échantillons doivent être exécutés en trois exemplaires à veiller à ce que l'ARN de haute qualité peut être acquise. Pendant immunocytochimie comme décrit dans l'étape 7, les concentrations d'anticorps primaire et secondaire peuvent être ajustés si nécessaire pour améliorer l'intensité du signal et réduire arrière-plan. Les témoins positifs et négatifs appropriés doivent être inclus dans l'essai. Au cours de l'étape 8, analyse FACS, si les résultats escomptés ne sont pas ACQuired après coloration, un petit échantillon de cellules colorées peut être placé sur une lame et est affiché par un microscope pour visualiser la coloration. Les témoins positifs et négatifs appropriés doivent être inclus dans l'essai. Si les cellules ne sont pas colorées comme prévu, les concentrations d'anticorps peuvent être augmentés ou réduits selon les besoins.
La technique décrite dans le présent rapport se traduira par un rendement plus élevé de l'EPR de différenciation spontanée, sans l'utilisation de produits chimiques ajoutés. Cependant, la principale limitation de cette approche est qu'il y aura également un grand nombre de cellules non-RPE générés. Par conséquent, l'EPR doit être soigneusement sélectionné sur et enrichi comme décrit à l'étape 9 pour assurer une population homogène.
L'importance de cette approche est qu'un rendement plus élevé en RPE peut être dérivée à partir de cellules iPS que les techniques de différenciation spontanées. L'utilisation de petites molécules pour dériver à partir de RPE iPS a également été rapportée pour donner un rendement élevé dedes cellules différenciées, cependant, cette technique est beaucoup plus complexe et nécessite la synchronisation et la concentration des petites molécules à être optimisée pour atteindre les résultats souhaités 7,10. En outre, les petites molécules utilisés dans ces méthodes ont des effets pléiotropiques qui peut fausser les résultats.
Le procédé décrit peut être utilisé pour faire EbS de dimensions souhaitées avec une reproductibilité élevée. Cette technique génère EB de tailles uniformes qui ont été utilisées pour optimiser la différenciation des cellules iPS vers la lignée RPE sans l'utilisation de produits chimiques supplémentaires. Les cellules iPS dérivées de RPE-EB peuvent ensuite être utilisés dans des études de transplantation pour confirmer leur intégration dans la rétine dans une organisation fonctionnelle. Ces cellules peuvent également fournir un modèle de recherche bon d'étudier la pathogenèse de diverses maladies de l'EPR in vitro. L'utilité de cette approche peut être appliquée à la différenciation dirigée dans de nombreux autres types de cellules, en fonction dela taille de l'EB et l'origine in vivo de la cellule dans le blastocyste. Les cellules de l'ectoderme donneront lieu à des neurones, l'épiderme, des cheveux et des cellules de la glande mammaire; endoderme donnera lieu à l'estomac, du colon, des poumons, et les cellules intestinales; mésoderme donnera lieu à des muscles squelettiques, le cœur, le rein et les cellules des tissus conjonctifs 3,11,19. Une fois la taille correcte EB a été déterminé, les cellules différenciées ne ont besoin que d'être analysés par immunocytochimie ou FACS pour l'expression correcte des protéines marqueurs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
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